Method Article
Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.
La peptidomique peut être définie comme l’analyse qualitative et quantitative des peptides dans un échantillon biologique. Ses principales applications comprennent l’identification des biomarqueurs peptidiques de la maladie ou du stress environnemental, l’identification des neuropeptides, des hormones et des peptides intracellulaires bioactifs, la découverte de peptides antimicrobiens et nutraceutiques à partir d’hydrolysats de protéines, et peut être utilisé dans des études pour comprendre les processus protéolytiques. Les progrès récents dans la préparation des échantillons, les méthodes de séparation, les techniques de spectrométrie de masse et les outils informatiques liés au séquençage des protéines ont contribué à l’augmentation du nombre de peptides identifiés et des peptidomes caractérisés. Les études peptidomiques analysent fréquemment les peptides naturellement générés dans les cellules. Ici, un protocole de préparation d’échantillon basé sur l’inactivation thermique est décrit, ce qui élimine l’activité de la protéase et l’extraction dans des conditions douces, de sorte qu’il n’y a pas de clivage des liaisons peptidiques. En outre, la quantification relative des peptides à l’aide du marquage isotopique stable par méthylation réductrice des amines est également montrée. Cette méthode d’étiquetage présente certains avantages car les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres, chimiquement stables et permettent l’analyse de jusqu’à cinq échantillons en une seule série LC-MS.
Les sciences « omiques » sont caractérisées par l’analyse approfondie d’un ensemble de molécules, telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, les peptides, les métabolites, etc. Ces ensembles de données générés à grande échelle (génomique, transcriptomique, protéomique, peptidomique, métabolomique, etc.) ont révolutionné la biologie et conduit à une compréhension avancée des processus biologiques1. Le terme peptidomique a commencé à être introduit au début du 20ème siècle, et certains auteurs l’ont appelé une branche de la protéomique2. Cependant, la peptidomique présente des particularités distinctes, où l’intérêt principal est d’étudier la teneur en peptides générés naturellement au cours des processus cellulaires, ainsi que la caractérisation de l’activité biologique de ces molécules3,4.
Initialement, les études sur les peptides bioactifs étaient limitées aux neuropeptides et aux peptides hormonaux par dégradation d’Edman et dosage radioimmunologique. Cependant, ces techniques ne permettent pas une analyse globale, en fonction de l’isolement de chaque peptide à des concentrations élevées, du temps de génération d’anticorps, en dehors de la possibilité de réactivité croisée5.
L’analyse peptidomique n’a été rendue possible qu’après plusieurs avancées dans la spectrométrie de masse couplée par chromatographie liquide (LC-MS) et des projets de génome qui ont fourni des pools de données complets pour les études protéomiques / peptidomics6,7. De plus, un protocole d’extraction peptidique spécifique pour les peptidomes devait être établi car les premières études qui ont analysé les neuropeptides à l’échelle mondiale dans des échantillons de cerveau ont montré que la détection était affectée par la dégradation massive des protéines, qui se produisent principalement dans ce tissu après 1 min post-mortem. La présence de ces fragments peptidiques masquait le signal neuropeptide et ne représentait pas le peptidome in vivo. Ce problème a été résolu principalement avec l’application de l’inactivation rapide par chauffage des protéases à l’aide de l’irradiation par micro-ondes, ce qui a considérablement réduit la présence de ces fragments d’artefacts et a permis non seulement l’identification de fragments de neuropeptides, mais a révélé la présence d’un ensemble de peptides de protéines cytosoliques, mitochondriales et nucléaires, différentes de degradome6,8,9.
Ces procédures méthodologiques ont permis une expansion du peptidome au-delà des neuropeptides bien connus, où des centaines de peptides intracellulaires générés principalement par l’action des protéasomes ont été identifiés dans la levure10, le poisson-zèbre11, les tissus de rongeurs12 et les cellules humaines13. Il a été largement démontré que des dizaines de ces peptides intracellulaires ont des activités biologiques et pharmacologiques14,15. En outre, ces peptides peuvent être utilisés comme biomarqueurs de la maladie et éventuellement avoir une signification clinique, comme démontré dans le liquide céphalo-rachidien chez les patients atteints d’anévrismes sacculaires intracrâniens16.
Actuellement, en plus de l’identification des séquences peptidiques, il est possible par spectrométrie de masse d’obtenir des données de quantification absolue et relative. Dans la quantification absolue, les niveaux de peptides dans un échantillon biologique sont comparés à des étalons synthétiques, tandis que dans la quantification relative, les niveaux de peptides sont comparés entre deux échantillons ou plus17. La quantification relative peut être effectuée à l’aide des approches suivantes : 1) « sans étiquette »18; 2) marquage métabolique in vivo ou 3) marquage chimique. Les deux derniers sont basés sur l’utilisation de formes isotopiques stables incorporées dans des peptides19,20. Dans l’analyse sans étiquette, les niveaux de peptides sont estimés en tenant compte de l’intensité du signal (comptage spectral) pendant le LC-MS18. Cependant, le marquage isotopique peut obtenir des niveaux relatifs plus précis de peptides.
De nombreuses études peptidomiques ont utilisé des réactifs de marquage du butyrate de triméthylammonium (TMAB) comme marquage chimique et, plus récemment, la méthylation réductrice des amines (RMA) avec des formes deutérées et non deutérées de formaldéhyde et de réactifs cyanoborohydrure de sodium ont été utilisées11,21,22. Cependant, les étiquettes TMAB ne sont pas disponibles dans le commerce et le processus de synthèse est très laborieux. D’autre part, dans le RMA, les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres étiquettes, la procédure est simple à effectuer et les peptides marqués sont stables23,24.
L’utilisation de RMA consiste à former une base de Schiff en permettant aux peptides de réagir avec le formaldéhyde, suivie d’une réaction de réduction à travers le cyanoborohydrure. Cette réaction provoque la diméthylation des groupes aminés libres sur les chaînes latérales N-terminales et lysine et les monométhylates N-terminaux prolines. Comme les résidus de proline sont souvent rares sur le N-terminal, pratiquement tous les peptides avec des amines libres sur le N-terminus sont marqués avec deux groupes méthyle23,24,25.
La procédure suivante pour l’extraction peptidique et la méthylation réductrice a été adaptée des procédures précédemment publiées24,25,26,27. Ce protocole suivait les directives du Conseil national pour le contrôle de l’expérimentation animale (CONCEA) et a été approuvé par la Commission d’éthique pour l’utilisation animale (CEUA) de l’Institut des biosciences de l’Université d’État de Sao Paulo. Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1.
REMARQUE: Préparer toutes les solutions aqueuses dans de l’eau ultrapure.
1. Extraction peptidique
2. Quantification peptidique avec de la fluorescamine
REMARQUE: La quantité de peptide peut être estimée en utilisant de la fluorescamine à pH 6,8 comme décrit précédemment11,28. Cette méthode consiste en la fixation d’une molécule de fluorescamine aux amines primaires présentes dans les résidus de lysine (K) et/ou le N-terminal des peptides. La réaction est réalisée à un pH de 6,8 pour garantir que la fluorescamine ne réagit qu’avec les groupes aminés des peptides et non avec les acides aminés libres. La fluorescamine est mesurée à l’aide d’un spectrofluoromètre à une longueur d’onde d’excitation de 370 nm et à une longueur d’onde d’émission de 480 nm.
3. Méthylation réductrice du marquage des amines
REMARQUE: Cette méthode de marquage isotopique est basée sur la diméthylation des groupes amines avec des formes deutérées et non deutérées de réactifs de formaldéhyde et de cyanoborohydrure de sodium. Le produit final de cette réaction ajoute 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da ou 36 Da à la masse finale de chaque peptide à chaque site de marquage disponible (lysine ou N-terminal). Cette réaction produit une différence m/z dans les peptides marqués avec différentes formes observées dans le spectre de la SEP (tableau 1).
ATTENTION : Un équipement de sécurité approprié doit être utilisé pour manipuler ces composés, et des précautions doivent être prises pour minimiser l’exposition. Les procédures avec du formaldéhyde et des réactifs cyanoborohydrure de sodium doivent être effectuées dans une hotte car ils sont très toxiques (y compris la pesée du cyanoborohydrure de sodium). Au cours de la réaction de trempe et d’acidification, un gaz toxique (cyanure d’hydrogène) peut être généré.
4. Chromatographie liquide et spectrométrie de masse
5. Quantification relative des peptides
REMARQUE: Les spectres MS sont analysés dans le logiciel du spectromètre de masse. Des groupes de pics de peptides marqués avec différentes étiquettes sont identifiés dans les spectres MS. La quantification relative est calculée par l’intensité de chaque pic monoisotopique. Chaque groupe traité est comparé au groupe témoin respectif.
6. Identification des peptides
Figure 1 : Flux de travail des études peptidomiques. Étapes de l’extraction peptidique et de la méthylation réductrice des amines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les résultats obtenus à partir des exécutions effectuées sur le spectromètre de masse sont stockés dans des fichiers de données brutes qui peuvent être ouverts dans le logiciel du spectromètre de masse. Dans les spectres MS, il est possible d’observer des groupes de pics représentant des peptides marqués selon le schéma de marquage utilisé, allant de 2 à 5 étiquettes. Par exemple, dans la figure 2, des paires de pics détectés dans un temps chromatographique sont représentées dans une expérience où seulement deux étiquettes isotopiques ont été utilisées dans deux échantillons différents dans la même série. La figure 3 montre d’autres possibilités de résultats positifs, en utilisant 3 et 4 étiquettes différentes dans chaque exécution LC-MS. Lors de l’utilisation de 4 ou 5 étiquettes dans une série LC/MS, il peut y avoir un chevauchement des pics des peptides marqués avec les différentes étiquettes qui doivent être corrigées pour obtenir la valeur d’intensité réelle de chaque pic (Figure 4).
Le marquage isotopique peut également être utilisé pour montrer des substrats et des produits in vitro pour une protéase ou une peptidase donnée, comme le montre la figure 5. Enfin, différents logiciels peuvent être utilisés pour identifier les peptides étiquetés, tels que Peaks Studio ou MASCOT. Ces applications logicielles ont été créées pour l’analyse protéomique; par conséquent, les données de quantification des protéines ne doivent pas être prises en compte pour l’analyse peptidomique, et chaque peptide marqué identifié dans les paramètres de fiabilité doit être vérifié puis quantifié. Si les peptides ont été détectés et marqués avec succès, ces programmes fourniront une liste de séquences peptidiques identifiées contenant les étiquettes. La figure 6 montre un exemple de l’identification d’une séquence peptidique effectuée par le programme. Dans ce cas, seules 3 formes différentes d’étiquettes (L1, L3 et L5) ont été utilisées pour étiqueter séparément trois échantillons différents, qui ont ensuite été mélangés et analysés par spectrométrie de masse en une seule fois.
Figure 2 : Spectre MS représentatif d’un temps chromatographique accumulé dans une expérience de marquage typique utilisant la diméthylation réductrice des amines. Dans (A), les flèches rouges indiquent la présence de paires de pics de différents peptides marqués avec 2 formes isotopiques (L1 et L5) pour la comparaison entre deux échantillons différents (S1 et S2). En (B), image agrandie d’un spectre MS du même peptide montrant des m/z différents en raison de l’utilisation d’étiquettes. Dans ce cas, il n’y avait aucune variation dans l’intensité maximale de ce peptide présent dans ces échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Spectre représentatif de la SEP de peptides marqués avec méthylation réductrice des amines à l’aide de différents nombres de marqueurs. (A) Un marquage triplex a été utilisé. Il est possible d’observer un spectre MS d’un peptide présent dans 3 échantillons différents (S1, S2 et S3) marqués respectivement avec des étiquettes L1, L3 et L5. Dans ce cas, le niveau du peptide marqué avec L5 était deux fois le niveau observé pour le même peptide marqué avec des étiquettes L1 et L3. (B) Un étiquetage quadripex a été effectué à l’aide des étiquettes L1, L2, L3 et L4. Dans ce cas, les échantillons témoins (S1 et S3) ont été étiquetés avec L1 et L3, respectivement, et comparés à deux échantillons expérimentaux (S2 et S4) étiquetés avec des étiquettes L2 et L4. Aucune différence significative n’a été observée pour ce peptide entre les échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Spectre MS représentatif d’un peptide marqué présentant un chevauchement de pic. Cette figure montre le spectre MS d’un peptide de charge 3, masse de 2098,87 Da avec une seule amine primaire disponible pour le marquage. La différence entre les peptides marqués n’est que de 2 Da, ce qui provoque un chevauchement lorsque 4 ou 5 étiquettes sont utilisées dans la même série LC/MS. En utilisant un modèle basé sur des équations polynomiales cubiques, il est possible de corriger ces chevauchements entre les étiquettes. Dans le graphique, les barres rouges montrent la moyenne des valeurs d’intensité ajustées pour ce peptide en deux séries. Les barres noires montrent la moyenne des valeurs d’intensité qui se chevauchent. Après correction, ce peptide a montré peu de variation d’intensité entre les échantillons (barres rouges). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Spectre MS représentatif de peptides marqués avec méthylation réductrice des amines dans une étude de protéolyse. Ici, des extraits peptidiques ont été incubés avec 200 nM et 20 nM de neurolysine pour caractériser leurs substrats et produits. Pour confirmer le résultat, deux exécutions LC/MS avec des stratégies d’étiquetage forward et Reverse ont été effectuées. Dans la deuxième exécution, la position des échantillons est modifiée dans la procédure d’étiquetage par rapport au schéma utilisé lors de la première exécution. Dans A, on montre un peptide qui ne change pas (NC) en présence de l’enzyme neurolysine. Dans B, un peptide qui a disparu en présence d’une concentration élevée de l’enzyme (S2) et qui a montré une petite réduction de la faible concentration de l’enzyme (S4) dans le marquage avant et arrière. Ce peptide est considéré comme un substrat (SB) de l’enzyme. En C un exemple d’un peptide qui a été considéré comme un produit (PD), car sa concentration a été augmentée (S2 et S4) en présence de l’enzyme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Spectre représentatif des HARSAH et identification d’un peptide marqué effectuée par un moteur de recherche de base de données. Dans cet exemple, il est possible d’observer 2+ ions avec m/z 672,3802, 676,4045 et 680,4241 correspondant à un peptide de même masse marqué avec les formes méthylées L1, L3 et L5, respectivement. Cette séquence ADQVSASLAKQGL a été identifiée à travers le spectre MS/MS comme un fragment de la protéine tau X1 associée aux microtubules. Ce peptide a le N-terminal et une lysine disponibles comme sites de marquage ajoutant une différence de masse de 8 Daltons entre les peptides marqués. Le spectre de sep-ès de ce peptide est illustré à la figure 3A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Échantillon | H2CO | D2CO | D213CO | NaBH3CN | NaBD3CN | Étiquette | Masse supplémentaire |
2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | 2 x 4 μL | code | (Da) | |
1 | X | X | L1 | 28.0313 | |||
2 | X | X | L2 | 30.0439 | |||
3 | X | X | L3 | 32.0564 | |||
4 | X | X | L4 | 34.069 | |||
5 | X | X | L5 | 36.0757 |
Tableau 1 : Réactifs d’une expérience typique utilisant la combinaison indiquée de formes dentérées et non deutérées de formaldéhyde et de cyanoborohydrure de sodium.
Dans la plupart des études peptidomiques, l’une des étapes critiques est, sans aucun doute, la préparation de l’échantillon qui doit être soigneusement effectuée pour éviter la présence de fragments peptidiques générés par les protéases après quelques minutes post-mortem. Les premières études sur les extraits cérébraux préparés à partir d’échantillons non micro-ondes ont montré la présence d’un grand nombre de fragments de protéines dans les microfiltrats de 10 kDa. Différentes approches ont été décrites pour éviter les spectres peptidiques de la dégradation des protéines : irradiation micro-ondes ciblée sacrifice d’animal6,8, dissection de cryostat suivie d’un tampon d’extraction bouillant31, et irradiation micro-ondes post-sacrifice des tissus à l’aide d’un four à micro-ondes de type domestique9,26 . Pour la culture cellulaire et certains tissus, l’inactivation de la protéase peut se faire directement en ajoutant de l’eau à 80 °C. Cependant, certains échantillons, tels que le tissu nerveux, peuvent être plus sensibles au changement post-mortem, et l’inactivation de la protéase par irradiation par micro-ondes a été indiquée comme méthode de choix. De plus, un autre point important lors de l’extraction peptidique est de s’assurer que les extraits sont glacés avant d’ajouter de l’acide pour empêcher les liaisons acide-labile de se briser, comme le clivage des liaisons Asp-Pro26.
Différentes stratégies peuvent être utilisées pour la quantification relative des peptides, mais aucune d’entre elles ne peut être considérée comme complètement idéale. Pour choisir la méthode à utiliser, le chercheur doit tenir compte de facteurs tels que la disponibilité des heures d’utilisation dans le spectromètre de masse, la disponibilité commerciale et les coûts d’étiquetage des réactifs, ainsi que la facilité d’analyse des données obtenues17,25,26,32. La méthode sans étiquette a été largement utilisée mais nécessite de nombreuses heures dans le spectromètre de masse. Il est nécessaire d’injecter des répliques techniques pour chaque échantillon et dépend de la reproductibilité chromatographique entre les échantillons. D’autres réactifs de marquage chimique, par exemple l’ITRAQ (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) et le TMT (étiquette de masse en tandem), sont coûteux et ne fournissent que la quantification des peptides sélectionnés pour l’analyse MS/MS25,33,34.
La principale limite de la quantification relative par marquage chimique à l’aide de RMA est le chevauchement qui se produit pour certains peptides lors de l’exécution d’un protocole utilisant 4 ou 5 étiquettes à la même exécution, ce qui entraîne des différences de masse de 2 Da pour les peptides avec une seule amine primaire et de 1 Da pour les peptides avec de la proline N-terminus et aucun résidu de lysine interne. Cependant, Tashima et Fricker (2018) ont développé un modèle pour corriger le chevauchement isotopique basé sur des équations polynomiales cubiques25, qui obtiennent l’intensité correcte des peptides marqués dans les échantillons. De plus, tous les peptides ne peuvent pas être vus par RMA. Par exemple, certains peptides manquent d’une amine libre N-terminale en raison de l’acétylation, de la pyroglutamylation ou d’une autre modification. Si les lysines internes sont également absentes de ces peptides, elles ne seront pas marquées par le réactif RMA et apparaîtront sur les spectres m/z comme des pics uniques non quantifiables27.
Il n’existe pas d’intérêts financiers concurrents.
Le développement et l’utilisation des techniques décrites ici ont été soutenus par la subvention du Conseil national brésilien de la recherche 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) subventions 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) et 21/01286-1 (MEME). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation de l’article.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
Fume hood | Quimis | Q216 | |
Hydrochloric acid - HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
Triethylammonium buffer - TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid - TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
Water bath | Cientec | 266 | |
Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
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