Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial para la biología sintética, estudiando los complejos proteína-proteína, y caracterizando y aprovechando las vías biosintéticas. En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible. Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. En este caso, un conjunto de cuatro vectores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K y pMGX-hisK, con el marcador seleccionable de resistencia a la ampicilina o la kanamicina (A y K) y que poseen o carecen de una hexahistidina N-terminal Etiqueta (su) se describen. Se proporcionan protocolos detallados para la construcción de operones sintéticos usando este sistema vectorial junto con los datos correspondientes, mostrando que un sistema basado en pMGX que contiene cinco genes puede ser fácilmente construido y usado para producir las cinco proteínas codificadas en Escherichia coli . Este sistemaEm y el protocolo permite a los investigadores a rutinariamente expresar complejos módulos de múltiples componentes y vías en E. coli .

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial, particularmente en las aplicaciones de biología sintética, donde se deben expresar múltiples módulos funcionales ¹ ; En el estudio de complejos proteína-proteína, donde la expresión y la función a menudo requieren co-expresión ^{2 , 3} ; Y en la caracterización y el aprovechamiento de las vías biosintéticas, en las que cada gen en la vía debe expresarse ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Se han desarrollado varios sistemas para la co-expresión, particularmente en el organismo huésped Escherichia coli , el caballo de trabajo para la expresión de proteínas recombinantes en laboratorio ⁹ . Por ejemplo, se pueden usar múltiples plásmidos con diferentes marcadores seleccionables para expresar proteínas individuales utilizando una gran cantidad de diferentes ex Vectores de presión ^{10 , 11} . Los sistemas individuales de plásmido para la expresión de múltiples proteínas han utilizado múltiples promotores para controlar la expresión de cada gen ^{10 , 12} ; Operones sintéticos, donde múltiples genes se codifican en un solo transcrito ^{2 , 13} ; O, en algunos casos, un solo gen que codifica un polipéptido que se procesa en última instancia proteolíticamente, produciendo las proteínas deseadas de interés ¹⁴ .

Figura 1: Flujo de trabajo pMGX mostrando la construcción de un vector policistrónico. El sistema pMGX proporciona una estrategia flexible y fácil de usar para la construcción de operones sintéticos bajo el control de un promotor T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible ( Figura 1 ). Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. Se basa en un sistema de plásmidos, originalmente llamado pKH22, que se ha utilizado con éxito para un número de diferentes aplicaciones ^{6 , 7 , 8} . En este caso, este conjunto de plásmidos se amplía para incluir cuatro vectores relacionados: pMGX-A, un vector de expresión que carece de etiquetas C o N-terminales y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-hisA, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-K, un vector de expresión lMarcar cualquier marcador C o N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina; Y pMGX-hisK, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina. En este estudio, se demuestra el método para generar un vector policistrónico que contiene cinco genes usando el sistema pMGX, específicamente pMGX-A, junto con la producción exitosa de cada proteína individual en Escherichia coli .

1. Obtención de genes de interés

1. Diseño de genes sintéticos.
   1. Optimizar una secuencia génica para la expresión de E. coli .
   2. Elimine cualquier sitio de restricción problemático de la secuencia (AvrII, NdeI, EcoRI y XbaI).
   3. Incorporar sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5'-NdeI y un sitio 3'-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido seleccionado ( Figura S1 - S4 ). Si se desea, incluir una etiqueta de codificación 5 'o 3' para la detección de transferencia Western.
   4. Ordena comercialmente el gen diseñado.
   5. Tanto el clon contundente del gen en un vector romo usando un kit de clonación contundente, según las instrucciones del fabricante; Diseñar cebadores para amplificar el gen (luego proceda a la Etapa 1.2.2); O añadir los extremos 5 'y 3' adicionales para la clonación directa en un plásmido pMGX y proceder al Paso 2. Aquí, thLos resultados representativos son de clonación contundente de los genes de interés.
2. Amplificar el gen deseado (a partir de un gen sintético diseñado y optimizado o de ADN molde que contenga el gen deseado) ¹⁵ .
   1. Diseño de cebadores con sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5'-NdeI y un sitio 3'-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido seleccionado ( Figura S1 - S4 ). Si se desea, incluya una etiqueta de codificación 5 'o 3' para la detección de transferencia Western.
   2. PCR amplificar el gen deseado ¹⁵ .
   3. Analizar la PCR por electroforesis en gel de agarosa [ ^16] .
   4. Si hay amplificación inespecífica, limpiar el gen amplificado por extracción de gel. Si no, utilice un kit de limpieza enzimática.
   5. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro comprobando el absorbancE a 260 nm; En blanco con tampón de elución ¹⁷ .

2. Clonación de genes de interés en un sistema de expresión multigénico Vector, pMGX ¹⁸

1. La restricción digiere el gen obtenido de interés y el vector deseado, pMGX, con NdeI y EcoRI.
   NOTA: Si se obtiene una gran cantidad de plásmidos recircularizados, permita que la reacción NdeI continúe durante 1 h antes de añadir EcoRI.
   1. Utilizar una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN y 1 μl de cada enzima con 4 μl del tampón 10x apropiado.
   2. Para un digesto de NdeI y EcoRI, utilice tampón EcoRI y primero añada endonucleasa NdeI. Recuento durante 1 h a 37 ° C. Luego, añada la endonucleasa EcoRI, y permita que la digestión continúe durante una hora adicional. NdeI es sensible a las divisiones cerca del final del ADN, por lo que la digestión inicial por EcoRI puede prevenir la digestión eficaz por NdeI.
2. ElectrOphorese la digestión de restricción en gel de agarosa (para un gen de 1 kb, use un gel de agarosa al 0,7% a 110 V durante 55 min, para seleccionar el porcentaje de gel de agarosa para diferentes tamaños de genes, consulte la referencia ¹⁶ .
3. Inserte las bandas del inserto y del vector usando un bisturí limpio o una cuchilla de afeitar y coloque el segmento de gel extirpado en un tubo de 1,5 ml.
4. Extraer el ADN del gel de agarosa usando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Ligar el gen de interés en el vector pMGX usando una relación de inserto a vector de 3: 1; Establecer una ligación negativa de pMGX digerido sin el inserto.
   1. Se prepara una reacción de ligadura de 20 μL que contiene 1 μl de ADN ligasa T4, 0,15-0,5 μg de ADN vector (~ 5 μl) y una cantidad apropiada de inserto basada en una relación inserto-vector de 3: 1 y el tamaño de El gen que se inserta; Las espinas dorsales pMGX tienen entre 5,312 y 5,504 pb de tamaño. Incluir una reacción de control negativo que contiene todo buT el gen que se está insertando. Asegúrese de que la cantidad de ADN vector es equivalente en la ligación de control negativo y en las reacciones de ligamiento de inserto más vector.
6. Transformar reacciones de ligación en células de E. coli químicamente competentes XL1-Blue y plásmidos ligados pMGX- yfg1 (que contiene el gen de interés 1), pMGX- yfg2 (que contiene el gen de interés 2) ... pMGX- yfgn (que contiene el gen de interés n). Use técnica aséptica (dentro de un gabinete de bioseguridad o bajo una llama).
   1. Descongelar 100 μL de alícuotas de E. coli XL1-Blue químicamente competente en hielo durante 5 min y luego añadir 5 μl de las reacciones de ligación. Incubar durante 30 minutos en hielo.
   2. Calentar el calor de las células durante 45 s en un baño de agua se mantiene a 42 ° C y luego añadir 200 μ l de frío LB. Incubarlos en hielo durante 2 min.
   3. Agitar las células a 37 ° C, 220 rpm durante 1 h y luego extender la placa de 100 μL sobre una placa de LB-agar que contiene unMarcador seleccionable apropiado (ya sea ampicilina o kanamicina).
7. Examinar los clones de los transformantes positivos.
   1. Comparar los recuentos de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Se desea una proporción de recuento de colonias mayor que 1: 2. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al Paso 2.1 y revise la nota.
   2. Se seleccionan 4-8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de cada reacción de ligación de los diferentes genes insertados para el cribado (1 n) e inoculan un LB de 4 ml y el cultivo / colonia individual de antibiótico durante la noche. Cultivar los cultivos durante la noche con agitación a 37 ° C y 220 rpm.
   3. Aislar el ADN del plásmido usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   4. Se prepara una reacción de digestión con NdeI + EcoRI de 20 μl que contiene 150-500 ng de ADN y 1 μl de cada enzima con 2 μl del tampón 10x apropiado. EnEs caso, añadir NdeI y EcoRI al mismo tiempo que el gen de interés estará entre los sitios de restricción. Se recomienda un control negativo con el vector pMGX vacío. Se realiza la digestión durante 2 ha 37 ° C en un baño de agua.

3. Inserción del gen 2 en el vector pMGX que contiene el gen 1, pMGX- yfg1

1. Restriction digerir pMGX- yfg1 con AvrII y tratar con fosfatasa intestinal de ternera (CIP).
   1. Utilice una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN vectorial (~ 5-10 μL de ADN aislado) y 1 μl de AvrII con 4 μl del tampón 10x apropiado. Digerir durante 1,5 h a 37 ° C y luego añadir 1,5 μ l de CIP. Dejar a 37 ° C durante 30 minutos más.
2. Restriction digerir pMGX- yfg2 con AvrII y XbaI para liberar el gen de interés.
   1. Utilizar una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN y 1 μ; L de cada enzima con 4 μl del apropiado tampón 10x. Digerir durante 2 h a 37 ° C.
3. La restricción electroforosa se digiere sobre un gel de agarosa de porcentaje (0,7%) y elimina las bandas de inserto y vector usando un bisturí limpio / cuchilla de afeitar (consulte los pasos 2.2-2.3).
4. Extraer el ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante y cuantificar el ADN ¹⁷ .
5. Ligate gen 2 en pMGX- yfg1 utilizando una proporción de inserto a vector de 3: 1. Establezca una ligación negativa de pMGX - yfg1 digerido sin el inserto adicional. Configure como se indica en el Paso 2.5.
6. Transformar 5 μL de las reacciones de ligación en células de E. coli químicamente competentes de XL1-Blue, plasmidos ligados pMGX- yfg1,2 (que contienen el gen de interés 1 y 2) y control negativo de pMGX- yfg1 , como se observa en el Paso 2.6.
7. Comparar el recuento de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Una proporción de recuento de colonias gMás de 1: 2. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al Paso 3.1 y revise el tratamiento con CIP.
8. Se seleccionan 4-8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de la reacción de ligación e inoculan 4 mL de LB más el antibiótico apropiado por colonia individual y crecen durante la noche a 37ºC y 220 rpm.
9. Aislar el ADN plasmídico utilizando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante y cuantificar el ADN ¹⁷ .
10. Examinar la inserción efectiva del segundo gen mediante la realización de una digestión de restricción de pMGX- yfg1,2 con EcoRI.
    1. Utilizar una reacción digestiva de 20 μL que contenga 150-500 ng de ADN y 1 μl de enzima EcoRI con 2 μl de tampón EcoRI 10x. Digerir durante 2 h a 37 ° C.
11. Electroforese el digesto de restricción en un gel de agarosa de porcentaje apropiado; Busca una banda que correspondaS al tamaño del gen 2 (véase el paso 2.2). Un gen puede insertarse en el vector en la orientación no deseada, invertida.

4. Adición de un tercer gen en el vector pMGX que contiene los genes 1 y 2, pMGX- yfg1,2

1. Restriction digerir pMGX- yfg1,2 con AvrII y tratar con CIP, como se ve en el paso 3.1.
2. Restriction digerir pMGX- yfg3 con AvrII y XbaI, como se ve en el paso 3.2.
3. La electroforesis de la restricción se digiere en un gel de porcentaje de agarosa apropiado y en inserciones de inserto y bandas de vectores usando una cuchilla limpia de bisturí / navaja; Consulte los pasos 2.2-2.3.
4. Extraer el ADN del gel de agarosa utilizando un kit de extracción de gel y cuantificar el ADN ¹⁷ .
5. Ligar el gen 3 en pMGX- yfg1,2 usando una relación de inserto a vector de 3: 1 y establecer una ligación negativa de pMGX - yfg1,2 digerido sin un inserto adicional, como se observa en el Paso 3.5.
6. Transformar 5 μL de las reacciones de ligación en XLCélulas de E. coli químicamente competentes de 1-Blue, plásmido ligado pMGX- yfg1,2,3 (que contiene genes de interés 1, 2 y 3), y control negativo de pMGX- yfg1,2 , como se observa en el Paso 2.6.
7. Comparar el recuento de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al paso 4.1 y revise el tratamiento con CIP.
8. Seleccionar de 4 a 8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de la reacción de ligación e inocular 4 ml de LB más el antibiótico apropiado por colonia individual; Crecen durante la noche a 37 ° C y 220 rpm.
9. Aísle el ADN plasmídico usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante.
10. Examinar la inserción efectiva del tercer gen mediante la realización de una digestión de restricción de pMGX- yfg1,2,3 con EcoRI, como se observa en el Paso 3.10.
11. Electroforese el digesto de restricción en un gel de agarosa de porcentaje apropiado; MiraPara bandas que corresponden a los tamaños del gen 2 y del gen 3 (véase el paso 2.2). Nota: el gen 3 puede insertarse en el vector en la orientación invertida no deseada. Si los genes 2 y 3 son del mismo tamaño, se debe seleccionar otro sitio de digestión de restricción apropiado para el cribado.
    NOTA: Repita según sea necesario para cada nuevo gen.

5. Producción de proteínas de interés utilizando un sistema de expresión multigénico y evaluación de la producción mediante Western Blot

1. Transforma el clon positivo que contiene todos los genes de interés en E. coli de producción de proteína químicamente competente, tal como BL21- (λDE3).
   1. Descongelar 100 μL de alícuotas de E. coli BL21- (λDE3) químicamente competente sobre hielo durante 5 min y luego añadir 1 μl del ADN del plásmido clonado positivo; Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
   2. Calentar térmicamente las células durante 45 s en un baño de agua mantenido a 42 ° C y luego añadir 200 μ l de frío LB. Incubar en hielo durante 2 min.
   3. Agitar las células a 37ºC y 220 rpm durante 1 h y luego extender la placa 100 mu l sobre una placa de LB - agar que contiene el marcador seleccionable apropiado (ya sea ampicilina o kanamicina).
2. Expresar la proteína por inducción de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).
   1. Seleccionar una colonia aislada de la placa de transformación B21- (λDE3) e inocular 4 mL de LB más el antibiótico apropiado; Crecen durante la noche, agitando a 37 ° C y 220 rpm.
   2. Inocular una LB de 100 mL más el cultivo antibiótico apropiado usando 1 mL de cultivo durante la noche.
   3. Crecer a 37 ° C con agitación a 220 rpm a un OD ₆₀₀ de 0,6.
   4. Inducir el cultivo con 100 μ M IPTG y crecer durante 15 horas a 25 ° C y 220 rpm.
   5. Eliminar 1 ml del cultivo y centrifugarlo a 13.000 xg durante 1 min; Desechar el sobrenadante.
3. Lyse las células utilizando solución de lisis según las instrucciones del fabricanteY preformar una transferencia Western del lisado celular soluble para determinar si todas las proteínas fueron producidas con éxito [ ^19] .

En este estudio, el objetivo era co-expresar cinco proteínas de un solo plásmido. Los fragmentos de gen sintéticos optimizados con cinco codones que codifican etiquetas de hexahistidina N- o C-terminal se compraron comercialmente. Los genes sintéticos se amplificaron por PCR y se clonaron individualmente en un vector PCR-blunt y se secuenciaron. Para generar el plásmido policistrónico, los cinco genes de interés se clonaron primero en un plásmido pMGX adecuado, pMGX-A. La Figura 2 muestra PCRBluntyfg1 y PCRBluntyfg2 además de pMGX-A digerido con NdeI + EcoRI (véase el Paso 2). Para clonar los dos primeros genes en pMGX-A, el plásmido fue digerido con NdeI + EcoRI ( Figura 2 ). Tras la clonación de los genes de interés en pMGX-A, los plásmidos recién construidos, denominados pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2 , se digirieron con AvrII + XbaI para confirmar que se obtuvieron clones exitosos, comoMostrado en las bandas de 1,1 kb y 1,3 kb obtenidas en la Figura 3 .

Figura 2: Clonación de plásmidos pMGX. En un gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) se muestran los resultados esperados de los plásmidos de PCR blunt que contienen yfg1 y yfg2 después de la digestión con NdeI + EcoRI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, PCRBluntyfg1 ; Carril 3, PCRBluntyfg2 ; Pista 4, control de pMGX - A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Selección de pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2. El gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) muestra Las dos bandas que son generadas por ambos pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2 después de la digestión con AvrII + XbaI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX - yfg1 ; Carril 3, pMGX - yfg2 ; Pista 4, control de pMGX - A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con ambos genes en el vector pMGX apropiado, se construyó el plásmido policistrónico. Para generar el plásmido pMGX- yfg1,2 , pMGX- yfg1 se digirió con AvrII, como se muestra en la Figura 4 . PMGX- yfg2 se digirió con AvrII + XbaI, y el gen de 1,3 kb que contenía el fragmento se ligó en el sitio AvrII de pMGX - yfg1 linealizado, generando pMGX- yfg1,2 . La digestión de pMGX- yfg1,2 con EcoRI confirmó la clonación exitosa del plásmido deseado y se muestra en> Figura 5.

Figura 4: Generación del plásmido bicistrónico pMGX - yfg1,2. Resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) de pMGX- yfg1 digerido con AvrII y pMGX- yfg2 digerido con AvrII + XbaI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX- yfg1 digerido con AvrII; Carril 3, pMGX- yfg2 digerido con AvrII + XbaI; Pista 4, control de pMGX - A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Selección de clones pMGX - yfg1,2 . El gel de agarosa al 0,7% resultante (110 V, 55 min) de pMGX - yfSe muestran g1,2 clones digeridos con EcoRI. Los clones exitosos generarán dos bandas, una para el gen yfg2 insertado y la otra para el backbone + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX- yfg1,2 digerido con EcoRI, clon 1; Carril 3, pMGX- yfg1,2 digerido con EcoRI, clon 2; Pista 4, control de pMGX - A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuando se genera un plásmido policistrónico que contiene dos o más genes, se puede encontrar una inserción invertida indeseable del gen clonado en el sitio AvrII. La Figura 6 es un gel que resalta la diferencia entre los resultados de un plásmido digerido con un gen insertado en la orientación correcta en oposición a un gen que se inserta en la orientación inversa. Si el gen esLigados y clonados en la orientación no deseada, el sitio EcoRI al final del gen se insertará justo al lado del sitio EcoRI del gen anterior. Esto daría un tamaño de fragmento que es prácticamente indetectable por electroforesis en gel de ADN (menos de 50 pb). Además, el último gen insertado aparecería en la columna vertebral, que es fácilmente identificable debido a que el tamaño de la columna vertebral es mayor de lo esperado. La diferencia en el tamaño de la columna vertebral del tamaño esperado indicará el tamaño del último gen insertado.

Figura 6: Selección de clones pMGX - yfg1-5 . Se muestra un gel de agarosa al 1,3% (110 V, 65 min) que representa los resultados de pMGX- yfg1-5 digerido con EcoRI. Los clones exitosos (carril 2) generarán una banda correspondiente al último gen insertado ( yfg5 en este caso, 1,1 kb). LanE 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, clon positivo de pMGX- yfg1-5, digerido con EcoRI; Carril 3, clon negativo de pMGX- yfg1-5, digerido con EcoRI; Pista 4, control de pMGX - yfg1 - 4 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para completar el gen de cinco genes de expresión polycistronic, los tres genes restantes fueron clonados uno tras otro en pMGX- yfg1,2 para generar pMGX- yfg1-5 (véase el paso 5). Este plásmido se transformó a continuación en BL21- (λDE3), y la expresión de las proteínas se indujo en un cultivo de fase de registro medio mediante la adición de IPTG. La Figura 7 es una transferencia Western de lisados ​​celulares, que confirma que se pueden expresar las cinco proteínas de un solo plásmido que contiene múltiples genes en un solo operón. La expresión de pMGX - yfg1 (que contiene 1 gen),PMGX- yfg1,2 (que contiene 2 genes), y pMGX- yfg1-5 (que contiene 5 genes).

Figura 7: Análisis de Western blot de la expresión de múltiples genes usando el sistema pMGX. La incorporación de marcadores de hexahistidina N- o C-terminales permitió la detección de transferencia de Western de la expresión de proteína. Las muestras se separaron en geles de acrilamida sin deformación de gradiente 4-20% pre-moldeados (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm), y después una transferencia (40 V, 90 min) sobre una membrana de nitrocelulosa (0,45 μm, 10 cm x 7 cm). Se usó anticuerpo monoclonal anti-His conjugado con HRP, que no requiere un anticuerpo secundario. Los tampones de bloqueo, transferencia y de dilución de anticuerpos se prepararon según lo recomendado por el fabricante de anticuerpos. La detección se realizó con Western Chemiluminescent HRP substrato siguiendo las instrucciones del fabricanteTrucciones. La membrana resultante se visualizó utilizando un generador de imágenes sin filtro. Carril 1, patrón de doble color transferido sobre la membrana (no quimioluminiscente); Carril 2, His6pMGX - yfg1 ; Carril 3, His6pMGX - yfg1,2 ; Carril 4, His6pMGX - yfg1 - 5. Nota: La proteína producida por yfg5 es del mismo tamaño que la proteína producida por yfg1 (ambos son de 36 kDa) y no puede separarse en el gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figuras suplementarias: Haga clic aquí para descargar este archivo.

La co-expresión de múltiples genes es cada vez más esencial, en particular en la caracterización y reconstitución complejas, multigénicas vías metabólicas [ ^{3 , 4 , 5]} . El sistema pMGX hace co-expresión multigén en la rutina ^de E. coli ^{6 , 7 , 8} y accesible a diversos investigadores. En este estudio, se demostró que cinco proteínas de interés se producían simultáneamente a partir de un único sistema de plásmido usando pMGX-A. Muchos sistemas de coexpresión actualmente disponibles sólo permiten la inserción de dos genes, generando plásmidos bicistrónicos tales como los vectores pET Duet ¹² . Si se requiere la adición de más genes, se requieren múltiples vectores bicistrónicos con diferentes marcadores seleccionables. En contraste con otros sistemas de expresión multigénicos, el sistema pMGX permite la fácil clonaciónDe múltiples genes en un plásmido, con la capacidad de reutilizar sitios de restricción sin la necesidad de diferentes plásmidos donantes o para eliminar múltiples sitios de enzimas de restricción de los genes [ ^{13 , 14]} . Los pasos críticos en este protocolo incluyen el diseño de genes, la prevención de la recircularización de fondo de vectores pMGX digeridos individualmente y las pantallas de los vectores policistrónicos para la orientación correcta del gen insertado.

Al planificar la estrategia de clonación para construir un sistema policistrónico, es esencial asegurar que los genes de interés no contienen sitios de restricción requeridos para la clonación aguas abajo. En particular, éstos incluyen XbaI y AvrII, que son necesarios para la inserción del segundo y posteriores genes en el vector pMGX que contiene el primer gen de interés (Etapas 3 y 4). Además, es esencial eliminar los sitios de restricción que se utilizarán para la clonación inicial del gDe interés en pMGX (Etapa 2). Típicamente, éstos incluyen NdeI o NheI en el extremo 5 'del gen y BamHI o EcoRI en el extremo 3' del gen, aunque también se pueden usar otros sitios de restricción para esta etapa, si es necesario. La eliminación de sitios de restricción adicionales no deseados puede realizarse fácilmente en la etapa de síntesis de genes o, en el caso de genes clonados de otras fuentes, mediante sustituciones de nucleótidos sinónimas mediante mutagénesis dirigida ²⁰ .

La adición de genes posteriores de interés en pMGX que contiene el primer gen de interés requiere la linealización de pMGX- yfg1 con AvrII (Etapa 3.1, nota que también se puede linealizar con XbaI). Este vector linealizado se volverá a religar rápidamente durante la inserción del segundo gen de interés (Etapa 3.5), dando lugar a un número extremadamente elevado de clones de fondo. Para evitar esto, es esencial tratar el vector linealizado con una fosfatasa para desfosforilar el 5 2; Extremos del vector linealizado. Normalmente, CIP se utiliza, aunque otros están disponibles. La optimización tanto de las unidades de fosfatasa como del tiempo de incubación puede ser necesaria para optimizar las ligaciones de genes posteriores de interés en el vector linealizado.

Por último, al generar un sistema policistrónico, el gen de interés se excita inicialmente por digestión con XbaI y AvrII, generando extremos cohesivos complementarios en los extremos 5 'y 3' del gen (Etapas 3.2 y 4.2). Este inserto puede ser ligado en el vector linealizado en la dirección hacia delante o hacia atrás. Como todos los extremos cohesivos son idénticos, no se impone direccionalidad a través del recocido complementario de los extremos cohesivos. Por lo tanto, es necesario tamizar los clones resultantes para la dirección de inserción correcta del gen de interés. Esto puede hacerse fácilmente mediante la selección de clones con uno de los sitios de restricción usados ​​para clonar el gen original de interés en pMGX (Etapa 2). Típicamente,Se usa EcoRI, ya que el sitio de restricción está en el extremo 3 'del gen, y por lo tanto es apropiado examinar la direccionalidad, como se muestra en la Figura 6 . En la mayoría de los casos, el 50% de los clones que contienen el gen de interés tienen el gen en la orientación correcta y el 50% tienen el gen en la orientación opuesta.

Con poca frecuencia (~ 10% de ligaciones), todos los clones de una ligación particular pueden tener el gen de interés insertado en una sola dirección. Este resultado parece ser dependiente de la secuencia, ya que es altamente reproducible en estos casos específicos. Si esto ocurre, y el gen de interés se está insertando continuamente en la orientación inversa, normalmente se puede acceder al vector deseado cambiando la dirección de clonación. Por ejemplo, en lugar de clonar yfg2 en el sitio AvrII de pMGX- yfg1 , yfg1 puede clonarse en el sitio XbaI de pMGX- yfg2 . Obsérvese que esto da el vector final idénticosistema. Esta mayor flexibilidad que permite el acceso al mismo sistema desde diferentes estrategias de clonación es altamente ventajosa.

Una limitación importante de esta metodología es que las proteínas codificadas en el extremo 3 'de la transcripción policistrónica se expresan típicamente a niveles inferiores a las proteínas codificadas en el extremo 5' de la transcripción y este efecto es más pronunciado cuanto más larga sea la transcripción . Esto significa que el cambio del orden de los genes de interés en el operón sintético puede afectar los niveles relativos de expresión de las proteínas que codifican, proporcionando un mecanismo para ajustar los niveles relativos de expresión.

En resumen, el sistema pMGX proporciona un método fiable para la co-expresión de múltiples proteínas a partir de un solo plásmido en E. coli , que puede usarse para una variedad de aplicaciones de biología sintética y para la caracterización de vías bioquímicas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.