ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.

מערכת העצבים מורכבת של מגוון עצום של סוגי נוירונים ברורים. תת-אוכלוסיות נוירונים אלו מתאפיינות, בין שאר התכונות, מורפולוגיות הדנדריטים הנבדלות, דפוסים מסוימים שלהם של קישוריות אקסונלית, ותגובות ירי סלקטיווי שלהם. המנגנונים המולקולריים תאיים האחראים על היבטים אלה של בידול במהלך פיתוח עדיין הם הבינו היטב.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים משולבים תיוג ואפיון הקישוריות המבנית הרגיש של נוירונים בקליפת המוח. שינוי של electroporation ברחם (IUE) הפרוטוקול מאפשר תיוג של אוכלוסייה דלילה של נוירונים. זה, בתורו, מאפשר זיהוי ומעקב של דנדריטים אקסונים של נוירונים בודדים, אפיון מדויק של מיקום למינרית של תחזיות axonal, וניתוח morphometric. IUE יכול לשמש גם כדי לחקור שינויים הרגישים שלWild-type (WT) או נוירונים מהונדסים גנטית על ידי שילוב עם הקלטה כל תא מן פרוסות חריפה של המוח electroporated. שתי טכניקות אלה תורמות להבנה טובה יותר של הצימוד של קישוריות מבנית ותפקודית ושל המנגנונים המולקולריים השולטים גיוון עצבי במהלך פיתוח. יש תהליכים התפתחותיים אלו השלכות חשובות על חיווט axonal, את המגוון הפונקציונלי של נוירונים, לבין הביולוגיה של פרעות קוגניטיביות.

פיתוח המבנים דנדריטים אקסונלית הוא היבט חשוב של תקנה מעגלת במערכת העצבים, כולל בקליפת המוח. זה ממלא תפקיד חיוני במהלך החיווט סלקטיבית של תת-אוכלוסיות נוירונים המגוונות. מספר דיווחים עדכניים הראו כי, בנוסף לקישוריות, המגוון המולקולרי של נוירונים משתקף רכישת מצבים מאוד ספציפיים של ירי. עם זאת, המנגנונים לקביעת הרגישות והקישוריות של תת העצבית הברורה במהלך פיתוח, כמו גם מידת התיאום שלהם, הם עדיין לא ידועים ולא מובן ^{1, 2.}

בשנת vivo loss- ולהשיג של פונקצית המנתח לאפשר לחקר היחסים בין רמת הביטוי של גנים ספציפיים והשפיעו בפיתוח של המעגל. ברחם electroporation (IUE) היא טכניקה בשימוש נרחב ללמודהפונקציה של גן של עניין אוכלוסיות נוירונים ספציפיות כדי לחקור את הדפוסים הכוללים של הקישוריות שלהם. עם זאת, כדי לקבוע את המאפיינים המורפולוגיים של אקסונים דנדריטים בשכבות קליפת המוח בעכברים חיים, חיוני לתייג נוירונים בדלילות. מערכת רקומבינציה Cre בשילוב עם IUE יכול לשמש כדי לסמן אוכלוסייה דלילה של נוירונים בצפיפות נמוכה מספיק כדי לפתור את התחזיות נפלטות תאים בודדים של laminas קליפת המוח המזוהית. שיטה זו תוויות מספר מספיק של נוירונים לכל קליפה לקבל נתונים כמותיים לאחר הניתוח של מספרים סבירים של מוח electroporated (איור 1). כתב יד זה מציג שיטה לניתוח קנס כזה של קישוריות. הוא גם מציג אסטרטגיה דומה לנתח, בניסויים נפרדים, את התכונות החשמליות של נוירונים על ידי ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -electroporated תאים פרוסים קליפת מוח חריף. אלה הפרוtocols הם מגוונים וניתן להחיל את המחקר של הרגישות והקישוריות של נוירונים של חיות WT ו מהונדסות, וגם של נוירונים אשר הפסדים ורווחים של פונקציה הם הציגו על ידי פלסמידים נוספים במהלך IUE.

למרות בפרוטוקול זה מתאר את electroporation של עכברים ביום עובריים (E) 15.5, טכניקה זו יכולה להתבצע בכל גיל בין ³ E9.5 ויום לאחר הלידה (P) 2 ^4. בעוד electroporation ב מוקדם בשלבי מטרות נוירונים ומבשרים בתלמוס רבדים עמוקים של קליפת המוח, הנמצאים בשלבים סימני electroporation בשכבות שטחיות יותר (למשל, שכבת מטרות E15.5 IUE II-III נוירונים). לסיכום, השילוב של IUE עם ניתוח מורפולוגי תא בודד ו אלקטרופיזיולוגיה הוא כלי שימושי כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המגוון מבני ותפקודי העצום של נוירונים במערכת העצבים.

הנהלים כל חיה אושרו על ידי הקהילה של טיפול בבעלי חיים מדריד ועדת שימוש, בהתאם לחקיקה הלאומית האירופי (118/14 PROEX; PROEX 331/15). לשמור על תנאים סטריליים במהלך ההליך.

1. ברחם Electroporation

הערה: פרוטוקול זה עבור IUE מותאם מאחרים אשר פורסמו בעבר ^{5, 6, 7.} כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור העוברים של E15.5 IUE, עם שינויים באסטרטגית הכתב המאפשרת לחקר המורפולוגיה של נוירונים בודדים ⁸ ומאפייני אלקטרו שלהם בניסוי נפרד באמצעות פלסמידים כתב ה- GFP הרגילים.

1. הכנת DNA
   1. כן פלסמידים DNA באמצעות ערכת בידוד רעלן פנימי חופשיות בהתאם להוראות היצרן ו לדלל אותם p 1xמלוח hosphate שנאגר (PBS).
      1. עבור תיוג תא בודד, להכין 10 μL של תערובת DNA לכל ניתוח (1 μL לכל העובר), בעזרת המבנים הבאים וריכוזי הסופי: פלסמיד קידוד הכתב חלבון פלואורסצנטי (למשל, CAG-DsRed2 ^9), 1 מיקרוגרם / μL כביקורת עבור יעילות electroporation; פלסמיד הניסיון להיבדק, בדרך כלל 1 מיקרוגרם / μL; פלסמיד חלבון LoxP-ניאון-stop-LoxP (CALNL-GFP ^10), 1 מיקרוגרם / μL; ולבנות קידוד ¹⁰ Cre, 1 - 4 ng / μL. הוסף 1 μL של 0.1% Fast ירוקים במים (משקל / נפח) כדי להמחיש את ה- DNA המוזרק.
         הערה: Cre רקומבינציה של לבנות GFP מתרחשת רק בעוד כמה נוירונים, אשר מאפשר הדמיה ושחזור תחזיות axonal בודדים (איור 1 א).
      2. עבור מחקרים תיקון- clamp סטנדרטי, להכין 10 μL של תערובת DNA לכל ניתוח (1 μL לכל embrיו) של פלסמיד הבא קידוד חלבון פלואורסצנטי (למשל, CAG-GFP ^11), 1 מיקרוגרם / μL כביקורת כתב; פלסמיד הניסיון, בדרך כלל 1 מיקרוגרם / μL; ו 1 μL של 0.1% Fast הירוק במים (משקל / נפח).
         הערה: אלה הם תנאי electroporation הסטנדרטיים לנתח פרוסות חריפה המכילות מספר רב של נוירונים מעוררים שכותרתו בתוך lamina הרצוי. כדי לבצע מחקרים תיקון- clamp ב תאים בודדים, להכין את ה- DNA כמתואר בשלב 1.1.1.1.

2. הכנה לכירורגיה

1. בצע ניתוח הישרדות באמצעות נהלים ספטית. ודא בתנאים סטריליים, כולל מסכות, כפפות, כלי נגינה ומוצרים בתחום כירורגית. לעקר מכשירי ניתוח (אזמל, מלקחי Adson, מספריים בסדר מוקשים, מספריים מעוקלים, מלקחי דומון, ואת בעל מחט).
2. נימי זכוכית בורוסיליקט בחר של 1 / 0.58 המ"מ חיצוני / קוטר פנימי. כובע משוךillaries ^3. מקד לתקופה בלתי קצה אופטימלי של 1 ס"מ לאחר משיכת. חותכים את קצה המחט בזווית של כ- 30 מעלות באמצעות מלקחיים קנס (איור 1B).
3. הכן 500 מ"ל של תמיסת איזוטונית סטרילית (PBS 1x או Hank's מאוזן מלח פתרון (HBSS)). להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין 1: 100 ולחמם את הפתרון הזה על 37 מעלות צלזיוס. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לאחר הניתוח.
4. תת עורי להזריק מנה לפני הניתוח של משככי כאבים (למשל, carprofen, 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף).
5. שמור את החיות חמות לניתוח ידי הצבת על כרית חימום. לחמם לכלוב נקי ל -37 מעלות צלזיוס למשך התאוששות לאחר ניתוח.

3. כירורגיה

1. להרדים עכבר בהריון E15.5 C57BL / 6 עם isoflurane. ראשית, להשרות בתא סגור עם 3% isoflurane ב חמצן 0.8 ליטר / דקה ולהשאיר את העכבר בתוך עד שהוא נרדם. מעבירים את העכבר על כרית חימום ומקום האף והפה בתוך מסכה עבור לספקy של isoflurane. בהדרגה להקטין את ההרדמה במהלך הניתוח כדי isoflurane 1.5% באמצעות מסכה. אשר הרדמה תקינה על ידי התבוננות פסד של רפלקס הדוושה (קמצוץ בוהן). ההליך האופטימלי אורך כ- 20 דקות ולא יותר מ -45 דקות.
2. החל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות במהלך ההליך.
3. הסרת שיער מאזור ~ 3 ס"מ של הבטן (באמצעות מכונת גילוח חשמלית או קרם מקריח). לשטוף את אזור הניתוח עם צמר גפן ספוג 70% אתנול, ואחריו מקלון צמר גפן חדורי יוד. חזור שלוש פעמים.
4. מכסים את אזור הניתוח עם גזה סטרילי כדי למנוע זיהומים.
5. השתמש באזמל כדי ליצור פתח אנכי דרך העור 2 ס"מ ארוך ובמקביל קו האמצע. הפרד את העור ושרירים של הבטן באמצעות מספריים מעוקלים בוטים. החזק את השריר עם מלקחיים ולחתוך אותו דרך alba Linea כדי לחשוף את חלל הבטן.
6. אתר את העוברים בעזרת of המלקחיים. להרטיב שני צמר גפן רטוב עם תמיסת מלח סטרילית מוכנה בשלב 2.3 ולהשתמש בם כדי לתפעל עובר נגיש מתוך הפתח. מניח את צמר גפן סביב העובר בעדינות לחלץ הן קרנות רחם מחלל הבטן. שמור את העוברים ואת חלל הבטן פתח hydrated עם תמיסת מלח חמה לאורך כל ההליך, כדי למנוע מהם להתייבש.

4. הזרקת דנ"א Electroporation

1. לתפעל את העוברים בעדינות עם אצבעות כדי לאתר את telencephalon (ניתן דמיין בבירור על ידי העין כמו השלפוחית ​​הקדמית ושתיים נוספת של המוח). מניח נימי בורוסיליקט מוכנות ב פיפטה בפה. לעבור את קצה המחט דרך הרחם, הימנעות כלי דם, עד שהוא מגיע לרוחב חדר אחד. לאט לאט להזריק כ 1 μL של פתרון ה- DNA בצבע ירוק מהיר עד נקודה כחולה גדולה הוא ציין.
2. הנח את האלקטרודות פלטינה 7 מ"מ רוחבית על הראש הדואר של העובר (תרשים 1C).
   הערה: DNA הוא מטען שלילי; ולכן, הוא נע לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר מתח חשמלי בין אלקטרודות פלטינה. על ידי שינוי מיקום האלקטרודות, באזורים שונים של המוח יכול להיות ממוקד.
3. החל המתח דרך אלקטרודות פלטינה (עבור E15.5 עוברים:. 5 קטניות, 38 V, אורך מחזור 50-ms מרווח, 950 אלפיות מרווח הפסקה תנאים אלה משתנים בהתאם לשלב ההתפתחותי) ^12.
   הערה: ראה טבלת 1 תנאי מתח ואלקטרודות לשלבים עוברים שונים.
4. חזור על צעדי 4.1 - 4.3 אצל כל עובר.

5. סוף כירורגיה Postoperation

1. השתמש צמר גפן כדי לתפעל את הרחם בחזרה אל אמא. מלא את חלל הבטן עם תמיסת המלח המחוממת (להוסיף כ 2 מיליליטר).
2. לתפור את השריר עם תפרים קטע פשוט או תפר רציף. תפר השתמש # 6-0ים.
3. השתמש סיכות כדי לסגור את הפצע החיצוני. היזהר להפריד את העור מפני השריר לפני ההידוק. הסר את מסכת האף.
4. אפשר העכבר כדי להתאושש במשך 30 דקות בכלוב מחומם, נקי לפני הצבתו בחדר בית גידול. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תניחו בעל חיים אשר עבר ניתוח בחברת חיות אחרות עד התאושש לחלוטין.
5. השגיחו על החיה במהלך ימים לאחר הניתוח. החל משככי כאבים תת עורי (carprofen, 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף) כל 12 שעות למשך 2 ימים או לפי חקיקה חיה. אין טיפול לאחר ניתוח נוסף נדרש עבור הגורים.

6. הכנת וניתוח של דוגמאות

1. אופציונלי: ב P2, לבדוק על מנת לתת ביטוי הקרינה הגורים electroporated באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; כאשר IUE הוא מוצלח, קרינה יכולה בבירור לראות in ראש ^13. מארק או להפריד העכברים כי הם electroporated חיובי לשימוש בשלבים הבאים. שמור את סכר גורים בתנאי מתקן סטנדרטיים בבעלי החיים.
2. בשלב הרצוי של המחקר, perfuse העכברים transcardially. בדרך כלל, השלב הפעיל ביותר של צמיחה הדנדריטים אקסונלית תואם בשלושת השבועות שלאחר הלידה הראשון ^{2, 14, 15.}
   1. כן 30 מיליליטר של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS לכל עכבר ומקרר אותו על קרח.
      זהירות: PFA הוא אלרגן ו מסרטן ידוע. זה רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
      הערה: כמות PFA הצורך תלוי בגילו של העכבר (למשל, עבור P16, 20 מ"ל עבור זלוף 10 מ"ל עבור postfixation נדרשים).
   2. להכין תערובת קטמין-xylazine כדי להרדים את החיה עם יחס של 1: נפחית 8 של קטמין 100 מיקרוגרם / מ"ל: 1 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​xylazine: PBS (להכין סביב 0.2 מ"ל לכל עכבר).
   3. להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneally 0.2 מיליליטר של התערובת המוכנה בשלב 6.2.2.
   4. מניחים את העכבר הרדים על גבו. ביצוע חתך אופקי מעל החזה באמצעות אזמל. חותכים את שריר הסרעפת במספריים בסדר עד הלב ניתן לצפות.
      1. עושים חתך אטריום ימין עם מספריים בסדר. לאט לאט להזריק 20 מ"ל של PBS על החדר השמאלי עם מחט 25-מד כדי להסיר את הדם. להזריק 20 מ"ל PFA (שלב 6.2.1) עד שהעכבר הוא נוקשה האיברים להיות לבן.
      2. מיד להסיר את הראש ולעשות חתך קו האמצע בעור מהצוואר אל הגולגולת. בעדינות לקלף את הגולגולת באמצעות מלקחיים מעוקלים לחלץ את המוח. זהירות שלא לנקב או לפגוע במוח במהלך הסרת הגולגולת. מכניסים את המוח ב 10 מ"ל של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי postfix זה.
3. Cryoprotect קבוע המוח ב 10 מ"ל של 30% סוכרוז PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 - 2 ימים, עד שהם שוקעים. הכן קוביות רדיד 1 ס"מ ³ אלומיניום. מלאו את קוביות 2/3 הדרך עם אוקטובר. מכניסים את המוח בתוך ולהקפיא אותם על ידי הצבת קוביות קרח יבש. אחסן את המוח הקפוא ב -80 מעלות צלזיוס.
4. ירידת מקום של אוקטובר על פני השטח של דיסק הדגימה, לקלף את רדיד האלומיניום מן קוביית היסטולוגיה, ומקם את הקובייה על הכיוון הרצוי לדיסק הדגימה על גבי ב- OCT הנוזלית. החל לחץ חזק עד שהוא קבוע. הכנס את דיסק הדגימה לתוך ראש הדגימה של cryostat. אוריינט הדגימה (להזיז אותו לתוך מיקום יחסי לטובת הסכין / הלהב).
   1. סעיף המוחות על cryostat. בחר 50 - 100 cryosections הצף מיקרומטר בעובי ¹⁶ באמצעות מברשת עדינה ומניחים אותם PBS.
5. כתם אם תרצה בכך.
   הערה: לצורך המחקר של המורפולוגיה axonal, מכתים עם נוגדן GFP מומלץ בחום 2.
   1. חסום את סעיפים 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 5% בסרום שור העובר ב PBS המכיל 0.5% Triton-X 100 (פתרון חסימה). דגירה לילה ב 4 ° C עם 1: 500 נוגדן ראשוני (למשל, ארנבת אנטי GFP) מדולל חסימת פתרון.
   2. שטפו את החלקים שלוש פעמים PBS. הוסף 1: 500 נוגדנים משני (למשל, נגד ארנב עז אלקסה פלואוריד 488) מדולל חסימת פתרון דגירה 1 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקים שלוש פעמים PBS.
   3. Counterstain עם DAPI (1: 10,000) ב- PBS המכיל 0.5% Triton-X 100 במשך 10 דקות. יש לשטוף את החלקים עם PBS. הר את הסעיפים מימייה הרכבה בינונית ^16.

הדמיה וניתוח 7.

1. קרינה או confocal
   1. כדי לשחזר נוירונים שלם, לרכוש את התמונות עם גדלה גבוהה (לפחות 40X) ורזולוציה גבוהה (מינימום 1,024 x 1,024). בחר "סריקת טייל "או אפשרות מקבילת תוכנת הרכישה כדי לכסות את האזור של עניין, פורש את כל דנדריטים תהליכי axonal. רוכשת מספר מספיק של ערימות על ציר ה- z כדי למנוע אובדן המידע.
      הערה: באופן כללי, התוכנה של מיקרוסקופ יש אופציה "אופטימלי מחסנית", אבל אם זה לא המקרה, בדיקה ידנית כדי לקבוע כמה צעדים נחוצים תמונות חפיפה כדי להגדיר תחזיות פרט כראוי. שני פרמטרים מכריעים הם החריר לבין המטרה; לקחת בחשבון "גדלה גבוהה, ברזולוציה יותר, ו- Z-צעדים דרושים יותר."
2. אָנָלִיזָה
   הערה: למרות מספר פרמטרים ניתן לנתח, צעד 7.2.1 מתמקד בשני: מורפולוגיה דנדריט ו האקסון הסתעפות. הורד פיג'י ( http://fiji.sc/ ).
   1. פתח את התמונה, בחר באפשרות "קו מקוטע" מהתפריט. צייר קו (נע מעלה ומטה לאורך הדואר Z- ציר ידי גלילה בעכבר) בעקבות מבנה הנוירון. יש להקליק על "לנתח, כלים, מנהל ROI, להוסיף" (לחלופין, לחץ על "t") כדי לשמור את הקו. חזור על תהליך זה עבור כל האקסון או הדנדריט של הנוירון ניתח ^2.
   2. בעיתונות תפריט מנהל ROI את "מדוד" כפתור כדי לקבל את אורך (או פרמטרים נוספים). לייצא את המדידות לקובץ טקסט או גיליון אלקטרוני לנתח אותם.

8. Electrophysiology

הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג קלטות נוכחיות מהדק כל תא משכבת ​​II / III נוירונים תא פירמידה לזהות בעין ידי ביטוי של GFP מוח עכבר-electroporated GFP (או כל חלבון פלואורסצנטי אחר electroporated בעבר). זהו והתאמת שיטות שפורסמו בעבר ^{17, 18.} שימוש בפרוטוקול זה אפשר לחקור את ההשפעה של modif גנטיication שהנהיג IUE על התכונות החשמליות של הנוירון. רכישת מצבי ירי ספציפיים היא תהליך הדרגתי של בידול המערב את הביטוי הדינמי של רפרטואר רחב של תעלות יונים וכי תוצאה הוא הביטוי של מצבי ירי חולף לפני שלבי לידה מאוחר. לדוגמא, תגובות חשמל בוגרת אינן שנצפו שכבה II / III של קליפת העכבר החושי לפני P16 ^{2, 19.}

1. תנאים מוקדמים עבור הפרוסות החריפות
   1. הכינו את כלי ניתוח סטרילי להסיר את המוח מן העכברים: גיליוטינה, כדי להסיר את הראש; מספריים קטנים, לחתוך דרך הגולגולת; מלקחיים, כדי להפריד את הגולגולת מרקמות; מרית, כדי להסיר מוח רקמות מן המעטפת שלה בעדינות; מבצעה מתכתי, כדי לנתח את הקליפה לשני חצאים שווים; פיפטה ו פסטר, להעביר פרוסות מן vibratome (ולהכניס אותם לתוך תמיסה המכילה מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF) לבדיקה, ולאחר מכן להעביר את הפרוסות מן ACSF לאזור החזקת דגירה).
   2. הכן 1 ליטר של ACSF באמצעות ומים ברמת טוהר גבוהה (מים פעמיים מזוקקים) המכיל 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO _3, 11 גלוקוז מ"מ, 2.5 KCl מ"מ, 1.2 מ"מ MgCl _2, 2.5 מ"מ CaCl _2, ו 1 מ"מ לאא ₂ PO _4. לכייל את pH 7.3 - 7.4 עם HCl או NaOH. התאם את osmolarity ל 290 mOsm.
   3. ACSF הבועה עם carbogen (95% O _2/5% CO ₂₎ במשך 15 - 20 דקות באמצעות צינורות טפלון (~ 1 מ"מ), כדי לייצב את pH 7.3 - 7.4.
   4. להקפיא 200 מ"ל של תמיסת ACSF רווי carbogen ב -80 מעלות צלזיוס במשך 10 - 15 דקות כדי ליצור פתרון לנתיחה עכור. מניחים צלחת בתרבית רקמה 100 x 20 מ"מ על הקרח עבור חיתוך במוח.
   5. הכן 100 מ"ל של פתרון 1% נמוך נקודת התכה agarose ממש לפני תחילת הניסוי. מצננים את הפתרון, לגזור חתיכת ריבוע של agarose (מידות: 1 x 1 x 0.5 מ"מ), ו דבק מגע אותואחורי של הפלטפורמה, ממש מאחורי שבו המוח הוא פרוס (ג'ל agarose מספק תמיכה עבור המוח במהלך חיתוך). הפוך את החזית שטוחה ככל האפשר.
2. קבלת פרוסות חריפות
   1. לשתק את העכבר להרדים אותו עם% isoflurane 2. מניחים את הראש לתוך הפתח הגיליוטינה לערוף אותו במהירות. סר הגולגולת שלה מהר ככל האפשר את השימוש של שומרי עצם או מלקחיים בסדר. מכניסים את המוח לתוך ACSF צונן.
      הערה: חשוב לבצע שלב זה מהר.
   2. מניח את המוח בצלחת התרבות הצוננת. לנתק את המוח הקטן עם מספריים קטנים.
   3. תרים את המוח עם מרית למחוק אותו יבש על מגבת נייר.
   4. מדביקים את המטוס ventrocaudal של המוח על בעל vibratome. מניח את הבעל על vibratome מלא ACSF קר כקרח.
   5. השג פרוסות חריפות על ידי חיתוך חלקי עטרה 300 מיקרומטר (להבטיח carbogenation ממשיך לאורך כל ההליך, למשל, להציב bubbler (1 מ"מצינור polytetrafluoroethylene) בחדר vibratome) תוך שימוש בהגדרות vibratome הבאים: משרעת 0.06 מ"מ ו 0.08 - מהיר 0.10 מ"מ / s. הגדר את מראש למהירות האפשרית האיטית ביותר (~ 22 s לכל מסירה). שינוי הגדרות אופטימליות אלה ולקבל תנאים אופטימליים עבור כל מכונה באופן אמפירי במידת הצורך.
   6. דגירה פרוסות חריפה למשך 60 דקות לפחות ב ACSF בתוספת -inositol מיו 3 מ"מ, חומצה אסקורבית 0.4 מ"מ, ו פירובט נתרן 2 מ"מ בעוד מבעבע עם 95% O _2/5% CO ₂ גז. לשמור על טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
   7. בצע את הליך החיתוך בתוך פחות מ -15 דקות. אם ירצה, את הפרוסות יכולות להיות מאוחסנות במשך 1 - 7 שעות לפני שהועבר לתא ההקלטה לשימוש.
3. תנאים מוקדמים עבור ההקלטה כל התא
   1. ודא כי תחנת אלקטרופיזיולוגיה מצוידת בתא הקלטה, מערכת זלוף, מיקרוסקופ, אלקטרודות (הקלטה, מגרה, קרקע), מקרו micromanipulators, עליון-שולחן נוקשה עמידות רעידות כלוב פאראדיי, ממריץ, מגבר ממיר אנלוגי-לדיגיטלי (A / D), מחשב עם תוכנת רכישה, וכן GFP (או כל fluorochrome אחר) לסנן לניתוח מהונדסים גנטיים נוירונים ¹⁸ (איור 2 א).
   2. הכן את הפתרון תאיים, המכיל גלוקונאט אשלגן 115 מ"מ, 2 מ"מ MgCl _2, 10 HEPES מ"מ, 20 מ"מ KCl, 4 מ"מ Na ₂ ATP, ו -0.3 מ"מ Na ₃ GTP, מותאם 7.2 pH ידי KOH ו 290 mOsm ידי KCl.
   3. הפוך טפטפות תיקון על ידי משייכת נימי זכוכית בורוסיליקט. כן אלקטרודות תיקון באמצעות חולץ micropipette. השתמש בורוסיליקט נימים (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, 0.86 מ"מ קוטר פנימי, אורך 10 ס"מ). הפוך אלקטרודות תיקון מראה התנגדויות של 3-10 MΩ כאשר התמלאו פתרון תאי.
   4. Perfuse לתא הקלטה עם ACSF בקצב של 2 mL / min. לשמור על הטמפרטורה של החדר בבית approximately 33 ° C.
4. הקלטת כל התא
   1. מעביר את הפרוסות לתוך תא ההקלטה בעזרת פיפטה פסטר (לנתק את הקצה הארוך) או מברשת קטנה. החזק את הפרוסה עם נבל. Perfuse את הפרוסות כל הזמן עם ACSF בקצב של 2 mL / min.
   2. תיקון נוירון GFP חיובי.
      1. מכניס את הפרוסה לתוך תא ההקלטה ולמצוא את תחומי העניין מבעד למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (10X). לאחר מכן, למצוא תא GFP חיובי לתקן באמצעות המטרה 60x.
      2. מלא את האלקטרודה ההקלטה עם פתרון תאי. השתמש מזרק צמוד מסנן (פילטר 4 מ"מ) ואת קצה מיקרו-מטעין למלא את האלקטרודה הקלטה עם פתרון תאיים.
      3. מניחים את פיפטה זכוכית מחזיק פיפטה. הנח את הקצה פיפטה באמבטיה ולהתמקד הקצה. ברגע פיפטה הוא באמבטיה, להפעיל לחץ חיובי דרך מערכת בקרת לחץ בחזרה.
      4. תיקון נוירון כי הוא פלורסנט (איור2B יור).
         1. מתקרב תא העניין תחת הדרכתו ויזואלי תוך שמירה בחזרה לחץ פיפטה. עם הופעת גומה קטנה על פני התא, לשחרר את הלחץ. בשלב זה, חותם חזק (התנגדות גדולה מ -1 GΩ) עלול להיוצר. אחרת, להחיל לחץ שלילי אור (יניקה) כדי להקל על זה.
         2. בעוד החותם מתהווה, להביא את מהדק ההחזקה מתח ל -60 mV. כאשר סוגר GΩ נוצר, להחיל דופק של יניקה כדי לקרוע את קרום התא מתחת פיפטה להיכנס למצב כל תא. ראה התייחסות ²⁰ לקבלת פרטים נוספים.
      5. רשום את הפעילות באמצעות התנאים הנוכחיים מהדק ^21. כאשר אתה במצב כל תא, להחליף מתשלום מהדק מתח למצב הנוכחי מהדק ולהתחיל להקליט. לדוגמה, כדי להקליט רגישות התא, להחיל 500 ms-ארוך depolarizing זריקות הנוכחית (100 - 400 PA).
         1. חשב את b שיעורי יריy התוויית מספר פוטנציאל פעולה לאורך הרכבת להגדלת זרמי קלט.
            הערה: פוטנציאל הממברנה מנוחה, התנגדות קלט, ו קיבול הממברנה עשויים גם להיות מחושב מן ההקלטות ^21.

כדי לאפיין את השינויים המורפולוגיים של נוירונים בפירוט וברחבי פיתוח, חיוני לתייג נוירונים בדלילות. מערכת Cre-recombinase בדילול מאפשרת את הביטוי של גן של עניין אוכלוסייה דלילה של נוירונים, כך שרק נוירונים אלה המשלבים אנזים זה להביע GFP (איור 1 א). באמצעות אסטרטגיה זו, שכבה II-III הוא ממוקד ומסומן על ידי IUE ב E15.5. CAG-DsRed2 ב 1 מיקרוגרם / μL, הוא-electroporated שיתוף כביקורת ולזהות מוח חיובי electroporated ב בעלי חיים. חשוב לציין, לאחר צביעה עם נוגדן אנטי- GFP, האות חזק מספיק כדי לאפשר את להדמיה ברורה של מורפולוגיות ו אקסונים הדנדריטים שלהם (איור 1D ו- E).

לאחר IUE ו אלקטרופיזיולוגיה, הניתוח של הפרמטרים המתקבלים כל תא הקלטות משמשים לשתףmpare תגובות הירי הרגיש של תאי electroporated בתנאים שונים. ניתן להשיג מספר פרמטרים. הפרמטרים צריכים להיות מותאמים במחקר המסוים באמצעות תוכנת ניתוח תיקון- clamp ספציפית. איור 2C מספק דוגמא העלילה של פוטנציאל הפעולה נגד זרם הקלט המתקבל קלטות של שכבת WT II-III נוירון כי היה electroporated ב E15.5.

איור 1. Cre-recombinase מדולל אסטרטגיה מאפשרת סימון דליל של נוירונים קליפתיים. סיכום סכמטי א של האסטרטגיה. בנוירונים כשברשותו שני CALNL-GFP ו CRE, הקלטת LoxP-STOP-LoxP הוא נכרת מתוך CALNL-GFP, ו- GFP מתבטא על ידי האמרגן CAG חזק. ב סכמטי ציור של נימי בורוסיליקט משך באמצעות חולץ micropipette. הטיפ נחתך על ידי FOrceps, יצירת זווית 30 °. מדוד 1 ס"מ מהקצה אל ההתחלה של החלק הצר יותר של נימי. תפקיד ג האלקטרודות למקד את הקליפה החושית. האלקטרודות הפלטינה ממוקמות כ מעל האוזניים של העובר. בשל המטען השלילי שלה, ה- DNA הולך לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר מוחל המתח. וריאציה עמדת אלקטרודות מאפשר מיקוד באזורים שונים במוח. תמונות ד המתקבלות לאחר וקטורים נמסרו הנוירונים בשכבה II-III על ידי electroporation ברחם ביום עוברי 15.5; חלקי עטרה נעשו ביום לידת 16. וקטור CAG-DsRed2 היה שיתוף transfected כביקורת (משמאל). GFP (באמצע) מתבטא רק בתאי העצב האלה כי גם שולבו Cre, המאפשר רקומבינציה של אתרי LoxP ב וקטור CALNL-GFP. התיוג הדליל מאפשר לתאי עצב יחידים להבחין (ראשי חץ). התמונה confocal א-בהגדלה גבוהה של tהוא הדנדריטים סוכות של אחר נוירון GFP שכותרתו בדלילות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. הגדרות Electrophysiology ודוגמא של תגובת ירי. תצלום א מראה את ההתקנה אלקטרופיזיולוגיה המשמשת בניסויים מהדקים תיקון פרוס חריף. ההתקנה כלולה בתוך כלוב פאראדיי למנוע רעש, ואת הציוד על גבי שולחן נגד רעידות. הבקרים של micromanipulators הממונע עבור אלקטרודות הם נצפו מהשמאל. ב פירמידליים נוירון של עכבר electroporated עם GFP, נצפתה תחת שדה בהיר ותנאי פלואורסצנטי ירוק. פיפטה ההקלטה המצורפת תא + GFP היא מורגשת. בר סולם = 10 & #181; מ. דפוסי ג ירי של CAG-GFP electroporated נוירון II-III השכבה מלאה מראה את התגובה הרגילה spiking הטיפוסית. התפלגות פוטנציאל פעולת קירוב על הפצה קבועה לאורך משך זרם כניסה (ציר ה- X). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: תנאי מתח אלקטרודות עבור Electroporation של עוברים.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתייג נוירונים של הקליפה החושית של עכברי C75BL / 6 כדי לנתח הקישוריות שלהם הרגישה שלהם. עם כל כבוד לשיטות קיימות, היא מדמיין היבטים להפלות של קישוריות, כגון מספר הסניפים אקסונלית לכל נוירון, הטופוגרפיה המדויקת שלהם, ואת המיקום האנטומי שלהם. על ידי שינוי המיקום של האלקטרודות, אפשר למקד אוכלוסיות נוירון אחרות, כגון קליפת cingulate (לשמור אותה הזווית בין אלקטרודות במוח, אבל לשנות את הכיוון של הקטבים) או ההיפוקמפוס ^5, ולבצע דומה ניסויי תיוג נוירונים בודדים או אוכלוסיות רחבות יותר, בהתאם לאסטרטגיה הרצויה. עם זאת, יש מגבלות על זה, כמו שלא כל האוכלוסיות נגישות באותה מידה או באותה מידה שכותרתו סלקטיבי. לדוגמה, בהיפוקמפוס, אפשר למקד באופן סלקטיבי תאי עצב מאוחר יליד האזור CA1, אבל EAelectroporation rly מסמן אוכלוסיות הטרוגניות של תאי פירמידליים פנימיים וחיצוניים. בקליפת המוח, הנוירונים נולדים באופן רציף, כך שביום ההיריון במהלך IUE קובע אילו שכבת קליפת המוח מושפע. ביצוע מטרות IUE מוקדם נוירונים עמוק (למשל, IUE ב E14 תוויות נוירונים IV שכבה) ^22.

במשך IUE מוצלח, מומלץ לשקול שיקולים מסוימים בחשבון. ראשית, חשוב לבצע את הניתוח בתוך פחות מ -30 דקות כדי להפחית את הלחץ על האם להגדיל את סיכויי ההישרדות של הגורים. שנית, החלק הקשה ביותר של ההליך הוא הזרקה של ה- DNA-לבצע את הזריקה באמצעות הנימים בורוסיליקט בעדינות ככל האפשר. אם עובר לחץ חזק מדי, הם יכולים להיפגע. במונחים של פתרון בעיות מותו של העוברים במהלך זריקות DNA, beveling קצה עם זווית 30 מעלות יכול להגדיל את היעילות של פרו זהסס. אם beveller אינו זמין ואת הנימים נחתכות אך ורק עם מלקחיים, את הזווית הנכונה יכולה להיות מאומתת מיקרוסקופ לנתח. בטל נימים לקויות. לבסוף, התאמת תנאי electroporation אל הבמה של העובר היא חשובה על מנת להגדיל את שיעור ההישרדות (ראה טבלה 1).

השיקולים חלקים נחוצים בכל הנוגע לשיקום אקסונים דנדריטים. כדי לתייג נוירונים בודדים, בריכוז הנאה פלסמיד Cre חיוני להשגת ביטוי טוב, דלילה וכדי למנוע את החפיפה של בלבול תחזיות עצביות השייכים נוירונים שונה. למרות בפרוטוקול זה מציע את השימוש של 4 ng / μL, זה עשוי להיות נחוץ כדי להתאים את ריכוז פלסמיד עבור כל ניסוי, בהתאם האמרגן בשימוש, איכות הכנת ה- DNA, ואת שיטת כימות DNA (למשל, לצמצם את זה 2 ng / μL אם תיוג נוירונים רבים מדי). בשנת additiעל, למעקב אקסונלית, חשוב לחתוך בזווית המתאימה כדי שיהיה הנוירון כולו באותו המטוס.

צעדים קריטיים עבור הקלטות תיקון- clamp מוצלחות על החוסן של הרקמה של הפרוסות החריפות ואת המיקום והשפע של נוירונים GFP החיובי electroporated. אם שלבי תיקון להיכשל או תגובות סוטות נמצאות במהלך ההקלטות, לצמצם את הזמן לעיבוד הפרוס החריף. אם הנוירונים GFP שקשה לזהות ולאתר בגלל שכיחותם המופחתת שלהם פרוסים החריף, להבטיח כי פלסמיד CAG-GFP מספיק נכלל בתמהיל electroporation. לגבי המגבלות העיקריות של הגישות המתוארות במסמך זה, טכניקת תיקון- clamp מאפשרת ההקלטה של ​​פרמטרים שונים רבים המתארים את הרגישות של הנוירון, אבל זה לא להעריך היבטים שתלויים המעגל כולו. כמו כן, ו כאמור לעיל, לא כל תת-אוכלוסיות נוירונים נגישים באמצעות IUE. לסיכום, הבעתיד דואר, טכניקות אלה יכולים לתרום לניתוח הנוסף של הקישוריות המבנית ותפקודית של תת-אוכלוסיות נוירונים שונים במוח.

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

אנו מודים ר 'גוטיירז וא מוראלס לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם ללוס אנג'לס וייס לעריכה. CGB ממומן על ידי דואר ספרדית Ministerio דה Ciencia Innovacion (MICINN), FPI-BES-2,012-056,011. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם BBVA קרן SAF2014-58598-JIN (MINECO) למ 'Navarrete ועל ידי מענק מטעם רמון Areces קרן ומענקים SAF2014-52119-R ו- BFU2014-55738-REDT (מ MINECO) כדי מ Nieto.