L'appauvrissement de l'ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

Un protocole d'ARN ribosomal épuisement (ARNr) a été développé afin d'enrichir l'ARN messager (ARNm) pour l'ARN-seq de la metatranscriptome intestin du moustique. Les sondes de prélèvement ARNr spécifiques, qui ont été utilisés pour retirer l'ARNr par soustraction, ont été créés à partir du moustique et ses microbes intestinaux. Performances du protocole peut entraîner la suppression d'environ 90-99% de l'ARNr.

L'intestin du moustique, accueille les communautés microbiennes dynamiques à travers les différentes étapes du cycle de vie de l'insecte. Caractérisation de la capacité génétique et la fonctionnalité de la communauté intestin permettra de mieux comprendre les effets du microbiote intestinal sur les traits de vie des moustiques. Métagénomique RNA-Seq est devenu un outil important pour analyser les transcriptomes de divers microbes présents dans une communauté microbienne. L'ARN messager comprend généralement que 1-3% de l'ARN total, tandis que ARNr constitue environ 90%. Il est difficile pour enrichir l'ARN messager à partir d'un échantillon d'ARN microbienne métagénomique, car la plupart des espèces d'ARNm procaryotes n'ont pas stables poly (A) des queues. Cela empêche oligo d (T) isolement d'ARNm médiée. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie échantillon dérivé ARNr des sondes de capture pour enlever ARNr partir d'un échantillon d'ARN total de métagénomique. Pour commencer, à la fois contre les moustiques et microbiennes petits et grands fragments d'ARNr sous-unités sont amplifiés à partir d'un échantillon d'ADN métagénomique communauté. Ensuite, la communautécommunautaires spécifiques biotinylés antisens ribosomique sondes d'ARN sont synthétisés in vitro en utilisant l'ARN polymérase T7. Les sondes biotinylées ARNr sont hybridées à l'ARN total. Les hybrides sont capturés par des billes revêtues de streptavidine et retiré de l'ARN total. Ce protocole basé sur la soustraction élimine efficacement à la fois contre les moustiques et l'ARNr microbienne de l'échantillon d'ARN total. L'échantillon enrichi en ARNm est ensuite traité pour l'amplification de l'ARN et ARN-Seq.

La technologie de séquençage de nouvelle génération a beaucoup progressé étude métagénomique en permettant d'évaluer la composition taxonomique et génétique d'une fonctionnalité associations microbiennes. Séquençage d'ARN (RNA-Seq) ¹ peut contourner culture à base de méthodes pour étudier metatranscriptomes microbiennes dans ^2-5 contextes différents. Un obstacle majeur à microbien ARN-seq est la difficulté à enrichir l'ARNm, comme les espèces d'ARNm procaryotes ne sont pas stable polyadénylé. Par conséquent, oligo d (T) l'enrichissement messager médiation n'est pas applicable. Suppression de l'ARNr abondante est une approche alternative pour enrichir l'ARNm. Trousses commerciales d'épuisement ARNr, comme Microexpress kit ARNm enrichissement bactérien (Ambion), RiboMinus Isolation Kit transcriptome (bactéries) (Life Technologies), et l'ARNm UNIQUEMENT kit d'isolation d'ARNm procaryote (Epicentre) qui dégrade préférentiellement ARNr avec une exonucléase, ont été utilisés de suppression de l'ARNr ^6-8. Cependant, les sondes de capture dans Microexpressou RiboMinus sont bons pour enlever ARNr connu de types de bactéries Gram-positives et Gram-négatives (voir les spécifications du fabricant), mais moins compatible avec les ARNr des microbes inconnus. Par conséquent, la suppression peut être moins efficace pour les ^8-10 des échantillons métagénomique. Par ailleurs, la fidélité abondance de l'ARNm était discutable lorsque le traitement a été appliqué exonucléase ^11. Dans l'ensemble, la soustraction basée sur l'appauvrissement de l'ARNr est moins biaisé et plus efficace dans l'enrichissement d'ARNm dans les paramètres métagénomiques ^10-13.

L'intestin du moustique, accueille une communauté microbienne dynamique ^14. Nous cherchons à caractériser la fonction du microbiome intestin du moustique en utilisant l'ARN-Seq. Dans un échantillon d'ARN isolés à partir des entrailles de moustiques, les deux ARN moustiques et des microbes sont présents. Ici, nous décrivons un protocole modifié d'utiliser des sondes ARNr communautaires spécifiques pour épuiser les ARNr efficacement les moustiques et microbienne par hybridation soustractive. L'ARNm résultantéchantillons enrichis sont appropriés pour l'ARN-Seq. Le flux global est représenté dans la figure 1.

Procédure

1. Élevage Mosquito

1. Arrière moustique Anopheles gambiae G3 souche dans un insectarium à 27,5 ° C avec une humidité de 80% et le cycle h 12:12 de lumière / obscurité.
2. Les larves se nourrissent de la nourriture pour chat au sol avec de la levure de bière avec un rapport de 1:1.
3. Nourrir les moustiques adultes sur le sang des souris au jour 3 post-levée pour la production d'œufs.

2. Dissection intestin du moustique

1. Outils de dissection autoclave (diapositives et des pinces).
2. Recueillir 50 moustiques à l'aide d'un aspirateur et placez-les sur le lit de CO débit ₂ (Ultimate Flypad). Rincer une éprouvette moustique séquentiellement dans trois boîtes de Pétri contenant de l'éthanol à 70% pour nettoyer la surface du corps des moustiques.
3. Placer l'échantillon sur une lame de verre sous un stéréomicroscope. Retirez le tube digestif.
4. Recueillir 50 tripes par condition pour l'isolation d'ADN métagénomique. Recueillir 50 tripes par condition d'isolement d'ARN métagénomique.

3. Isolement de l'ADN métagénomique

Remarque: l'ADN métagénomique est isolé en utilisant la méta-G-Nome ADN Isolation Kit (Biotechnologies Epicentre) avec la modification décrite ci-dessous.

1. Place 50, tripes de moustiques dans 300 pi de TE. Les homogénéiser pendant 1 min à l'aide de Bio-Gen PRO200 homogénéisateur (PRO Scientific Inc, États-Unis) à la vitesse de 2000 tours sur la glace.
2. Ajouter 2 ul de solution de lysozyme Prêt-Lyse et 1 pl de RNase A à la suspension cellulaire. Mélanger au vortex et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
3. Ajouter 300 ul de méta-Solution de Lyse (2X) et 1 ul de protéinase K dans le tube. Mélanger au vortex. Brièvement impulsions centrifuger le tube de sorte que l'ensemble de la solution est dans le fond du tube, et incuber à 65 ° C pendant 15 min, refroidir à température ambiante, puis mettre dans la glace pendant 3-5 min.
4. Ajouter 350 ul de réactif MPC Protein Precipitation au tube et vortexer vigoureusement pendant 10 secondes.
5. Pellet tIl débris par centrifugation pendant 10 min à 12000 xg à 4 ° C.
6. Transférer le surnageant dans un endroit propre de 2 ml tube et jeter le culot.
7. Ajouter 570 ul d'isopropanol au surnageant. Mélanger à la fois le tube retournant plusieurs.
8. Pellet l'ADN par centrifugation pendant 10 min à 12000 xg à 4 ° C. Retirer l'isopropanol sans déloger le culot d'ADN.
9. Ajouter 500 ul d'éthanol 75% à laver le culot. Centrifuger pendant 5 min à 12000 xg à 4 ° C. Éliminer l'éthanol sans perturber le culot d'ADN. Air sécher le culot à température ambiante pendant 2 min. Note: Ne pas trop sécher le culot d'ADN.
10. Remettre en suspension le culot d'ADN dans 50 pl de tampon TE.
11. Valider la taille de l'ADN isolé par rapport à l'ADN de contrôle fosmide (40 ko, 100 ng / ul) fourni dans le kit, par électrophorèse sur gel sur un gel d'agarose 1%.

4. Isolation d'ARN total

Remarque: Nettoyer la zone de travailavec RNaseZap pour minimiser la contamination de RNase. Métagénomiques ARN a été isolé à partir d'échantillons intestinaux moustiques en utilisant le réactif d'isolement Tripure (Roche) avec une modification mineure.

1. Mettre 50 tripes de moustiques dans un tube de 2 ml avec 500 ul de réactif Tripure isolement. Homogénéiser pendant 1 min à vitesse 2000 tours sur la glace à l'aide d'un homogénéisateur. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 min pour permettre la dissociation des complexes de nucléoprotéines.
2. Ajouter 100 ul de chloroforme et homogénéiser au vortex pendant 12 secondes et laisser reposer à température ambiante pendant 2 min.
3. Centrifuger à 10000 g pendant 10 min. Sortez soigneusement le tube sans déranger les phases ont été séparées.
4. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, ajouter 250 ul d'isopropanol, bien mélanger et mettre à -20 ° C pendant 20 min.
5. Centrifuger à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C à l'ARN précipité.
6. Jeter le surnageant sans déloger granulés. Laver le culot avec 750 ul d'éthanol à 75%.
7. Introduire à la pipette le surnageant sans déranger le culot. Air sécher le tube pendant 2 min.
8. Remettre en suspension l'ARN avec 30 pl d'eau nucléase libre.
9. Traiter les ARN totaux avec de la DNase à 37 ° C pendant 20 min, puis inactiver la DNase par incubation à 75 ° C pendant 15 min. ARN précipité avec de l'éthanol et remettre en suspension l'ARN dans 30 pl d'eau nucléase libre.
10. Déterminer la quantité d'ARN total en utilisant un NanoDrop.

5. Ribosomal RNA épuisement

Remarque: Le protocole a été élaboré sur la base des méthodes décrites précédemment ^12,13,15.

1. Amplification par PCR de l'ARN ribosomal fragments de gènes
   Cette étape crée pools d'échantillons spécifiques ARNr, qui seront utilisés comme modèles pour la transcription in vitro pour produire des anti-sens ARN ribosomal (arRNA) sondes qui sont complémentaires à l'ARNr de l'échantillon d'ARN total.
   1. Concevoir et synthétiser des ensembles d'amorces pour l'ARNr fragment de PCR (tableau 1).
   2. Exécuter PCR dans 50réaction ul utilisant l'ADN polymérase Taq (Qiagen) avec 50 ng de matrice d'ADN, 1 x tampon PCR, 1,5 mM Mg ₂ Cl, 0,2 uM amorces avec 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 10 sec, 15 sec de recuit à 40 ° C pour bactérienne amplicon 23S et 50 ° C pour les amplicons d'autres, et s'étendant à 72 ° C pendant 1 min (extension finale à 72 ° C pendant 5 minutes).
   3. Voir les produits de PCR sur gel d'agarose 1%.
   4. Purifier produits de PCR utilisant le kit de purification de PCR QIAquick avec élution dans 50 ul de tampon d'élution. Quantifier la concentration en utilisant NanoDrop.
2. La transcription in vitro de la biotine-sondes marquées ARNr anti-sens (arRNA). Remarque: Dans cette étape, les sondes de prélèvement spécifiques des différents amplicons d'ARNr sont synthétisés en utilisant le kit MEGAscript T7.
   1. Mettre en place une réaction de 20 ul pour chaque amplicon spécifique ARNr de l'échantillon en mélangeant les ingrédients ci-dessous (Tableau 2). Incuber une nuit à 37 ° C. Remarque: en général, les rendements de réaction> 50 pg d'ARN.
   2. Ajouter 1 ul de DNase I (inclus dans le kit) à la réaction et incuber à 37 ° C pendant 20 min pour éliminer la matrice d'ADN.
   3. Ajouter 100 ul d'éthanol à 100% pour la réaction, centrifugeuse à 12.000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour précipiter synthétisé arRNA. Rejeter le surnageant et laver le culot avec 750 ul d'éthanol à 75%. Remettre les sondes d'ARN dans 50 pi d'eau nucléase libre.
   4. Quantifier la concentration d'ARN en utilisant une NanoDrop. Sondes Conserver à -80 ° C.
3. ARNr soustraction avec biotinylé arRNA. Remarque: Cette étape utilise le arRNA biotinylé de s'hybrider à l'ARNr de l'échantillon d'ARN total. Les hybrides ARNr arRNA sont capturés par la streptavidine billes magnétiques revêtues. La procédure est basée sur le protocole décrit dans la référence 13 avec des modifications mineures.
   1. Réactifs
      1. Préparer NaOH 0,1 N, 20X chlore de sodiumide-citrate (SSC) et 1 X SSC avec 20% de formamide.
   2. Hybridation
      1. Mélanger 1 ug d'ARN total avec 16S et 23S sondes (0,75 pg chacun), 18S moustiques et les sondes 28S (0,75 mg chacune), 1 inhibiteur de RNase, 2,5 pl 20X tampon SSC, 10 ul de formamide à 100% dans un 200 tube de PCR ul , ajouter eau sans nucléase à 50 pi.
      2. Placer le tube de réaction dans un thermocycleur et incuber à 70 ° C pendant 5 minutes pour ouvrir la structure secondaire et de descente de la rampe 25 ° C en utilisant 5 ° C par incréments de 1 min chacune ° C pour permettre l'hybridation de sondes d'ARNr et arRNA.
   3. Suppression de l'ARNr
      1. Transfert 300 pi billes revêtues de streptavidine dans un tube de 1,7 ml. Placer le tube sur une grille de séparation magnétique pour immobiliser les billes. Retirer le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 300 ul de NaOH 0,1 N et mix bien. Placer le tube arrière du rack magnétique et pipeter le surnageant. Remettre en suspension les perles dans 300 pi de SSC 1X, mélangez bien, immobiliser les billes et pipeter le surnageant. Répéter le lavage avec 300 pl de 1X SSC une fois de plus.
      2. Assurez-3 aliquotes de perles, 100 ul chacun, dans 1,7 ml tubes. Placer le tube sur le support magnétique, et retirer le surnageant par pipetage. Remarque: Les aliquotes de perles sont utilisées pendant 3 rounds de capture biotinylés ARNr arRNA hybrides.
      3. Ajouter 50 ul 1X SSC avec 20% de formamide dans la réaction de 50 ul hybridation. Transférer la réaction dans le tube aliquote premier talon, et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux biotinylés sonde ARNr hybrides à être capturés par des billes de streptavidine. Balayez le tube toutes les 2 minutes pour mélanger pendant l'incubation.
      4. Placer le tube sur le support magnétique pour immobiliser les billes, transférer le surnageant de la seconde aliquot de perles, bien mélanger et incuber comme ci-dessus. Effectuer la capture troisième surnageant par transfert dans le troisième tube de perles. Mélanger et incuber.
      5. Transfert non-ARNr surnageant dans un nouveau tube et la purification conduite en utilisant RNeasy kit MinElute pour enlever le formamide suivant le manuel du fabricant.
      6. Contrôler l'efficacité de l'appauvrissement de l'ARNr en utilisant un Agilent RNA 6000 Pico Kit de puce sur une Bioanalyzer (figure 4).

Remarque: Les ARNr appauvri d'échantillons d'ARN sont soumis à l'ARNm d'amplification si nécessaire ^8.

Le protocole comprend trois sections: (1) la préparation de matrices d'ADN métagénomique pour l'ARNr PCR, (2) la création d'échantillonnage des sondes spécifiques de l'ARNr de capture, (3) l'épuisement de l'ARNr de l'ARN total par hybridation soustractive. Isolation de haute qualité métagénomique ADN et l'ARN est essentielle pour l'ensemble du processus. Le protocole modifié Meta-G-Nome isolement de l'ADN de haute qualité donne ADN métagénomique de viscères de moustiques, comme le montre la figure 2. Il peut être difficile d'isoler de haute qualité à partir de l'ARN total tripes moustiques. Cela est probablement dû à la présence d'enzymes diverses, y compris la RNase, dans les entrailles de moustiques. Nous avons comparé les performances d'extraction d'ARN total du kit Qiagen isolement d'ARN à Roche Tripure. Électrophérogramme d'Agilent Bioanalyzer analyse a montré que l'ARN total isolé à l'aide Tripure contient clairs pics d'ARNr (figure 3), ce qui n'est pas vu dans l'ARN obtenu en utilisant le kit Qiagen. Peut-être dérivée moustique-RNase est inactiver efficacementd par le phénol dans Tripure. En règle générale, un rendement de 50 moustiques tripes ~ 20 pg d'ARN total. La quantité idéale de l'ARN total des intrants pour le processus ARNr épuisement actuel est d'environ 1 mg, ce qui optimise l'efficacité de l'ARNr soustraction et donne environ 150 ng d'ARN purifié. La figure 4 montre la comparaison des électrophérogrammes ARN avant et après soustraction ARNr. L'ARNr été éliminée efficacement tandis que les espèces non-ARNr ont été considérablement enrichi dans l'ARN restantes. La présence d'ARN de grande taille (> 2.000 pb) indique une bonne qualité de l'ARNm enrichi (figure 4B). Le protocole peut être adapté pour accueillir une plus grande participation de l'ARN pour le traitement. Généralement 5 ug d'ARN est requis pour le processus de l'ARN-seq. Par conséquent, nous avons utilisé MessageAmp II-Les bactéries kit d'amplification d'ARN pour produire une quantité suffisante d'ARNr appauvri ARN de l'ARN-Seq. Nous vous recommandons d'utiliser 150 ng d'ARN purifié ou plus pour l'amplification de l'ARN pour s'assurer de la fidélité de l'amplification. Ce protocole a été applIED à un intestin du moustique RNA-Seq projet. L'épuisement ARNr a effectivement été réalisé en utilisant des sondes de capture d'échantillons dérivés. Tableau 3 indique le pourcentage de l'ARNr lit dans la sortie RNA-Seq des quatre échantillons. Deux sucre nourris et deux échantillons de sang intestinale nourris ont été traités de l'épuisement et de l'ARN-Seq. Le séquençage Illumina généré 23-24M lectures pour chaque échantillon. La soustraction ARNr effectivement retiré ARNr 90-99% du tissu à la fois contre les moustiques et les microbes dans les échantillons d'intestin. L'épuisement était presque complète dans les échantillons intestinaux de sucre nourris, et l'ARNr de 6.12 à 10.98% sont restés dans le sang nourris échantillons (tableau 3).

Jeux d'amorces Tableau 1. D'ARNr 16S d'amplification de fragments bactériens et 23 amorces sont conçues sur la base de ^20,19. Séquences promoteur T7 sont en gras.

Tableau 2. Composants de synthèse in vitro de sondes d'ARNr.

Tableau 3. Stattiques de l'ARNr se lit dans l'ARN-seq sortie. SM: sucre nourris intestin; BM: gut sang nourris. *: La somme des pourcentages de moustiques ARNr et microbienne ARNr lit.

Figure 1. Organigramme montrant les étapes de la procédure de l'ADN métagénomique et l'isolement d'ARN, la synthèse d'ARNr sonde de capture, de l'hybridation et de capturer des perles épuisement base.

Figure 2. Isolement de l'ADN métagénomique. Échantillons d'ADN ont été séparés sur un gel d'agarose 1%. 1, fosmide ADN (40kb) 2, l'ADN métagénomique Mosquito intestin.

Figure 3.Comparaison de deux réactifs d'isolement d'ARN totaux pour leur efficacité dans l'extraction d'un ARN de qualité de l'intestin des moustiques. Superposition de électrophérogrammes montre que l'ARN total de l'isolement Tripure (en bleu) des pics d'ARNr et large distribution d'ARN, alors que celle de l'isolement Qiagen (en rouge) avait pas de pics d'ARNr claires.

Figure 4. Efficacité de l'ARNr épuisement. Électrophérogrammes montrer l'ARN total avant (A) et après (B) l'épuisement ARNr. Les pics d'ARNr ont été éliminés efficacement. ARN supérieure à 4kb reste dans ARNr appauvri échantillon. La concentration d'ARN est 107,6 ng / ul dans (A) et 8,6 ng / ul dans (B).

Une communauté microbienne complexe réside dans l'écosystème intestin du moustique, ^14,16,17. Metatranscriptomic séquençage (ARN-seq) peut révéler des informations de contexte dépend fonctionnelle en interrogeant la totalité du transcriptome ^4,18 microbienne. Techniquement, oligo-d (T) d'enrichissement de l'ARNm procaryote médiation n'est pas applicable en raison de l'absence de stabilité poly (A) queues des messagers. Alternativement, l'appauvrissement de l'ARNr a été utilisé pour l'enrichissement de l'ARNm. Ici, nous avons développé un protocole basé sur la soustraction d'épuiser ARNr utilisant des sondes ARNr fabriqués à partir de l'ADN métagénomique très propre dans la communauté microbienne intestin du moustique. L'efficacité de l'élimination ARNr dépend de la couverture des sondes de capture d'ARNr qui sont générés par la PCR ARNr. L'efficacité de recuit d'apprêt différents ensembles de cibler les régions conservées varie selon les taxons différents ^19. Par conséquent, nous vous recommandons d'essayer différentes combinaisons d'amorces sur des échantillons metagénomiques, puis mise en commun desproduits ARNr de maximiser la couverture. Dans notre procédure, nous créons des sondes de capture en combinant ARNr produits de PCR de deux avant et deux amorces inverses, qui peuvent former 4 combinaisons de paires d'amorces (tableau 1). En outre, l'ARNr entend former une structure secondaire. Par rapport à l'ARNr pleine longueur en tant que sondes ^13, des fragments d'ARNr petites ont moins tendance à former une structure secondaire, ce qui peut faciliter l'hybridation des sondes de capture à l'ARNr de l'échantillon. Les sondes biotinylées efficacement s'hybrider à l'ARNr de l'échantillon d'ARN total et les hybrides sont éliminés par capture avec des billes revêtues de streptavidine. La procédure supprime la plupart des ARNr (figure 4). Au cours des quatre échantillons que nous avons traitées, 90-99% de l'ARNr a été effectivement épuisés (tableau 3). Cette procédure peut encore être modifié pour une variété d'études sur le microbiome insectes associés.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Ce travail a été soutenu par le NIH subvention 1SC2GM092789-01A1, et MS était un érudit de la recherche NMSU Howard Hughes Programmes Établissement de recherches médicales de premier cycle. La vidéo a été réalisé et produit par Amy Lanasa et coordonné par le Dr Philip Lewis avec le Creative Media Institute à NMSU.