הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

מאמר זה מתאר שיטת הכנה לדוגמה המבוססת על אי-פעולת חום כדי לשמר פפטידים אנדוגני הימנעות השפלה לאחר המוות, ואחריו כמות יחסית באמצעות תיוג איזוטופי בתוספת LC-MS.

פפטידומיקה יכולה להיות מוגדרת כניתוח איכותי וכמותי של פפטידים במדגם ביולוגי. היישומים העיקריים שלה כוללים זיהוי סמנים ביולוגיים פפטיד של מחלות או מתח סביבתי, זיהוי נוירופפטידים, הורמונים, פפטידים תאיים ביואקטיביים, גילוי פפטידים מיקרוביאליים ו nutraceutical מחלבון הידרוליזטים, וניתן להשתמש בהם במחקרים כדי להבין את התהליכים הפרוטאוליטיים. ההתקדמות האחרונה בהכנת מדגם, שיטות הפרדה, טכניקות ספקטרומטריית מסה וכלים חישוביים הקשורים לרצף חלבונים תרמה לעלייה במספר הפפטידים והפפטידום המזוהים המאופיינים. מחקרים פפטידום לעתים קרובות לנתח פפטידים שנוצרים באופן טבעי בתאים. כאן, פרוטוקול הכנה מדגם המבוסס על אי-פעילות חום מתואר, אשר מבטל פעילות פרוטאז, ומיצוי עם תנאים קלים, כך שאין מחשוף קשרים פפטיד. בנוסף, כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופ יציב על ידי מתילציה מופחתת של אמינים מוצג גם. שיטת תיוג זו יש כמה יתרונות כמו ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה לאחרים, יציב מבחינה כימית, ומאפשר ניתוח של עד חמש דגימות בריצה אחת LC-MS.

מדעי "Omics" מאופיינים בניתוח עמוק של ערכת מולקולות, כגון DNA, RNA, חלבונים, פפטידים, מטבוליטים וכו '. ערכות נתונים בקנה מידה גדול אלה (גנומיקה, תמלול, פרוטאומיה, פפטידומיקה, מטבולומיה וכו ') חוללו מהפכה בביולוגיה והובילו להבנה מתקדמת של תהליכים ^{ביולוגיים1}. המונח פפטידומיקה החל להיות מוצג בתחילת ^{המאה ה -}20, וכמה מחברים התייחסו אליו כענף של פרוטאומיקס2. עם זאת, לפפטידוזיקה יש פרטים ברורים, כאשר האינטרס העיקרי הוא לחקור את תוכן הפפטידים שנוצר באופן טבעי במהלך תהליכים תאיים, כמו גם את אפיון הפעילות הביולוגית של מולקולות ^אלה3,4.

בתחילה, מחקרי פפטיד ביואקטיביים הוגבלו נוירופפטידים ופפטידים הורמונליים באמצעות השפלה אדמן ורדיוימונואסאי. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות ניתוח גלובלי, בהתאם לבידוד של כל פפטיד בריכוזים גבוהים, זמן ליצירת נוגדנים, מלבד אפשרות תגובה ^צולבת5.

ניתוח פפטידומיקה התאפשר רק לאחר מספר התקדמות בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS) ופרויקטים של גנום שסיפקו מאגרי נתונים מקיפים למחקרי פרוטאומיקה/פפטידומיקה6,7. יתר על כן, פרוטוקול מיצוי פפטיד ספציפי עבור peptidomes היה צריך להיות הוקם כי המחקרים הראשונים שניתחו neuropeptides ברחבי העולם בדגימות המוח הראו כי זיהוי הושפע השפלה מסיבית של חלבונים, אשר מתרחשים בעיקר ברקמה זו לאחר 1 דקות לאחר המוות. נוכחותם של שברי פפטיד אלה הסתירו את אות הנוירופפטיד ולא ייצגו את הפפטידום ב- vivo. בעיה זו נפתרה בעיקר עם היישום של חימום מהיר של פעילות פרוטאזים באמצעות הקרנת מיקרוגל, אשר הפחית באופן דרסטי את נוכחותם של שברי חפץ אלה ואפשר לא רק זיהוי של שברי נוירופפטיד, אלא חשף את נוכחותם של קבוצה של פפטידים מחלבונים ציטוזוליים, מיטוכונדריאליים וגרעין, שונים של degradome6,8,9.

הליכים מתודולוגיים אלה אפשרו הרחבה של הפפטידום מעבר לנוירופפטידים הידועים, שם זוהו מאות פפטידים תאיים שנוצרו בעיקר על ידי פעולת הפרוטאוזומים ^{בשמרים10}, ^זברה11, רקמות מכרסמים12 ותאים ^{אנושיים13}. עשרות פפטידים תאיים אלה הוכחו בהרחבה כבעלי פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגיות ^{כאחד14,15}. יתר על כן, פפטידים אלה יכולים לשמש סמנים ביולוגיים של מחלות ואולי יש משמעות קלינית, כפי שהוכח בנוזל השדרתי מחולים עם מפרצת תוך ^{גולגולתית16}.

נכון לעכשיו, בנוסף לזיהוי רצפי פפטיד, ניתן באמצעות ספקטרומטריית מסה להשיג נתונים של כמות מוחלטת ויחסית. בכמות המוחלטת, רמות הפפטיד במדגם ביולוגי מושוות לתקנים סינתטיים, ואילו בכמות היחסית, רמות הפפטיד משווות בין שתי דגימות או ^יותר17. כמות יחסית יכולה להתבצע באמצעות הגישות הבאות: 1) "תווית חינם"¹⁸; 2) בסימון מטבולי vivo או 3) תיוג כימי. שני האחרונים מבוססים על שימוש בצורות איזוטופיות יציבות המשולבות ^{בפפטידים19,20}. בניתוח ללא תוויות, רמות הפפטיד מוערכות על ידי התחשבות בעוצמת האות (ספירות ספקטרליות) במהלך ^LC-MS18. עם זאת, תיוג איזוטופי יכול להשיג רמות יחסיות מדויקות יותר של פפטידים.

מחקרים פפטידום רבים השתמשו טרימתילאמוניום butyrate (TMAB) תיוג ריאגנטים כמו תיוג כימי, ולאחרונה, מתילציה רדוקטיבית של אמינים (RMA) עם צורות deuteed ולא deuteed של פורמלדהיד ונתרן cyanoborohydride ריאגנטים שימשו11,21,222. עם זאת, תוויות TMAB אינן זמינות מסחרית, ותהליך הסינתזה הוא מייגע מאוד. מצד שני, ב RMA, ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה תוויות אחרות, ההליך הוא פשוט לביצוע, ואת פפטידים מסומנים ^{יציבים23,24}.

השימוש ב- RMA כרוך בהקמת בסיס שיף על ידי מתן אפשרות לפפטידים להגיב עם פורמלדהיד, ואחריו תגובת הפחתה באמצעות ציאנובורוהידריד. תגובה זו גורמת דימתילציה של קבוצות אמינו חינם על N-מסופים ושרשראות צד ליצין ו monomethylates N-מסוף prolines. איך שאריות פרולין הם לעתים קרובות נדיר על N-מסוף, כמעט כל הפפטידים עם אמינים חינם על N-טרמינל מסומנים עם שתי קבוצות מתיל23,24,25^.

ההליך הבא להפקת פפטיד ומתילציה מופחתת הותאם מהליכים שפורסמו בעבר24,25,26,27. פרוטוקול זה פעל בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לבקרת ניסויים בבעלי חיים (CONCEA) ואושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (CEUA) במכון הביו-מדעי של אוניברסיטת סאו פאולו. שלבי הפרוטוקול מוצגים באיור 1.

הערה: הכינו את כל הפתרונות המימיים במים אולטרה-תכשירים.

1. מיצוי פפטיד

1. תרבית תאים
   1. טפח תאי SHSY5Y בצלחת של 15 ס"מ ב-37 °C (5% _CO2 ) במדיום הנשר המותאם של Dulbecco המכיל 15% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. יש להשתמש ב-2-3 צלחות לכל דגימה. להגדיל את התאים ל 100% מפגש.
   3. לאחר הטיפול המיועד, לשטוף את התאים פעמיים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט, לגרד את התאים ולאסוף לתוך צינור 15 מ"ל.
   4. צנטריפוגטה ב 800 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. resuspend הכדור ב 1 מ"ל של מים דה-יוניזציה מטוהרים במיוחד ב 80 °C (80 °F).
   5. העבר את התוכן של הצינור (ליסאט סלולרי) לצינור מיקרופוגה 2 מ"ל.
2. רקמות בעלי חיים (בעיקר רקמת עצבים):
   1. מרטים סוג בר זכר מבוגר דניו rerio (דג זברה) עם מנה קטלנית של MS 222 (100 מ"ג / ליטר) ומיד כפוף אותו 8 s של קרינת מיקרוגל כדי לאטום פפטידאז ופרוטאז.
      הערה: ניתן להשתמש בתנור מיקרוגל ביתי. מיקרוגל 900 W שימש עבור 8 עד 10 s במלוא העוצמה. המיקרוגל המשמש חייב להיות מסוגל להעלות את טמפרטורת המוח > 80 °C (50 °F) בתוך 10 מעלות צלזיוס. רבייה בחימום בין דגימות תרוויח גם על ידי הצבת הרקמה באותו מיקום במיקרוגל.
   2. לאחר אי-פעילות חום, לאסוף את כל המוח בצינור microfuge 2 מ"ל ולהקפיא ב -80 °C (70 °F) עד ניתוח.
   3. resuspend דגימת הרקמה ב 1 מ"ל של מים דה-יונים מטוהרים במיוחד ב 80 °C (80 °F). Sonicate הרקמה עם בדיקה באמצעות 30 פולסים (4 הרץ) של 1 s.
      הערות: עבור רקמות הכבד והכליות, השתמש homogenizer מכני ב 10,000-30,000 סל"ד עבור 20 s. עבור רקמות שרירים, לטחון את הרקמה בחנקן נוזלי באמצעות כור היתוך חרסינה ועלי. השלבים הבאים זהים עבור ליסאט הסלולר או רקמה הומוגנית.
3. לדגור על הרקמה הסלולר ליסאט או הומוגני ב 80 °C (70 °F) במשך 20 דקות. לאחר מכן, לקרר אותו על קרח במשך 10-30 דקות.
4. הוסף 10 μL של פתרון מלאי HCl 1 M עבור כל 1 מ"ל של נפח מדגם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 mM. מערבבים על ידי מערבולת במשך 20 s ודגרה נוספת על קרח במשך 15 דקות.
   הערה: לפני החמצה, ודא המדגם מקורר לחלוטין כדי למנוע שבירת קשרים פפטיד הנגרמת על ידי החמצה בטמפרטורות גבוהות.
5. צנטריפוגות ליסאט הסלולר או רקמה הומוגנית ב 12,000 x גרם ב 4 °C (70 °F) במשך 15 דקות. לאסוף את supernatant בצינורות microcentrifuge חלבון מחייב נמוך ולאחסן אותו ב -80 °C (70 °F).
6. נקה את התקני הסינון האולטרה-סינון (מסנני ניתוק של 10 kDa) על-ידי הוספת מים וצנטריפוגות ב- 2300 x g למשך 3 דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
7. מניחים את הסופר-נט במסננים חתוךים 10 kDa שנשטפו מראש וצנטריפוגה ב-2,300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות בצנטריפוגה מחודשת. הזרימה דרך מייצגת את תמצית הפפטיד.
8. התפלת הדגימות בעמודות ניקוי שלב הפוך בהתאם להוראות היצרן באמצעות פתרונות acetonitrile (ACN) וחומצה טריפלואורואצטית (TFA) כמתואר להלן:
   1. שפל את העמודה עם 1 מ"ל של 100% ACN.
   2. לשטוף את העמודה עם פתרון 1 מ"ל של 5% ACN עם 0.1% TFA.
   3. טען את אמצעי האחסון המלא של הדוגמה בעמודה.
   4. לשטוף את העמודה עם פתרון 1 mL של 5% ACN עם 0.1% TFA
   5. יש לאחל את הפפטידים מהטור עם פתרון של 1.8 מ"ל של 100% ACN עם 0.15% TFA בצינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה של חלבון.
9. ייבשו את הדגימה לחלוטין בצנטריפוגת ואקום. הגדר את שיטת הריכוז עבור ממיסים אורגניים וטמפרטורה ב 30 °C (50 °F). זמן הריכוז מנוטר בתצוגה.
   1. אחסן את הדגימות ב- −80°C עד לשלב הבא.

2. כימות פפטיד עם פלואורסאמין

הערה: ניתן להעריך את כמות הפפטיד באמצעות פלואורסאמין ב- pH 6.8 כפי שתואר ^{בעבר11,28}. שיטה זו מורכבת מחיבור של מולקולת פלואורסאמין לאמינים העיקריים הקיימים בשאריות ליסן (K) ו/או N-terminal של פפטידים. התגובה מבוצעת ב- pH 6.8 כדי להבטיח כי פלואורסצמין מגיב רק עם קבוצות האמינו של הפפטידים ולא עם חומצות אמינו חופשיות. הפלואורסאמין נמדד באמצעות ספקטרופלואורומטר אורך גל עירור של 370 ננומטר ואורך גל פליטה של 480 ננומטר.

1. הכן ריכוזים שונים של הפפטיד הסטנדרטי (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 ו 0.7 מיקרוגרם / μL) ולאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F).
   הערה: פפטיד 5A (LTLRTKL) הוא הציע שכן יש לו הרכב ידוע וריכוז.
2. הכן פתרון מלאי פלואורסאמין (0.3 מ"ג /מ"ל) באצטון. Aliquot במהירות צינורות microcentrifuge (1 מ"ל), לאטום באמצעות parafilm, ולאחסן ב -20 °C (50 °F) בחושך.
3. הכן 0.2 M חוצץ פוספט (PB) ב pH 6.8.
   הערה: הכן 0.2 M PB על ידי הוספת 0.1 M חוצץ פוספט pH 6.8 (26.85 מ"ל של _Na2HPO3 1M) ו 0.1 M חוצץ פוספט pH 6.8 (23.15 מ"ל של _NaH2PO3 1M) עד 250 מ"ל של מים
4. resuspend דגימות פפטיד ב 100-200 μL של מים מטוהרים במיוחד.
5. Pipette 2.5 μL של ריכוזי פפטיד סטנדרטיים ודגימות על צלחת לבן 96 באר עבור תוחם פלואורסצנטי במשולש. הוסף 25 μL של 0.2 M מאגר פוספט.
6. הוסף 12.5 μL של פלואורסאמין עם פיפטה רב ערוצית. הומוגניזציה בעדינות במשך דקה אחת על שייקר המסובב מסלולית.
7. לאחר מכן, להוסיף 110 μL של מים עם pipette רב ערוצית כדי לעצור את התגובה.
   הערה: העבר את תמיסה מלאי פלואורסצמין ומים אולטרה-דור לשני מאגרים כדי pipette פתרונות אלה עם pipette רב ערוצי.
8. התאם את פרמטרי הקריאה הבאים בספקטרופלואורומטר: קרא את הדגימות מלמעלה, אורך גל עירור ב-370 ננומטר ואורך גל פליטה ב-480 ננומטר.
9. קרא את הצלחת על הספקטרופלואורומטר.

3. מתילציה מופחתת של תיוג אמינים

הערה: שיטת תיוג איזוטופית זו מבוססת על דימתילציה של קבוצות אמין עם צורות deuterated ולא deuteed של פורמלדהיד ונתרן ציאנובורוהידריד ריאגנטים. התוצר הסופי של תגובה זו מוסיף 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da, או 36 Da למסה הסופית של כל פפטיד בכל אתר תיוג זמין (ליסין או N-מסוף). תגובה זו מייצרת הבדל m/z בפפטידים המסומנים בצורות שונות שנצפו בספקטרום MS (טבלה 1).

זהירות: יש להשתמש בציוד בטיחות מתאים לטיפול בתרכובות אלה, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את החשיפה. נהלים עם פורמלדהיד ונתרן ציאנובורוהידריד ריאגנטים צריכים להתבצע במכסה אדים כי הם רעילים מאוד (כולל שקלול נתרן ציאנובורוהידריד). במהלך תגובת מרווה והחמצה, גז רעיל (מימן ציאניד) עשוי להיווצר.

1. הכן את הפתרונות הטריים הבאים מהמלאי או ריאגנטים ביום ההליך במים אולטרה-דור:
   1. לדלל את המניה של 37% פורמלדהיד (_CH2O) ל 4%.
   2. לדלל את המניה של 20% פורמלדהיד Deuterated (_CD2O) ל 4%.
   3. לדלל את המניה של 20% ^C13 פורמלדהיד (^13CD2O) עד 4%.
   4. הכן 0.6 M NabH3CN.
   5. הכן 0.6 M NaBD3CN.
   6. הכן פתרון של 1% אמוניום ביקרבונט.
   7. הכן פתרון 5% חומצה פורמית.
      הערה: לגבי הכמות היחסית של פפטידים, כמו תוכניות ניסיוניות שונות ניתן לבצע בהתאם למספר התוויות בשימוש, תשומת לב נדרשת במהלך הליך תיוג כימי. מומלץ להפריד aliquots קטן של תוויות במדפים נפרדים עם הדגימות המתאימות להיות מתויג כדי להפחית את הפוטנציאל לטעות אנוש בהוספת ריאגנט שגוי צינורות מדגם.
2. הכן כל דגימה המכילה עד 25 מיקרוגרם של הפפטיד. אסור שהדגימות יכילו טריס או אמוניום ביקרבונט.
   הערה: הכמויות המתוארות להלן מספיקות עבור כל דגימה בנפח של 100 μL.
   המשך עם שלבים 3.3-3.8 בברדס אדים.
3. הוסף ^{נפח 1} /10 של 1 M TEAB לדגימות (ריכוז סופי של הפתרון 100 מ"מ של TEAB). בדוק את ה- pH עם נייר מחוון pH; זה חייב להיות בין 5-8. התאימו עם HCl או NaOH במידת הצורך.
4. הוסף 4 μL של פורמלדהיד לא מפורסלם, מפורסמת לא מפורסמת או ^C13 מפורמלדהיד שהוקמה. מערבבים במשך 5 s על ידי מערבולת.
5. הוסף 4 μL של _NaBH3CN (0.6 M) או NaBD3CN (0.6 M) בהתאם לתוכנית התוויות שנקבעה. מערבבים במשך 5 s על ידי מערבולת.
6. דגירה במכסה אדים למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, ומערבבים כל 30 דקות.
7. חזור על שלבים 3.4 ו- 3.5. לדגור את הדגימות בשכונת אדים לילה בטמפרטורת החדר.
8. הוסיפו 16 מיקרו-אל של אמוניום ביקרבונט (1%) וערבבו על ידי מערבולת. מניחים את המדגם על קרח, מוסיפים 8 מיקרו-אל של חומצה פורמית (5%), ומערבבים על ידי מערבולת במשך 5 s.
9. שלב את הדגימות, התאם את ה- pH ל- 2-4 והתפל את הדגימות המשולבות בעמודות ניקוי שלב הפוך כפי שתואר קודם לכן בשלב 1.8.
10. ייבשו את הדגימה לחלוטין בצנטריפוגת ואקום. הגדר את שיטת הריכוז עבור ממיסים אורגניים וטמפרטורה ב 30 °C (50 °F). זמן הריכוז מנוטר בתצוגה.
11. לאחסן את הדגימות ב -20 °C (50 °F).

4. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה

1. בצע ניתוח LC-MS באמצעות מערכת nanoHPLC בשילוב למכשיר MS תואם תגי מתיל.
   הערה: מגוון מכשירי MS תואמים לתיוג RMA. מערכת nanoHPLC בשילוב Orbitrap משמש בדרך כלל לביצוע ניתוח LC-MS באמצעות מקור יון nanoelectrospray. ראשית, המדגם נטען לתוך precolumn ופפטידים מופרדים בעמודה אנליטית. ההשתלטות של פפטידים מתבצעת באמצעות שיפוע ליניארי של 5%-45% acetonitrile, ב 0.1% חומצה פורמית, במהלך 90 דקות, עם זרימה של 200 nL / min. ספקטרומטר המסה מוגדר לפעול במצב תלוי נתונים. כל סריקה מלאה נרכשת בעוצמה של 10-30 eV, 2.3 Kv, ולאחר מכן עשר הפסגות הגבוהות ביותר נבחרות עבור פיצול דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). זמן ההזרקה מוגדר על מלכודת היונים ב 100 אלפיות שנייה, ואת פורייה Transform (FT)-MS הזרקה קבוע עם רזולוציה של 1000 ms 30,000 ב m / z 300-1800. ספירה מינימלית של 5000 והחרגה דינאמית של 70 s משמשת לביצוע סריקת פיצול.

5. כמות יחסית של פפטידים

הערה: ספקטרום הטרחה של טרה-ס מנותחים בתוכנת ספקטרומטר המסה. קבוצות שיא של פפטידים עם תוויות שונות מזוהות בספקטרום MS. הכמות היחסית מחושבת על ידי עוצמת כל פסגה מונואיזוטופית. כל קבוצה מטופלת מושוות לקבוצת הביקורת המתאימה.

1. לחץ פעמיים על קובץ הדגימה הגולמי כדי לפתוח את תוכנת ניתוח הספקטרום. טען את הכרומטוגרמה של זמן השמירה (RT) ו- MS (EM) בשתי כרטיסיות, עליונה ולמטה, בהתאמה.
2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני פעם אחת ברצף בסמלים אפשרויות תצוגה ומסה בסרגל הכלים של התוכנה והגדר את דיוק המוני לארבעה מקומות עשרוניים.
3. מקם את סמן העכבר במקום כלשהו בכרטיסיה RT. חפש את זמן השמירה של היון המתאים לניתוח ולחץ על לחצן העכבר הימני. ספקטרום MS של הזמן שנבחר יוצג באופן אוטומטי בכרטיסיה EM.
4. מקם את סמן העכבר במקום כלשהו בכרטיסיה EM. חפש את היונים שיש לנתח.
5. לחץ והחזק באמצעות לחצן העכבר הימני באזור סמוך משמאל ליד יונים אלה. לאחר מכן, גרור את העכבר ימינה בטווח הרצוי כדי להגדיל את אזור העניין.
6. שמור על העכבר ממוקם בכרטיסיה EM ולחץ על חצי לוח המקשים ימינה או שמאלה כדי להגדיר את טווח היונים שיש לנתח.
7. מקם שוב את סמן העכבר בכרטיסיה RT בתחילת מרווח הזמן הרצוי.
8. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור אותו עד לערך הזמן שנבחר. תשאיר את הכפתור. העוצמה המצטברת של היונים תוצג באופן אוטומטי בכרטיסיה EM.
9. אסוף את נתוני עוצמת ה- m/z, z ו- ion בגיליון אלקטרוני.
   הערה: המסה המונואיזוטופית של כל פפטיד ללא תוספת קבוצות מתיל מחושבת מהנוסחה הבאה:
   
   מסה של פפטיד לא שודר = (m/z _a x z) - (C _a x T) - (1.008 x z)
   
   m/_{zais המסה שנצפתה} כדי לטעון ערך עבור הפסגה המונואיזוטופית עבור כל פפטיד המסומן בשילובים שונים של תגים (a =1, 2, 3, 4 או 5, המתאים למספר המדגם).
   z הוא מצב חיוב.
   _Ca היא המסה המונואיזוטופית של זוג קבוצות מתיל:
   עבור a= 1, Ca = 28.0313 (התוספת נטו של שתי קבוצות CH3 לאמין הראשי)
   עבור a=2, Ca = 30.0439 עבור שתי קבוצות CHD2
   עבור a=3, Ca = 32.0564 עבור שתי קבוצות CD2H
   עבור a=4, Ca = 34.0690 עבור שתי קבוצות CD3
   עבור a=5, Ca = 36.0757 עבור שתי קבוצות CD3 של 13
   T הוא מספר הזוגות של קבוצות מתיל המשולבות בפפטיד. ניתן לחשב זאת מהנוסחה הבאה כאשר נעשה שימוש בחמישה תגים: T =z*(m/_z5 - m/_z1)/8. עבור פפטידים המכילים אמין ראשי יחיד ולכן מסומנים עם שתי קבוצות מתיל בלבד להציג חפיפות שיא על ספקטרום MS כאשר תוויות סמוכות משמשות. ניתן לתקן את עוצמת השיא של כל פפטיד שכותרתו באמצעות המשוואות המתוארות על ידי Tashima ו- ^Fricker25.

6. זיהוי פפטיד

1. כדי לזהות פפטידים, נתח את נתוני MS/MS באמצעות מנוע חיפוש של מסד ^{נתונים29,30}.
2. כדי לחשב את קצב הגילוי השגוי (FDR) באמצעות שיטת היתוך הפיתיון, חפש במסד נתונים של פיתיון.
   הערה: פרמטרי החיפוש המשמשים בדרך כלל אינם ספציפיים לאנזים; עמידות המונית מבשר להגדיר 15-50 ppm; סובלנות מסה יון שבר של 0.5 Da; שינויים משתנים: אמינים תגובתיים משאריות ליס ו- N-terminus של תוויות מתילציה איזוטופיות פפטידים (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+32), L4 (+34) ו- L5 (+36)), מתיונין מחומצן (+15.99 Da) ואצטילציה (+42.01 Da).
3. לאחר מכן, מיין את הפפטידים לפי ממוצע הביטחון המקומי שלהם כדי לבחור את הספקטרום הטוב ביותר כדי ביאור ולסנן אותם על ידי FDR ≤5%.

איור 1: זרימת עבודה של לימודי פפטידום. שלבים של מיצוי פפטיד ומתילציה מופחתת של אמינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

התוצאות המתקבלות מהריצות שבוצעו בספקטרומטר המסה מאוחסנות בקבצי נתונים גולמיים שניתן לפתוח בתוכנת ספקטרומטר המסה. בספקטרום MS, ניתן לצפות בקבוצות שיא המייצגות פפטידים מסומנים על פי ערכת התיוג המשמשת, החל 2-5 תוויות. לדוגמה, באיור 2, זוגות פסגות שזוהו בזמן כרומטוגרפי מיוצגים בניסוי שבו נעשה שימוש בשתי תוויות איזוטופיות בלבד בשתי דגימות שונות באותה ריצה. איור 3 מציג אפשרויות אחרות לתוצאות חיוביות, תוך שימוש ב- 3 ו- 4 תוויות שונות בכל הפעלת LC-MS. בעת שימוש ב- 4 או 5 תוויות בהפעלת LC/MS, ייתכן שקיימת חפיפה של פסגות של הפפטידים המסומנים בתווית עם התגים השונים שיש לתקן כדי לקבל את ערך האינטנסיביות האמיתי של כל שיא (איור 4).

ניתן להשתמש בתיוג האיזוטופי גם כדי להציג מצעים ומוצרים במבחנה עבור פרוטאז או פפטידאז נתון, כפי שמוצג באיור 5. לבסוף, ניתן להשתמש בתוכנות שונות כדי לזהות את הפפטידים המסומנים בתווית, כגון סטודיו פיקס או קמע. יישומי תוכנה אלה נוצרו לצורך ניתוח פרוטאומי; לכן, אין לשקול את נתוני כמות החלבון לניתוח פפטידומית, וכל פפטיד שכותרתו מזוהה בתוך פרמטרי האמינות חייב להיבדק ולאחר מכן לכמת. אם הפפטידים זוהו בהצלחה ותויגו, תוכניות אלה יספקו רשימה של רצפי פפטיד מזוהים המכילים את התוויות. איור 6 מוצג דוגמה לזיהוי של רצף פפטיד שנעשה על ידי התוכנית. במקרה זה, רק 3 צורות שונות של התוויות (L1, L3 ו- L5) שימשו לתיוג שלוש דגימות שונות בנפרד, אשר היו אז מעורבב ונותח על ידי ספקטרומטריית מסה בריצה אחת.

איור 2: ספקטרום MS מייצג זמן כרומטוגרפי שנצבר בניסוי תיוג טיפוסי באמצעות דימתילציה מופחתת של אמינים. ב- (A), החצים האדומים מציינים את נוכחותם של זוגות שיא של פפטידים שונים המסומנים בשתי צורות איזוטופיות (L1 ו- L5) להשוואה בין שתי דוגמאות שונות (S1 ו- S2). ב- (B), תמונה מוגדלת של ספקטרום MS של אותו פפטיד המציגה m/z שונים בגלל השימוש בתוויות. במקרה זה, לא הייתה שום שונות בעוצמת השיא עבור פפטיד זה נוכח בדגימות אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ספקטרום MS מייצג של פפטידים מסומנים עם מתילציה מופחתת של אמינים באמצעות מספרים שונים של תגים. (A) נעשה שימוש בתיוג טריפלקס. ניתן לצפות בספקטרום MS של פפטיד הנמצא ב-3 דגימות שונות (S1, S2 ו- S3) המסומנות בתגי L1, L3 ו- L5, בהתאמה. במקרה זה, רמת הפפטיד המסומן עם L5 הייתה כפולה מהרמה שנצפתה עבור אותו פפטיד שכותרתו עם תגי L1 ו- L3. (B) תיוג מרובע בוצע באמצעות התוויות L1, L2, L3 ו- L4. במקרה זה, דגימות בקרה (S1 ו- S3) סומנו עם L1 ו- L3, בהתאמה, בהשוואה לשתי דגימות ניסיוניות (S2 ו- S4) המסומנות בתוויות L2 ו- L4. לא נצפו הבדלים משמעותיים לפפטיד זה בין הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ספקטרום MS מייצג של פפטיד שכותרתו מציג חפיפה שיא. איור זה מראה את ספקטרום ה- MS של פפטיד של מטען 3, מסה של 2098.87 Da עם אמין ראשי יחיד זמין לתיוג. ההבדל בין הפפטידים המסומנים בתווית הוא רק 2 Da, מה שגורם לחפיפה כאשר 4 או 5 תוויות משמשות באותה הפעלת LC/MS. באמצעות מודל המבוסס על משוואות פולינומיות מעוקבים, ניתן לתקן חפיפות אלה בין התוויות. בגרף, הפסים האדומים מציגים את הממוצע של ערכי האינטנסיביות המותאמים לפפטיד זה בשתי ריצות. הפסים השחורים מציגים את הממוצע של ערכי העוצמה החופפים. לאחר תיקון, פפטיד זה הראה שונות קטנה בעוצמה בין דגימות (סורגים אדומים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ספקטרום MS מייצג של פפטידים מתויגים עם מתילציה מופחתת של אמינים במחקר פרוטאוליזיס. כאן, תמציות פפטיד היו דגירה עם 200 nM ו 20 ננומטרי נוירוליסין כדי לאפיין את המצעים והמוצרים שלהם. לאישור התוצאה בוצעו שתי ריצות LC/MS עם אסטרטגיות תיוג קדימה והפוך. בהפעלה השנייה המיקום של הדגימות משתנה בשגרת התיוג ביחס לסכימה ששימשה בהפעלה הראשונה. ב- A, הוא מוצג פפטיד שאינו משתנה (NC) בנוכחות האנזים נוירוליסין. ב- B, פפטיד שנעלם בנוכחות ריכוז גבוה של האנזים (S2) וזה הראה ירידה קטנה בריכוז הנמוך של האנזים (S4) הן בתיוג קדימה והן הפוך. פפטיד זה נחשב מצע (SB) של האנזים. ב- C דוגמה לפפטיד שנחשב למוצר (PD), מכיוון שריכוזו הוגבר (S2 ו- S4) בנוכחות האנזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ספקטרום MSMS מייצג וזיהוי פפטיד שכותרתו מבוצע על-ידי מנוע חיפוש של מסד נתונים. בדוגמה זו, ניתן לצפות 2+ יונים עם m / z 672,3802, 676,4045, ו 680,4241 המקביל פפטיד של אותה מסה שכותרתו עם צורות L1, L3 ו- L5 מתילאט, בהתאמה. רצף זה ADQVSASLAKQGL זוהה באמצעות ספקטרום MS/ MS כשבר של איזופורם חלבון הקשור למיקרוטובול X1. פפטיד זה כולל את N-terminal וליסין זמין כאתרי תיוג הוספת הבדל המוני של 8 דלטון בין פפטידים שכותרתו. ספקטרום ה-MS של פפטיד זה מוצג באיור 3A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ריאגנטים של ניסוי טיפוסי באמצעות השילוב המצוין של צורות נותנות ולא נותבו של פורמלדהיד ונתרן ציאנובורוהידריד.

ברוב המחקרים פפטידום, אחד הצעדים הקריטיים הוא, ללא ספק, הכנת המדגם כי צריך להתבצע בקפידה כדי למנוע נוכחות של שברי פפטיד שנוצר על ידי פרוטאזים לאחר כמה דקות לאחר המוות. המחקרים הראשוניים על תמציות מוח שהוכנו מדגימות שאינן במיקרוגל הראו מספר רב של שברי חלבון להיות נוכחים 10-kDa microfiltrates. גישות שונות תוארו כדי למנוע ספקטרום פפטיד מהשפלת חלבון: הקרבת בעלי חיים בהקרנת מיקרוגל ^{ממוקדת6,8}, ניתוח קריוסטט ואחריו חיץ מיצוי ^רותח31, והקרת מיקרוגל לאחר הקרבה של רקמות באמצעות תנור מיקרוגל מסוג ^ביתי9,26 . עבור תרבית התא וכמה רקמות, חוסר הפעילות פרוטאז יכול להיעשות ישירות על ידי הוספת מים ב 80 °C (80 °F). עם זאת, דגימות מסוימות, כגון רקמת עצבים, יכול להיות רגיש יותר לשינוי שלאחר המוות, ואי-פעילות פרוטאז על ידי הקרנת מיקרוגל צוטטה כשיטת בחירה. יתר על כן, נקודה חשובה נוספת במהלך מיצוי פפטיד היא לוודא כי תמציות הם קרים כקרח לפני הוספת חומצה כדי למנוע קשרים חומצה-labile לשבור, כמו מחשוף של קשרים ^Asp-Pro26.

אסטרטגיות שונות יכולות לשמש לכימות יחסי של פפטידים, אבל אף אחד מהם לא יכול להיחשב אידיאלי לחלוטין. כדי לבחור את השיטה לשימוש, החוקר חייב לשקול גורמים כגון זמינות שעות שימוש בספקטרומטר המסה, זמין מסחרית ועלויות של ריאגנטים תיוג, וקלות בניתוח הנתונים שהתקבלו 17,25,26,32. השיטה ללא תוויות כבר בשימוש נרחב אבל דורש שעות רבות ספקטרומטר המסה. יש צורך להזריק שכפולים טכניים עבור כל מדגם ותלוי רבייה כרומטוגרפית בין הדגימות. ריאגנטים אחרים של תיוג כימי, לדוגמה, ITRAQ (תגים איזובריים לכמות יחסית ומוחלטת) ו- TMT (תג מסה דו-מושבי), הם יקרים ומספקים רק כמות של פפטידים שנבחרו עבור ניתוח MS/MS25,33,34.

המגבלה העיקרית של כימות יחסי באמצעות תיוג כימי באמצעות RMA היא החפיפה המתרחשת עבור פפטידים מסוימים בעת ביצוע פרוטוקול באמצעות 4 או 5 תוויות באותה ריצה וכתוצאה מכך הבדלים המוניים של 2 Da עבור פפטידים עם אמין ראשי יחיד ו 1 Da עבור פפטידים עם פרולין N-terminus וללא שאריות ליסן פנימיות. עם זאת, Tashima ו- Fricker (2018) פיתחו מודל לתיקון חפיפה איזוטופית המבוססת על משוואות פולינומיות ^{מעוקבים25}, אשר מקבלות את העוצמה הנכונה של הפפטידים המסומנים בדגימות. יתר על כן, לא כל הפפטידים ניתן לראות על ידי RMA. לדוגמה, כמה פפטידים חסר אמין חינם N-מסוף עקב אצטילציה, pyroglutamylation, או שינוי אחר. אם ליזנים פנימיים נעדרים גם בפפטידים אלה, הם לא יתויגו על ידי ריאגנט RMA ויופיעו על ספקטרום m / z כמו פסגות יחיד בלתי ניתנות לערימה27.

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים קיימים.

הפיתוח והשימוש בטכניקות המתוארות כאן נתמכו על ידי מענק המועצה הלאומית הברזילאית 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) grants 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ו-21/01286-1 (MEME). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, ההחלטה לפרסם או הכנת המאמר.