可诱导T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

该研究描述了使用pMGX质粒系统在大肠杆菌中使用单个质粒的多个基因的T7介导的共表达的方法。

多重蛋白质的共表达对于合成生物学，研究蛋白质 - 蛋白质复合物以及表征和利用生物合成途径来说日益重要。在该手稿中，描述了在可诱导T7RNA聚合酶的控制下使用高效系统来构建多基因合成操纵子。该系统允许许多基因从一个质粒同时表达。这里，一组四个相关载体pMGX-A，pMGX-hisA，pMGX-K和pMGX-hisK与氨苄青霉素或卡那霉素抗性选择性标记（A和K）和具有或缺少N-末端六组氨酸标签（他）被披露。使用该载体系统构建合成操纵子的详细方案与相应的数据一起提供，显示含有五个基因的基于pMGX的系统可以容易地构建并用于在大肠杆菌中产生所有五种编码的蛋白质。这个系统em和协议使研究人员能够在大肠杆菌中常规表达复杂的多组分模块和途径。

多重蛋白质的共表达越来越重要，特别是在合成生物学应用中，其中必须表达多个功能模块¹ ;在研究蛋白质 - 蛋白质复合物时，其中表达和功能通常需要共表达^2,3 ;并且在表征和利用生物合成途径时，其中通路中的每个基因必须表达为4,5,6,7,8。已经开发出许多用于共表达的系统，特别是在宿主生物体大肠杆菌中 ，实验室重组蛋白表达的工作马⁹ 。例如，具有不同选择标记的多个质粒可用于使用大量不同的ex压迫矢量^10,11 。用于多重蛋白表达的单个质粒系统已经使用多个启动子来控制每个基因的表达^10,12 ;合成操纵子，其中多个基因编码在单个转录物2,13上;或者在一些情况下是编码最终被蛋白水解处理的多肽的单个基因，产生所需的期望的蛋白质¹⁴ 。

图1:显示多顺反子载体构建的pMGX工作流程。 pMGX系统为可诱导T7启动子控制下的合成操纵子的构建提供了一种灵活的，易于使用的策略。e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg"target ="_ blank">请点击此处查看此图的较大版本。

在该手稿中，描述了在诱导型T7RNA聚合酶（ 图1 ）的控制下使用高效系统来构建多基因合成操纵子。该系统允许许多基因从一个质粒同时表达。它基于质粒系统，原来称为pKH22，已被成功应用于许多不同的应用^6,7,8 。在这里，扩增该质粒组包括四个相关载体:pMGX-A，缺少任何C-或N-末端标签的表达载体和氨苄青霉素抗性标记; pMGX-hisA，编码N-末端六组氨酸标签和氨苄青霉素抗性标记的表达载体; pMGX-K，表达载体l检测任何C-或N-末端标签和卡那霉素抗性标记物;和pMGX-hisK，编码N-末端六组氨酸标签的表达载体和卡那霉素抗性标记。在本研究中，使用pMGX系统（特别是pMGX-A）产生含有五个基因的多顺反子载体的方法与大肠杆菌中每种单独蛋白质的成功产生一起被证明。

获得感兴趣的基因

1. 设计合成基因。
   1. 优化大肠杆菌表达的基因序列。
   2. 从序列（AvrII，NdeI，EcoRI和XbaI）中除去任何有问题的限制性位点。
   3. 纳入克隆的限制性位点建议使用5'-NdeI位点和3'-EcoRI位点。必要时可以使用其他网站;指选择的质粒的多克隆区（ 图S1 -S4 ）。如果需要，包括用于Western印迹检测的5'或3'编码标签。
   4. 商业命令设计的基因。
   5. 根据制造商的说明书，使用钝性克隆试剂盒将基因平滑克隆到钝性载体中;设计引物扩增基因（然后进行到步骤1.2.2）;或者添加另外的5'和3'末端直接克隆到pMGX质粒中，并进行到步骤2e代表性的结果来自钝性克隆感兴趣的基因。
2. 扩增所需基因（来自设计和优化的合成基因或含有所需基因的模板DNA）。
   1. 设计具有克隆限制性位点的引物;建议使用5'-NdeI位点和3'-EcoRI位点。必要时可以使用其他网站;指选择的质粒的多克隆区（ 图S1 -S4 ）。如果需要，包括用于Western印迹检测的5'或3'编码标签。
   2. PCR扩增所需基因¹⁵ 。
   3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR。
   4. 如果存在非特异性扩增，则通过凝胶提取来清除扩增的基因。如果没有，请使用酶清洁套件。
   5. 通过检查吸光度，用分光光度计定量DNAe在260nm;用洗脱缓冲液¹⁷空白。

2.将感兴趣的基因克隆到多基因表达系统载体中，pMGX ¹⁸

1. 用NdeI和EcoRI限制性消化获得的目的基因和所需载体pMGX。
   注意:如果获得大量的再循环质粒，则允许NdeI反应在添加EcoRI之前进行1小时。
   1. 使用含有0.5-1.5μgDNA的40μL消化反应和1μL每种酶与4μL适当的10x缓冲液。
   2. 对于NdeI和EcoRI消化，使用EcoRI缓冲液，首先加入NdeI内切核酸酶。在37°C消化1小时。然后加入EcoRI内切核酸酶，并使消化进行一个小时。 NdeI对接近DNA末端的裂解敏感，所以EcoRI的初步消化可以防止NdeI的有效消化。
2. ELECTR对琼脂糖凝胶进行限制性消化（对于1 kb基因，在110V下使用0.7％琼脂糖凝胶55分钟;选择不同基因大小的琼脂糖凝胶的百分比，参见参考文献¹⁶ 。
3. 使用干净的手术刀或剃刀刀片将切口插入物和载体条带放置在1.5 mL管中。
4. 使用凝胶提取试剂盒根据制造商的方案从琼脂糖凝胶中提取DNA。
5. 使用3:1插入片段向量比例将感兴趣的基因连接到pMGX载体中;建立消化的pMGX阴性结扎，无需插入。
   1. 设置20μL连接反应，其中含有1μLT4 DNA连接酶，0.15-0.5μg载体DNA（〜5μL）和适量的插入物，基于3:1插入物载体比例和插入基因; pMGX骨架的大小在5,312和5,504 bp之间。包括一个负面控制反应，包含一切but插入的基因。确保载体DNA的量在阴性对照连接和载体加插入连接反应中相当。
6. 将连接反应转化入XL1-Blue化学感受态大肠杆菌细胞和连接质粒pMGX- yfg1 （含有感兴趣的基因1），pMGX- yfg2 （含有感兴趣的基因2）... pMGX- yfgn （含有感兴趣的基因n）。使用无菌技术（生物安全柜内或火焰下）。
   1. 将化学感受态XL1-Blue 大肠杆菌的 100μL等分试样在冰上解冻5分钟，然后加入5μL连接反应。在冰上孵育30分钟。
   2. 在保持在42℃的水浴中将细胞热休克45秒，然后加入200μL冷LB。在冰上孵育2分钟。
   3. 在37℃，220rpm下摇动细胞1小时，然后将板100μL铺展到含有正常的LB-琼脂平板优选选择标记（氨苄青霉素或卡那霉素）。
7. 筛选阳性转化体的克隆。
   1. 比较阴性对照和结扎板上的菌落数。需要大于1:2的菌落计数比。如果阴性对照板上存在大量的菌落，请返回步骤2.1并查看该记录。
   2. 从插入用于筛选的不同基因（1n）的每个连接反应中选择4-8个单独的菌落（取决于阴性对照:连接比率），并接种4mL LB和适当的抗生素过夜培养物/个体菌落。在37℃和220rpm下振荡培养过夜。
   3. 使用质粒DNA分离试剂盒根据制造商的方案分离质粒DNA。
   4. 设置20μLNdeI + EcoRI消化反应，含有150-500 ng的DNA和1μL的每种酶，2μL适当的10倍缓冲液。在情况下，在感兴趣的基因将在限制性位点之间的同一时间添加NdeI和EcoRI。建议使用空的pMGX载体的阴性对照。在37℃的水浴中消化2小时。

3.将基因2插入到含有基因1的pMGX载体中，pMGX- yfg1

1. 用AvrII限制性消化pMGX- yfg1并用小牛肠磷酸酶（CIP）处理。
   1. 使用含有0.5-1.5μg载体DNA（〜5-10μL分离的DNA）和1μLAvrII的40μL消化反应物与4μL适当的10x缓冲液。在37℃下消化1.5小时，然后加入1.5μLCIP。在37°C下放置另外30分钟。
2. 用AvrII和XbaI限制性消化pMGX- yfg2以释放感兴趣的基因。
   1. 使用含有0.5-1.5微克DNA和1微升的40μL消化反应; L每个酶用4μL适当的10倍缓冲液。消化2小时37°C。
3. 电泳限制性消化在合适的百分比（0.7％）琼脂糖凝胶上，并使用干净的手术刀/剃刀刀片切除插入物和载体条带（参见步骤2.2-2.3）。
4. 使用凝胶提取试剂盒根据制造商的方案提取DNA，并定量DNA ¹⁷ 。
5. 使用3:1插入到载体比例将基因2引导到pMGX- yfg1中 。设置消化的pMGX- yfg1的阴性结扎，无需额外插入。在步骤2.5中设置如上。
6. 将5μL连接反应转变成XL1-Blue化学感受态大肠杆菌细胞，连接质粒pMGX- yfg1,2 （含有感兴趣的基因1和2）和阴性pMGX- yfg1对照，如步骤2.6所示。
7. 比较阴性对照和连接板上的菌落数。菌落计数比g需要1:2以上。如果阴性对照板上存在大量的菌落，请返回到步骤3.1并检查CIP处理。
8. 从连接反应中选择4-8个单独的菌落（取决于阴性对照:连接比例），并接种4mL LB加上每个菌落合适的抗生素，并在37℃和220rpm下生长过夜。
9. 使用质粒DNA分离试剂盒根据制造商的方案分离质粒DNA并定量DNA ¹⁷ 。
10. 通过用EcoRI进行pMGX- yfg1,2的限制性消化，筛选第二基因的有效插入。
    1. 使用含有150-500ng DNA的20μL消化反应和1μLEcoRI酶与2μLEcoRI 10x缓冲液。消化2小时37°C。
11. 在适当的百分比琼脂糖凝胶上电泳限制性消化;寻找一个对应的乐队s到基因2的大小（参见步骤2.2）。基因可以以不期望的反向取向插入载体中。

4.将第三个基因添加到含有基因1和2的pMGX载体中，pMGX- yfg1,2

1. 使用AvrII限制性消化pMGX- yfg1,2并用CIP处理，如步骤3.1所示。
2. 使用AvrII和XbaI限制性消化pMGX- yfg3 ，如步骤3.2所示。
3. 在适当的百分比琼脂糖凝胶上电泳限制性消化，并使用干净的手术刀/剃刀刀片切除插入物和载体条带;请参阅步骤2.2-2.3。
4. 使用凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中提取DNA，并定量DNA ¹⁷ 。
5. 使用3:1插入到载体比例将基因3引导到pMGX- yfg1,2中，并建立消化的pMGX- yfg1,2的阴性结合，而不需要另外的插入物，如步骤3.5所示。
6. 将5μL的连接反应转化为XL1-Blue化学感受态大肠杆菌细胞，连接的质粒pMGX- yfg1,2,3 （含有感兴趣的基因1,2和3）和阴性pMGX- yfg1,2对照，如步骤2.6所示。
7. 比较阴性对照和连接板上的菌落数。如果阴性对照板上存在大量的菌落，请返回到步骤4.1并检查CIP处理。
8. 从连接反应中选择4-8个单独的菌落（取决于阴性对照:连接比例），并接种4mL LB加上每个菌落合适的抗生素;在37℃和220rpm下生长过夜。
9. 使用质粒DNA分离试剂盒根据制造商的方案分离质粒DNA。
10. 通过用EcoRI进行pMGX- yfg1,2,3的限制性消化，筛选第三种基因的有效插入，如步骤3.10所示。
11. 在适当的百分比琼脂糖凝胶上电泳限制性消化;看对应于基因2和基因3的大小的条带（参见步骤2.2）。注意:基因3可以以不期望的反向取向插入载体。如果基因2和3的大小相同，则必须选择另一个适当的限制性消化位点进行筛选。
    注意:根据需要重复每个新基因。

5.使用多基因表达系统生产感兴趣的蛋白质，并通过Western Blotting评估生产

1. 将含有所有感兴趣的基因的阳性克隆转化为化学感受态的蛋白质生产大肠杆菌如BL21-（λDE3）。
   1. 将化学感受态的BL21-（λDE3） 大肠杆菌的 100μL等分试样在冰上解冻5分钟，然后加入1μL的阳性克隆质粒DNA;在冰上孵育30分钟。
   2. 在42℃的水浴中将细胞热休克45秒，然后加入200μL冷LB。在冰上孵育2分钟。
   3. 在37℃和220rpm下摇动细胞1小时，然后将板100μL铺板到含有适当选择标记（氨苄青霉素或卡那霉素）的LB-琼脂平板上。
2. 通过异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达蛋白质。
   1. 从B21-（λDE3）转化板中选择一个分离的菌落，接种4 mL LB加合适的抗生素;生长过夜，在37℃和220rpm下摇动。
   2. 使用1mL过夜培养物接种100mL LB加适当的抗生素培养物。
   3. 在37℃下以220rpm摇动生长至OD ₆₀₀为0.6。
   4. 用100μMIPTG诱导培养，并在25℃和220rpm下生长15小时。
   5. 取1 mL培养液，以13,000 xg离心1 min;丢弃上清液。
3. 按照制造商的说明使用裂解液溶解细胞并预处理可溶性细胞裂解物的蛋白质印迹，以确定所有蛋白质是否成功生产¹⁹ 。

在这项研究中，目标是共同表达来自单个质粒的五种蛋白质。编码N-或C-末端六组氨酸标签的五密码子优化的合成基因片段商购。通过PCR扩增合成基因，并单独克隆到PCR平片载体中并进行测序。为了产生多顺反子质粒，首先将5个感兴趣的基因克隆到合适的pMGX质粒pMGX-A中。 图2显示除了用NdeI + EcoRI消化的pMGX-A之外的PCRBlunt- yfg1和PCRBlunt-yfg2（参见步骤2）。为了将前两个基因克隆到pMGX-A中，用NdeI + EcoRI消化质粒（ 图2 ）。将感兴趣的基因克隆到pMGX-A中后，用AvrII + XbaI消化新构建的质粒pMGX- yfg1和pMGX- yfg2 ，以证实获得成功的克隆，如如图3所示的1.1-kb和1.3-kb带。

图2:pMGX质粒的克隆。在0.7％琼脂糖凝胶（110V，55分钟）上显示用NdeI + EcoRI消化后含有yfg1和yfg2的PCR 平坦质粒的预期结果。泳道1，1 kb DNA梯;泳道2，PCRBlunt- yfg1 ;泳道3，PCRBlunt- yfg2 ;泳道4，pMGX-A对照。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3:筛选pMGX- yfg1和pMGX- yfg2。 0.7％琼脂糖凝胶（110V，55分钟）显示在用AvrII + XbaI消化后由pMGX- yfg1和pMGX- yfg2产生的两个条带。泳道1，1-kb DNA梯;第2道，pMGX- yfg1 ;泳道3，pMGX- yfg2 ;泳道4，pMGX-A对照。 请点击此处查看此图的较大版本。

使用合适的pMGX载体中的两个基因构建多顺反子质粒。为了产生质粒pMGX- yfg1,2 ，用AvrII消化pMGX- yfg1 ， 如图4所示。用AvrII + XbaI消化pMGX- yfg2 ，将含有该片段的1.3-kb基因连接到线性化的pMGX- yfg1的AvrII位点，产生pMGX- yfg1,2 。用EcoRI消化pMGX- yfg1,2证实了所需质粒的成功克隆，并显示于其中>图5。

图4:产生双顺反子质粒pMGX- yfg1,2。用AvrII消化的pMGX- yfg1和用AvrII + XbaI消化的pMGX- yfg2的0.7％琼脂糖凝胶电泳结果（110V，55分钟）。泳道1，1-kb DNA梯;泳道2，用AvrII消化的pMGX- yfg1 ;泳道3，用AvrII + XbaI消化的pMGX- yfg2 ;泳道4，pMGX-A对照。 请点击此处查看此图的较大版本。

图5:筛选pMGX- yfg1,2克隆。得到的0.7％琼脂糖凝胶（110V，55分钟）的pMGX- yf显示用EcoRI消化的g1,2克隆。成功的克隆将产生两个带，一个用于插入的基因yfg2 ，另一个对应于骨架+ yfg1 （ pMGX-yfg1 ）。泳道1，1 kb DNA梯;泳道2，用EcoRI消化的pMGX- yfg1,2克隆1;泳道3，用EcoRI消化的pMGX- yfg1,2克隆2;泳道4，pMGX-A对照。 请点击此处查看此图的较大版本。

当产生含有两个或更多个基因的多顺反子质粒时，可能遇到克隆到AvrII位点的基因的不期望的反向插入。 图6是突出了以与以相反方向插入的基因相反的以正确取向插入的基因的消化质粒的结果之间的差异的凝胶。如果基因是以不想要的方向连接并克隆，基因末端的EcoRI位点将插入紧邻先前基因的EcoRI位点。这将产生几乎不能通过DNA凝胶电泳（小于50bp）检测到的片段大小。此外，最后插入的基因将出现在骨架中，由于骨架尺寸大于预期，因此其易于识别。骨架尺寸与预期尺寸的差异将指示最后插入基因的大小。

图6:筛选pMGX- yfg1-5克隆。显示了描述用EcoRI消化的pMGX- yfg1-5的结果的1.3％琼脂糖凝胶（110V，65分钟）。成功的克隆（泳道2）将产生与最后插入的基因相对应的条带（在这种情况下为yfg5 ，为1.1kb）。兰e 1，1-kb DNA梯;泳道2，用EcoRI消化的pMGX- yfg1-5的阳性克隆;泳道3，用EcoRI消化的pMGX- yfg1-5的阴性克隆;泳道4，pMGX- yfg1-4对照。 请点击此处查看此图的较大版本。

为了完成五基因多顺反子表达载体，将剩下的三个基因一个接一个地克隆到pMGX- yfg1,2中，以产生pMGX- yfg1-5 （参见步骤5）。然后将该质粒转化到BL21-（λDE3）中，通过加入IPTG在对数中期培养中诱导蛋白质的表达。 图7是细胞裂解物的蛋白质印迹，证实可以表达来自单个操纵子中含有多个基因的单个质粒的所有五种蛋白质。 pMGX- yfg1 （含1个基因），显示pMGX- yfg1,2 （含有2个基因）和pMGX- yfg1-5 （含有5个基因）。

图7:使用pMGX系统的多基因表达的Western印迹分析。掺入N-或C-末端六组氨酸标签使蛋白质表达蛋白印迹检测。将样品在预制的4-20％梯度无菌丙烯酰胺凝胶（200V，35分钟，10cm×8.5cm）上分离，然后转移（40V，90分钟）到硝酸纤维素膜（0.45μm， 10cm×7cm）。使用不需要第二抗体的HRP缀合的抗His单克隆抗体。阻断，转移和抗体稀释缓冲液由抗体制造商推荐制备。根据制造商的说明，使用Western Chemiluminescent HRP底物进行检测tructions。使用没有过滤器的成像器显现所得到的膜。泳道1，双色标准转移到膜上（不化学发光）;泳道2，His6pMGX- yfg1 ;泳道3，His6pMGX- yfg1,2 ;第4道，His6pMGX- yfg1-5。注意:由yfg5产生的蛋白质与yfg1 （均为36 kDa）产生的蛋白质相同，不能在凝胶上分离。 请点击此处查看此图的较大版本。

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多个基因的共表达越来越重要，特别是在复杂的多基因代谢途径^3,4,5的表征和重建中。 pMGX系统在大肠杆菌常规6,7,8中进行多基因共表达^，并可以由不同的研究人员访问。在本研究中，显示了使用pMGX-A的单个质粒系统同时产生了5种目的蛋白质。目前可获得的许多共表达系统仅允许插入两个基因，产生双顺反子质粒例如pET Duet载体¹² 。如果需要添加更多的基因，则需要具有不同选择标记的多个双顺反子载体。与其他多基因表达系统相反，pMGX系统允许轻松克隆的多个基因转移到一个质粒中，具有重新利用限制性位点而不需要不同供体质粒或从基因^13,14去除多个限制酶位点的能力。该方案的关键步骤包括基因设计，预防单次消化的pMGX载体的背景再环化，以及多顺反子载体筛选插入基因的正确取向。

在规划克隆策略以构建多顺反子系统时，必须确保感兴趣的基因不含有下游克隆所需的限制性位点。特别地，这些包括将第二和后续基因插入含有第一感兴趣基因的pMGX载体中所需的XbaI和AvrII（步骤3和4）。此外，必须消除将用于g的初始克隆的限制性位点pMGX感兴趣的内容（步骤2）。通常，这些包括基因5'末端的NdeI或NheI以及基因3'末端的BamHI或EcoRI，尽管如果需要，其它限制性位点也可用于该步骤。在基因合成阶段或在其他来源克隆的基因的情况下，可以通过定点突变²⁰进行同义核苷酸取代来轻松地消除额外的不需要的限制性位点。

将感兴趣的后续基因添加到含有第一感兴趣的基因的pMGX中需要用AvrII线性化pMGX- yfg1 （步骤3.1;注意它也可以用XbaI线性化）。这种线性化载体在插入第二感兴趣基因（步骤3.5）期间将快速连接，导致极高数量的背景克隆。为了避免这种情况，必须用磷酸酶处理线性化载体使5'脱磷酸化2;线性化矢量的末端。通常，使用CIP，尽管其他可用。磷酸酶的单位和孵育时间的优化可能是必需的，以优化所关注的后续基因的连接到线性化载体中。

最后，当产生多顺反子系统时，最初通过用XbaI和AvrII消化来切除感兴趣的基因，在基因的5'和3'末端产生互补的粘性末端（步骤3.2和4.2）。该插入物可以向前或向后连接到线性化矢量中。由于所有的粘性末端是相同的，所以通过粘性末端的互补退火不会导致方向性。因此有必要筛选所得克隆以获得所需基因的正确插入方向。通过用克隆目的基因的限制性位点之一筛选克隆到pMGX（步骤2）可以容易地完成。通常情况下，使用EcoRI，因为限制性位点在基因的3'末端，因此适当的筛选方向性， 如图6所示。在大多数情况下，含有目的基因的50％的克隆具有正确取向的基因，50％的基因具有相反的方向。

很少（约10％的结扎），来自特定连接的所有克隆可能只有一个方向插入感兴趣的基因。这个结果似乎是顺序依赖的，因为在这些具体情况下它是高度可重复的。如果发生这种情况，并且感兴趣的基因以相反方向连续插入，通常可以通过切换克隆方向来访问所需的载体。例如，不是将yfg2克隆到pMGX- yfg1的AvrII位点，而是可以将yfg1克隆到pMGX- yfg2的XbaI位点。注意，这给出相同的最终向量系统。这增加了灵活性，使得可以从不同的克隆策略访问相同的系统是非常有利的。

该方法的一个重要限制是在多顺反子转录物3'末端编码的蛋白质通常以比转录本5'末端编码的蛋白质更低的水平表达，而且这个作用更加明显， 。这意味着改变合成操纵子中感兴趣的基因的顺序可以影响它们编码的蛋白质的相对表达水平，提供微调相对表达水平的机制。

总之，pMGX系统提供了一种从大肠杆菌中单个质粒共表达多种蛋白质的可靠方法，可用于各种合成生物学应用和生物化学通路表征。

作者没有什么可以披露的。

这项工作得到加拿大自然科学与工程研究理事会的支持。