יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

ניתן לטהר הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מיון תאים, באמצעות שילוב של צביעת מולקולת הידבקות תאי לויקוציטים מיטוכונדריאלית ופעילה (ALCAM, הידועה גם בשם CD166).

לתאי גזע עובריים אנושיים (ES) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יש יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית מבוססת תאים לטיפול באיברים חולים קשה בשל ההתרבות הבלתי מוגבלת שלהם ותכונותיהם הפלוריפוטנטיות. עם זאת, התמיינות תאי ES/iPS אנושיים לסוגי תאי מטרה טהורים ב-100% היא מאתגרת בשל רגישותם הגבוהה לסביבה. גידולים לאחר ההשתלה נגרמים על ידי תאים מזוהמים, מתרבים ובלתי ממוינים, מה שהופך את טכנולוגיית הטיהור הגבוהה לחיונית למימוש בטוח של רפואה רגנרטיבית. כדי להפחית את הסיכון לגידולים, פותחה טכנולוגיית טיהור גבוהה עבור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. השיטה משתמשת ב-FACS (מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) באמצעות שילוב של תכולת מיטוכונדריה גבוהה וסמן פני התא ALCAM (מולקולת היצמדות תאי לויקוציטים פעילים) ללא שינוי גנטי. 97% ± 0.38% (n = 5) מהפטוציטים המטוהרים בשיטה זו הציגו ביטוי חלבון אלבומין. מאמר זה נועד לספק נהלים מפורטים עבור שיטה זו, כפי שהיא מיושמת בשיטת ההתמיינות הדו-ממדית העדכנית ביותר עבור תאי iPS אנושיים להפטוציטים.

תאי גזע עובריים ופלוריפוטנטיים מושרים (ES ו- iPS, בהתאמה) נחשבים למקורות תאים מבטיחים לטיפולים רגנרטיביים. עם זאת, היעילות של התמיינות תאים אלה לסוגי תאי יעד ספציפיים יכולה להשתנות, גם כאשר משתמשים באותו קו תאים, פרוטוקול ונסיין 1,2,3,4. ניתן לייחס שונות זו לרגישות הגבוהה של תאי ES/iPS אנושיים לסביבתם. לכן, כיום קשה להשיג באופן עקבי תאי מטרה טהורים. כדי להשיג רפואה רגנרטיבית בטוחה ביותר, חיוני לחסל תאים מתרבים ותאי גזע לא ממוינים בתאים טיפוליים, וטכנולוגיית טיהור מתקדמת לתאי מטרה חיונית ^5,6,7.

ממיין תאים הוא מכשיר המנתח באופן מיידי תאים בודדים וממיין תאים חיים בעלי עניין בהתבסס על עוצמות האות הפלואורסצנטי, ומציע פתרון מבטיח. ניתן להשיג זאת באמצעות צביעת נוגדנים של סמנים ספציפיים לסוג התא או על ידי שימוש בביטויי גנים ספציפיים לסוג התא. באמצעות טכניקה זו, ישנם מספר דיווחים על שיטות לטיהור קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים ^8,9,10 והפטוציטים^11,12. Hattori et al. פיתחו שיטת טיהור מיטוכונדריאלית חדשנית באמצעות ממיין תאים¹³. תוך ניצול העובדה שלקרדיומיוציטים יש דרישות אנרגיה גבוהות באמצעות פעילות מיטוכונדריאלית, ניתן להשתמש בצביעת התאים בצבע המיטוכונדריה החי TMRM (טטרמתילרודאמין מתיל אסטר) כדי לתייג ולטהר מאוד קרדיומיוציטים על ידי FACS מגופי עוברים אנושיים שמקורם בתאי ES המכילים סוגי תאים שונים. היעדר הגידול אושר על ידי בדיקות היווצרות טרטומה עם קרדיומיוציטים מטוהרים. יתר על כן, ימאשיטה ועמיתיו גילו באופן בלתי צפוי שיטה לטיהור הפטוציטים מגופי עובר אנושיים שמקורם בתאי ES על ידי בידוד שברים בעלי פעילות מיטוכונדריאלית גבוהה וביטוי חיובי ALCAM¹⁴. הרציונל לשיטה זו הוא שלהפטוציטים יש גם מספר גבוה יחסית של מיטוכונדריה בשל הצריכה הגבוהה של ATP למטבוליזם תזונתי וניקוי רעלים¹⁵, והפטוציטים מבטאים ALCAM, חבר במשפחת האימונוגלובולינים, הממלא תפקיד בהידבקות תאים ונדידת¹⁶.

שיטות טיהור גבוהות קודמות עבור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים דרשו שינויים גנטיים, ושיטות טיהור לא גנטיות היו בעלות יעילות נמוכה¹⁷. השיטה המיטוכונדריאלית הלא גנטית היא בעלת ערך להשגת טוהר גבוה. כאשר יש צורך בתאי אב בכבד, ניתן לבחור בשיטות מבוססות CD133 ו- CD13 או Dlk1^18,19. למרות שהדיוק של טכנולוגיית עריכת הגנום התקדם, לא ניתן לבטל לחלוטין את הסיכון הפוטנציאלי לשינויים גנומיים בלתי צפויים (למשל, קרצינוגנזה). שיטות המבוססות על פעילות מיטוכונדריאלית, ללא שינוי גנטי, יכולות להיות חופשיות מסיכונים כאלה.

כתוצאה מבדיקת אינדיקטורים מיטוכונדריאליים שונים בקרדיומיוציטים של חולדות יילודים, TMRM נצפה נעלם לחלוטין תוך 24 שעות, בעוד שצבעים אחרים נשארו לפחות 5 ימים¹³. יתר על כן, חשוב לציין כי TMRM ו- JC-1 לא השפיעו על כדאיות התא כאשר הוערכו עם בדיקת 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), בעוד שצבעים אחרים הדגימו השפעות שונות על כדאיות התא¹³. TMRM מדגים בטיחות גבוהה יותר.

עד כה, פותחו מספר שיטות התמיינות דו-ממדיות (דו-ממדיות) כגישות יעילות יותר לגרימת התמיינות בהשוואה ליצירת גוף עוברי תלת-ממדי (תלת-ממדי). הסיבה לכך היא שתרכובות או ציטוקינים הגורמים להתמיינות באופן הדרגתי יכולים להינתן באופן אחיד לתאים במישור דו-ממדי, ולא במרחב תלת-ממדי. במחקר זה, שיטה²⁰ שדווחה בעבר שונתה כדי לגרום להתמיינות לתאי iPS אנושיים. כאן מתוארים פרטי ההליכים להתמיינות וטיהור דו-ממדיים עדכניים של הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים.

במחקר זה נעשה שימוש בתאי iPS אנושיים שהושגו באופן מסחרי (זן 253G1) (ראו טבלת חומרים).

1. תחזוקה של תאי iPS אנושיים

1. שמור על תאי iPS אנושיים בתנאים נטולי הזנה בתווך AK02 על צלחות תרבית מצופות 0.25 מיקרוגרם/ס"מ² iMatrix-511 (ראה טבלת חומרים).

2. התמיינות בכבד של תאי iPS אנושיים בתרביות דו-ממדיות

הערה: עיין באיור 1A עבור לוח הזמנים היומי של התמיינות הכבד. לאורך כל התהליך השתמשו בצלחות תרבית של 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של מדיום השטיפה או התרבית הייעודי לכל באר. שמור על מצב תרבית התאים ב 100% לחות, 5% CO₂, ו 20% O₂ ב 37 ° C.

1. מצפים כל באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של מטריצת קרום מרתף (מדולל 1/25 PBS (-)), ודגרים ב 37 ° C במשך 1 שעה.
2. מעבר תאי iPS אנושיים לצלחת המצופה בצפיפות של 20,000-30,000 תאים לסמ"ר באמצעות מדיום AK02N בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראה טבלת חומרים). החליפו את המדיום ללא Y-27632 למחרת ואת התרבית למשך יומיים נוספים.
3. לשטוף את התאים פעם אחת עם RPMI-1640 בינוני. התחל התמיינות אנדודרם על ידי החלפת המדיום עם RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 אינסולין + 1% דיפפטיד L-Alanyl-L-גלוטמין) בתוספת 3-6 מיקרומטר CHIR-99021 ו 100 ng / mL Activin A במשך 24 שעות (ראה טבלה של חומרים).
4. החלף את המדיום עם RPMI-B27-Glu בתוספת 50 ng/mL Activin A למשך 24 שעות.
5. כדי לגרום להבדיל אב כבד, להחליף את המדיום עם RPMI-B27-Glu בתוספת 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) במשך 5 ימים.
6. כדי לקדם את הבשלת הכבד, עבור למדיום הבשלת הפטוציטים: מדיום L-15 של לייבוביץ' המכיל 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט, 8.3% מרק טריפטוז פוספט, 100 ננומטר דקסמתזון (DEX), 50 מיקרוגרם/מ"ל נתרן-L-אסקורבט, 0.58% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 8.3% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר דיפפטיד L-Alanyl-L-גלוטמין, ו-100 ננומטר N-הקסנואית-נסה-איל-איל-(6)-אמינו הקסנואית אמיד (Dihexa) (ראה טבלת חומרים).
7. שנה את המדיום כל יומיים במשך 20 יום. מיין את התאים כ -27 ימים לאחר תחילת ההתמיינות.

3. הכנת תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים

1. לשטוף תאים ממוינים בכבד עם 2 מ"ל PBS (-) לכל באר.
2. הוסף תמיסת אנזים 1 מ"ל לכל באר, הכוללת 0.1% collagenase, 0.083% טריפסין, 10 μM מעכב ROCK (Y-27632), 20 ננומטר ciclosporin A ו- 50 μg/mL נתרן-L-אסקורבט במאגר המודעות (116 mM NaCl, 12.5 mM NaH₂PO₄, 20 mM HEPES, 5.4 mM KCl, 5.6 mM גלוקוז ו- 0.8 mM MgSO4; pH 7.35) (ראה טבלת חומרים). נתק תאים מהלוחות על ידי סיבוב אופקי ב 37 ° C במשך כ 2 שעות.
3. לאחר אישור כי התאים מנותקים ומעוגלים תחת מיקרוסקופ, לפזר אותם לתאים בודדים על ידי pipetting עדין, ולאסוף אותם בצינור 50 מ"ל.
4. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant באמצעות אספירטור.
5. לצבוע את המיטוכונדריה של התאים על ידי פיזורם ב 5 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 100 ננומטר TMRM (tetramethylrhodamine, אסטר מתל) (ראה טבלת חומרים). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C תוך הגנה מפני אור על ידי עטיפה ברדיד אלומיניום.
6. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant.
7. השהה מחדש את התאים עם 1-5 מ"ל של מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS.
8. ספור את מספר התא באמצעות תמיסה כחולה טריפאן 0.4% ולוח ספירת תאים.
9. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant.
10. לדלל נוגדן anti-ALCAM (נוגדן ראשוני, ראה טבלת חומרים) ביחס של 1:50 במאגר מודעות, ולהוסיף 100 μL של הנוגדן המדולל לכל 10⁶ תאים. מכתימים את התאים למשך 50 דקות על קרח. הכינו תאים שאינם מוכתמים בנוגדן הראשוני כבקרה שלילית.
11. שטפו את התאים עם מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS פעמיים.
12. יש לדלל חמור מסוג Alexa Fluor 488 Anti-Goat IgG (נוגדן משני, ראה טבלת חומרים) ביחס של 1:100 במאגר מודעות, ולהוסיף 100 μL של הנוגדן המדולל לכל 10⁶ תאים. מכתימים את התאים למשך 30 דקות על קרח. תאי צביעה שלא הוכתמו בנוגדן הראשוני באמצעות הנוגדן המשני.
13. שטפו את התאים עם מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS פעמיים.
14. השעה מחדש את התאים במאגר המודעות וסנן אותם דרך מסננת תאי מכסה הצמדה (רשת שינוי של 35 מיקרומטר) ממש לפני מיון לפי FACS כדי להסיר גושי תאים גדולים ולכלוך.

4. ניתוח FACS ומיון של תאי iPS אנושיים שמקורם בהפטוציטים

1. הגדר את התקן FACS למיון תאים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   הערה: השתמש בגודל זרבובית של 85 מיקרומטר או 100 מיקרומטר ובמסנן ND של 2.0 עבור הפטוציטים. השתמש בערוץ FITC לזיהוי קמח אלקסה 488 עבור ALCAM ובערוץ PE לזיהוי פלואורסצנטיות TMRM עבור מיטוכונדריה.
2. כוונן את מתחי FSC (פיזור קדימה) ו- SSC (פיזור צד) כדי להמחיש כראוי את אוכלוסיית התא.
3. התאם את המתחים של התעלות הפלואורסצנטיות FITC ו- PE. התחל עם תאים ללא תווית ומרכז את אוכלוסיית התאים בתחתית כל תרשים ערוץ. ודא שהתאים המסומנים מסומנים ממוקמים כראוי בתוך התווייה.
4. השתמש באסטרטגיית gating נפוצה כדי למנוע כפילויות: שער FSC-A העיקרי לעומת אוכלוסיית SSC-A (איור 2A), ואחריה אוכלוסיית FSC-H לעומת -W, ולאחר מכן SSC-H לעומת . -W (איור 2B,C).
5. שער את אוכלוסיית TMRM^hi ו-ALCAM⁺ (P2 באיור 2E) כדי למיין הפטוציטים. שער ^{את אוכלוסיית} TMRM^hi ו- ALCAM (P1 באיור 2E) כדי למיין שאינם הפטוציטים. לאסוף hepatocytes ממוין non-hepatocytes ב 15 מ"ל צינורות איסוף המכילים hepatocyte התבגרות בינוני.
6. צנטריפוגה צינור האיסוף המכיל את התאים ממוינים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C.
7. הסר את supernatant ו resuspend את התאים במדיום התבגרות hepatocyte.
8. זרעו את התאים על פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) שטופלו במיטומיצין C או מטריצת קרום מרתף דמוית ג'ל עם מדיום הבשלת הפטוציטים בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 ו-20 ננומטר ציקלוספורין A. תרבית את התאים באינקובטור CO₂ של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.

5. אימונוציטוכימיה לאיתור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים

1. לשטוף את התאים בתרבית במשך 5 ימים לאחר מיון עם PBS (-).
2. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. שטפו את התאים עם חיץ TBS-T (1x TBS עם 1% Tween 20) פעמיים כדי להסיר את הפרפורמלדהיד.
4. יש לדגור על התאים עם חיץ TBS-T מדולל של 0.1% Triton X-100 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שטפו את התאים עם חיץ TBS-T פעמיים כדי להסיר את Triton X-100.
6. הוסף פתרון חסימה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) לתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הוסף נוגדנים ראשוניים נגד אלבומין (סמן הפטוציטים) ואנטיגן גרעיני אנושי (hNA, ראה טבלת חומרים), מדולל 1:50 בתמיסת חסימה.
8. לדגור על התאים ב 4 ° C במשך הלילה. שטפו את התאים עם מאגר TBS-T פעמיים.
9. הוסף נוגדנים משניים: Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG ו- Alexa Fluor 546 חמור נגד עכבר IgG, מדולל 1:100 בתמיסת חסימה (ראה טבלת חומרים).
10. דוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את התאים עם מאגר TBS-T פעמיים.
11. הערך את טוהר הכבד על ידי ספירת תאים חיוביים לאלבומין ו- hNA חיוביים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשב את אחוז התאים החיוביים לאלבומין לכל תא חיובי ל-hNA עבור אוכלוסיות P1 ו-P2.

ציר הזמן של התהליכים שגורמים לתאי iPS אנושיים להתמיין להפטוציטים באמצעות תרבית דו-ממדית (איור 1A) ותכונות תאים מייצגות (איור 1B) מוצגים. בערך ביום ההתמיינות ה-12 החלו התאים להציג צורות תאים מצולעים וגרעינים עגולים, האופייניים להפטוציטים. חלק מהפטוציטים הציגו גם ריבוי גרעינים.

ניתוח FACS בוצע באמצעות התאים ביום ההתמיינות 27. כדי לזהות את אוכלוסיית ^ALCAM+, תרשימים השוואתיים עם ובלי נוגדן האנטי-ALCAM הראשון מוצגים באיור 2D,E, בהתאמה. גרימת התמיינות כבד באמצעות תרבית דו-ממדית, אוכלוסיית הפטוציטים (P2) נמצאה 10.1% בניסוי זה, המייצג עלייה משמעותית מ-0.8% (נתונים לא מוצגים) שנמצאו בשיטת היווצרות הגוף העוברי התלת-ממדי.

תאי P1 ו-P2 שמוינו גודלו בתרבית על פיברובלסטים עובריים של עכברים שטופלו במיטומיצין C. תאי P2 הציגו היווצרות מושבה קומפקטית וכדורית, ואילו תאי P1 פוזרו והיו בעלי מורפולוגיה שטוחה יותר. צביעה אימונוהיסטוכימית עבור אנטיגן גרעיני אנושי (hNA) ואלבומין אישרה את העשרת התאים דמויי הפטוציטים ב-P2, כפי שמתואר באיור 3. כדי להעריך את טוהר הפטוציטים בתאי P1 ו-P2, חושב היחס בין תאים חיוביים לאלבומין לתאים חיוביים ל-hNA חיוביים (n = 5). התוצאות גילו ש-0% מתאי P1 ו-97% ±-0.38% מתאי P2 נגזרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים והציגו מאפיינים דמויי הפטוציטים (איור 3).

כדי לאשר את המיון המוצלח של הפטוציטים במהלך ניסוי FACS, מומלץ להכתים יחד את ASGR1 עם הנוגדן הספציפי שלו מצומד עם פלואורופורים שונים ולאשר כי P2 מכיל תאים חיוביים ASGR1.

איור 1: התמיינות דו-ממדית בכבד של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים. (A) ציר הזמן להתמיינות בכבד. איור זה נלקח מ Yamashita et ^al.14. (B) שינויים מורפולוגיים במהלך התמיינות הכבד. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אסטרטגיית Gating למיון הפטוציטים והלא-הפטוציטים בתאים ממוינים בכבד (יום 27). (A) גטינג אוכלוסיית תאי היעד באמצעות FSC-A לעומת עלילת SSC-A. (ב) הרחבת האוכלוסייה המגודרת משלב (A) באמצעות FSC-H לעומת . FSC-W מתווה ולא כולל תאים כפולים. (ג) הרחבה נוספת של האוכלוסייה המגודרת משלב (B) באמצעות SSC-H לעומת . התוויית SSC-W ואי הכללת תאים כפולים. (D) ו-(E) הרחבת האוכלוסייה המגודרת משלב (C) באמצעות FITC-A (ALCAM) לעומת . עלילת PE-A (TMRM). (D) תאים מוכתמים עם TMRM והנוגדן^השני. (E) תאים מוכתמים עם TMRM ונוגדנים 1^ו-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות אימונוהיסטוכימיה. זיהוי אימונוהיסטוכימי של אלבומין ואנטיגן גרעיני אנושי (hNA) בתאי P1 ו-P2 ממוינים, וכימות של שבר תאים אלבומין (+) בתאי hNA (+). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD) (n = 5). הניתוח הסטטיסטי נערך באמצעות מבחן t של התלמיד. *P < 0.05. איור זה נלקח מ Yamashita et ^al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בשל תפקודם במטבוליזם של חומרי מזון וניקוי רעלים, לפטוציטים יש מספר גדול יחסית של מיטוכונדריה בהשוואה לסוגי תאים אחרים¹⁵. ALCAM הוא חבר במשפחת האימונוגלובולינים וממלא תפקיד בהידבקות תאים ובנדידה. הוא מתבטא בסוגי תאים שונים, כולל כבד, אפיתל, לימפוציטים, מיאלואידים, פיברובלסטים ותאי עצב¹⁶. על ידי שימוש בשילוב של השיטה המבוססת על מיטוכונדריה ונוגדן ALCAM, זוהו בהצלחה הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים.

בעוד שהבדיקות לאפיון תפקוד ההפרשה או פעילות האנזים של הפטוציטים המטוהרים לא בוצעו, ביטוי mRNA של הגן CYP3A4 בהפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים שטוהרו אומתו. יתר על כן, אוכלוסיית הפטוציטים עם TMRM (גבוה) ו- ALCAM (+) שבודדו מגופי עוברים שמקורם בתאי ES אנושיים, שנצפו ביטויים גבוהים יותר של קבוצות גנים הקשורות לכבד (VTN, SERPINA1, CYP1A1, FGB, FGA, FGG, AFP, ALB ו- APOB) בהשוואה לקרדיומיוציטים שמקורם בתאי ES¹⁴.

צעד קריטי במסגרת הפרוטוקול הוא לנתק בעדינות תאים ממוינים דו-ממדיים בכבד מצלחות התרבית עם נזק מינימלי תוך הבטחת שימור הפעילות המיטוכונדריאלית לצביעת TMRM. בהתאם למצב ההתמיינות, הפטוציטים עשויים להפגין עמידות לניתוק מהמנה אפילו עם טיפול אנזים, אתגר שניתן לטפל בו ביעילות על ידי תוספת של 0.25 mM EDTA.

שיטות קיימות לטיהור הפטוציטים באמצעות FACS כרוכות בהחדרת גנים מדווחים במורד הזרם של מקדמים ספציפיים לגנים המבוטאים בהפטוציטים. עם זאת, גישה זו נושאת את הסיכון הפוטנציאלי של תופעות לוואי הקשורות לשינויים גנטיים. השיטה המיטוכונדריאלית, לעומת זאת, מבטלת חששות כאלה. זוהו מספר סמנים של פני השטח של תאי גזע / אב של כבד בוגר או עוברי¹⁸, וניתן היה למיין תאי אב כבדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות אוכלוסיית CD13+CD133+¹⁹. מצד שני, בין הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים, חלק קטן מהפטוציטים הבשלים יכולים להיות ממוינים באמצעות נוגדן ASGR1 (קולטן אסיאלוגליקוביץ 1)¹⁷, שהוא סמן פני התא היחיד הספציפי להפטוציטים. הוכח כי אוכלוסיית התאים המפגינים חיוביות גבוהה במיטוכונדריה וב- ALCAM הכילה את שתי האוכלוסיות המסומנות בתאי CD13+CD133+ ותאי ASGR1+. זה מצביע על כך שאוכלוסיות מיטוכונדריאליות וחיוביות ALCAM גבוהות עשויות להכיל מגוון רחב של הפטוציטים עם בשלות שונות¹⁴. כתוצאה מכך, שיטה זו עשויה לאפשר טיהור של אוכלוסיית hepatocyte עם אובדן קטן.

ניתוח הקרביים השלמים של העובר בעכבר ביום העוברי 14.5 בשיטה זו גילה את הביטוי של ALCAM הן במיוציטים והן בהפטוציטים¹⁴. מחקרים קודמים אחרים דיווחו על ביטוי ALCAM בתאי אב שריר הלב²¹. במקרה של תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, הקרדיומיוציטים זוהו באוכלוסייה שלילית של ALCAM. נתונים אלה מראים כי ביטוי ALCAM בשושלות לב וכבד משתנה בהתאם הן למין והן לשלבי הבשלות התא. עם זאת, בשל החלק המיטוכונדריאלי הגבוה יותר בקרדיומיוציטים בהשוואה להפטוציטים, הצליח למעשה להפריד את שני סוגי התאים על ידי FACS אפילו מתאים מעורבים שמקורם בעובר השלם של העכבר. זה מצביע על כך שהשיטה המוצעת יכולה להיות שימושית לטיהור הפטוציטים וקרדיומיוציטים ממיני בעלי חיים אחרים.

טכנולוגיית טיהור הכבד המתוארת כאן צפויה למלא תפקיד מרכזי בקידום תחום הרפואה הרגנרטיבית על ידי הפחתת הסיכון הפוטנציאלי להיווצרות גידולים הקשורים להשתלת הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. עם זאת, שלילה של יכולת יצירת טרטומה באוכלוסיית הפטוציטים שטוהרה בטכניקה זו לא נעשתה. יש לבצע מחקרים נוספים להבטחת בטיחות.

תאים גדולים ודבקים כגון הפטוציטים פגיעים מאוד לנזק מכני במהלך מיון FACS, וכתוצאה מכך אובדן משמעותי של תאים ברי קיימא. עבור יישומים קליניים, חיוני לפתח שיטת טיהור חדשה הקובעת סביבת תרבית המאפשרת הישרדות של hepatocytes אך ורק כגון שיטת לקטט לטיהור cardiomyocyte²².

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה מספר מענק [23390072].