Quelle: Labor von Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

Säulenchromatographie ist eines der nützlichsten Techniken zur Reinigung von Verbindungen. Diese Technik nutzt eine stationäre Phase, die in einer Spalte verpackt ist, und einer mobilen Phase, die der Spalte durchläuft. Diese Technik nutzt die Unterschiede in der Polarität zwischen Verbindungen, so dass die Moleküle facilely getrennt werden. ¹ die beiden häufigsten stationäre Phasen für die Säulenchromatographie sind Silica-Gel (SiO₂) und Aluminiumoxid (Al₂O₃), mit den am häufigsten verwendeten mobile Phasen werden organische Lösungsmittel. ² die Solvent(s) für die mobile Phase gewählt sind abhängig von der Polarität der Moleküle, die geläutert. In der Regel erfordern mehr polaren Verbindungen mehr polare Lösungsmittel um den Durchgang von Molekülen durch die stationäre Phase zu erleichtern. Sobald der Reinigungsprozess abgeschlossen ist kann die gesammelten Fraktionen mit einem Drehverdampfer isolierte Material liefern das Lösungsmittel entfernt werden.

Die Probe-Mischung ist auf der Oberseite der Spalte platziert und auf der Oberseite der stationären Phase aufgenommen. Anschließend wird die mobile Phase auf die Spalte angewendet und verwendet, um die Mischung durch die stationäre Phase eluieren. Säulenchromatographie nutzt ein Molekül Polarität um die Verbindungen zu trennen. Der Unterschied in der Polarität führt zu Abweichungen in der Rate, mit der die Moleküle durch die Säule, Reisen, die effektiv die Verbindungen voneinander trennt. Die mobile Phase wird in kleine Brüche in den Reagenzgläsern gesammelt, wie es aus der Spalte, so dass die Isolierung und Reinigung der Verbindungen elutes. Zu guter Letzt wird das Lösungsmittel entfernt mit einem Drehverdampfer Ausbeute der isolierten widerrufen.

Die Säulenchromatographie Vielseitigkeit und Komfort hat es eines der am weitesten verbreiteten Verfahren zur Reinigung von Verbindungen. Im Gegensatz zu Rekristallisation (eine andere häufig verwendete Reinigung Technik) keinen Verbindungen gereinigt mit Säulenchromatographie solide sein. Säulenchromatographie ist auch in der Lage, eine Reihe von Verbindungen aus einer Mischung zu isolieren. Ein weiterer Vorteil der Spalte Chromatograph ist, dass sehr wenig muss über die physikalischen Eigenschaften der Verbindung bekannt sein, um diese Reinigung Methode, machen diese Technik sehr wertvoll bei der Synthese oder Isolieren von neuartigen Verbindungen, in denen über die widerrufen ist wenig bekannt.

Lösungsmittel

Die Rate, mit der eine Verbindung durch die Säule durchläuft, ist stark abhängig von der mobilen Phase genutzt. In der Regel mehr polare Lösungsmittel die schnellere Verbindungen werden durch die Spalte passieren. Polare Lösungsmitteln haben eine größere Affinität für die feste Phase, die Wechselwirkungen zwischen den widerrufen und die feste Phase, so dass die Verbindungen zu schneller eluieren zu begrenzen. Vorsicht muß genommen werden, um sicherzustellen, dass das Lösungsmittel für die Säulenchromatographie gewählte System die entsprechende Polarität Trennung zwischen den Verbindungen in der Mischung zu erstellen hat. Die Lösungsmittel Wahl ist entscheidend für erfolgreiche Abscheidung mittels Säulenchromatographie. Um eine optimale Lösungsmittelsystem zu identifizieren, sollte eine Reihe von Dünnschicht-Chromatographie (TLC) Experimente durchgeführt werden, vor der Durchführung der Spalte-Chromatographie-Experiment. In einigen Fällen kann es erforderlich, eine binäre Lösungsmittelsystem zu verwenden sein.

Ein Lösungsmittelsystem Auswahl

1. Identifizieren Sie eine Lösungsmittel-System, die einen Retardierung-Faktor (R_f ) produziert zwischen 0,2 – 0,3 für die gewünschte Verbindung auf eine TLC Platte.
2. Starten Sie mit Dichlormethan oder Ethylacetat als die mobile Phase für die TLC-Experiment.
   1. Wenn R_f größer als 0,3 ist, versuchen Sie weniger polares Lösungsmittel wie Hexan. Wenn R_f kleiner als 0,2 ist, versuchen Sie die Zugabe einer geringen Menge eines polaren Lösungsmittels wie Methanol.
   2. Die optimale Lösungsmittelsystem erfordern eine Mischung aus beiden Lösungsmittel.
   3. Vorsicht nicht mehr als 10 % Methanol als mobile Phase einer Silica-Spalte sein.

(1) Kieselgel Gülle

1. Gießen Sie das Silica-Gel in einen Erlenmeyerkolben. Das Gewicht des Verpackungsmaterials sollte etwa 50 x die Probe getrennt zu sein. Wenn die Verbindungen getrennt sehr ähnliche R_f -Werte haben, kann dann es erforderlich, mit einer größeren Menge an Kieselsäure pro Probe, die in diesem Beispiel der Fall ist.
   1. Platz 10 g Kieselsäure in den Erlenmeyerkolben, da 50 mg der Probe (45 mg Fluorenone und 5 mg Tetraphenylporphyrin) sind isoliert.
2. Fügen Sie die Lösungsmittelsystem (Hexan/Dichlormethan, 70 %: 30 %) in den Erlenmeyer-Kolben mit Silica-Gel. Fügen Sie genügend Lösungsmittel um sicherzustellen, dass all das Silica-Gel ist gut solvatisierte. Die Kieselsäure löst sich nicht, aber die Mischung wird visuell wahrnehmbar sein, wenn solvatisierte. Nachdem das Lösungsmittel hinzugefügt wurde wirbeln Sie Erlenmeyerkolben um sicherzustellen, dass all die Kieselsäure ist gut solvatisierte.

2. Vorbereitung der Spalte

1. Wählen Sie die entsprechend dimensionierte Spalte. Die Spalte sollte in der Regel etwa auf halbem Weg mit Kieselgel Gülle gefüllt werden. Je größer die Stichprobe, geläutert, je größer die Spalte erforderlich.
2. Stecken Sie den unteren Rand der Spalte mit einem Stück Glaswolle. Mit einem langen Stab, stellen Sie sicher, dass die Wolle fest in den unteren Rand der Spalte oberhalb der Absperrhahn gestellt wird.
3. Sobald die Wolle fest vorhanden ist, wenden Sie eine dünne Schicht von Sand über die Glaswolle.
   Hinweis: Wenn die Spalte mit einer Glasfritte oberhalb der Absperrhahn ausgestattet ist, sollte dieser Schritt ausgelassen werden.
4. Klemmen Sie die Spalte in die vertikale Position zu einem Ring Stand.
5. Mit einem Trichter, vorsichtig gießen Sie die vorbereiteten Brei aus Silica-Gel in die Spalte. Sie müssen möglicherweise zusätzliche Lösungsmittel um die Gülle aus dem Erlenmeyerkolben auf der Spalte zu übertragen hinzufügen. Mit einer Pipette, waschen Sie unten Silica-Gel, das an den Seiten der Spalte klebt.
   1. Da das Silica-Gel in der Spalte absetzen, klopfen Sie leicht die Seiten der Spalte um sicherzustellen, dass das Silica-Gel fest packt und eventuelle Luftblasen schließt.
6. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie Lösungsmittel in einem sauberen Erlenmeyerkolben bis kurz vor das Silica-Gel und das Lösungsmittel vorderen Treffen ablaufen. Die Silica-Gel sollte nie austrocknen, bis das Verfahren abgeschlossen ist.
7. Legen Sie eine dünne Schicht des Sandes auf das Silica-Gel (Abbildung 1). Mit einer Pipette, waschen Sie unten keinen Sand, die zu den Seiten der Spalte stecken haben kann.
8. Lassen Sie keine zusätzlichen Lösungsmittel, bis der Sand trocken ist, aber nicht bis auf die Silica-Gel-Schicht.

Abbildung 1. Das richtige Setup für eine Säulenchromatographie experimentieren vor der Zugabe der Probe.

(3) Zugabe der Probe auf die Säule

1. Auflösen der Probe in die kleinste Menge des Lösungsmittels möglich (unter Verwendung der gleichen Lösungsmittel, das verwendet wurde, um die Silica-Gel-Gülle machen).
2. Fügen Sie die Probe mit einer Pipette hinzu, sanft an die Spitze der Säule werden.
3. Sobald die Probe an die Spitze der Spalte angewendet wurde, öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Lösungsmittel durch die Sandschicht aber nicht die Silica-Gel-Schicht abtropfen. Verwenden Sie eine sehr kleine Menge des Lösungsmittels, waschen Sie jede Probe, die an den Seiten der Spalte klammerte sich haben kann. Diese zusätzliche Lösungsmittel durch die Sandschicht sowie ablassen.

(4) beschichtete Probe durch die Spalte

1. Mit einer Pipette, sehr sanft fügen Sie 4 – 5 mL des Lösungsmittels in einer Weise, die die Sandschicht nicht stört hinzu.
2. Setzen Sie einen Trichter am oberen Rand der Spalte und sehr langsam und sanft, füllen Sie den Rest der Spalte mit Lösungsmittel.
3. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Lösungsmittel durch die Säule ablaufen.
4. Begin die mobile Phase zu sammeln, wie er aus der Spalte in Reagenzgläsern entwässert.
   1. Reagenzgläser sollten in einer sequenziellen Weise in einem Reagenzglas Rack platziert werden.
5. Fügen Sie zusätzliche Lösungsmittel an die Spitze der Säule, wie nötig, bis alle gewünschten Verbindungen von der Säule eluiert haben.

(5) erholt sich die Bestandteile

1. Wenn die Verbindungen farbig sind, können dann sie visuell identifiziert werden. Jedoch wenn die Verbindungen farblos sind, müssen sie mit Ulta-sichtbar (UV) Licht (wenn die Verbindungen Konjugation enthalten) identifiziert werden oder mit den entsprechenden Fleck. Die Reinheit der Verbindungen kann mit Dünnschichtchromatographie überprüft werden.
2. Identifizieren Sie die Reagenzgläser, die die gewünschte widerrufen enthalten.
3. Zusammenführen Sie aller Fraktionen, die die gewünschten isolierten widerrufen in ein vorgewogene Rundboden (RB) Fläschchen enthalten. Dies gilt für jede Verbindung isoliert.
4. Verdampfen des Lösungsmittels indem der RB-Kolben auf die Drehverdampfer.
5. Sobald alle Lösungsmittel entfernt worden ist, wiegen Sie die RB mit das getrocknete Produkt und subtrahieren Sie das Ausgangsgewicht der RB, eine Rendite zu erhalten.

Das Beispiel enthält eine Mischung aus Tetraphenylporphyrin (TPP, 5 mg) und Fluorenone (45 mg) erfolgreich getrennt wurde und jeder Verbindung wurde isoliert. Der TPP eluiert zuerst aus der Spalte als ein dunkles Lila-rötlich-Band und die Fluorenone anschließend eluiert aus der Spalte als ein gelbes Band ()Abbildung 2). Der eluierten Brüche wurden gesammelt in den Reagenzgläsern und identifiziert durch ihre unverwechselbare Farben (Abbildung 3). Die Fraktionen, die isolierte Verbindungen enthalten wurden in separaten RBs zusammengeführt und das Lösungsmittel wurde entfernt mit einem Drehverdampfer, hochreines TPP und Fluorenone leisten. Die Reinheit der chromatographed Verbindungen wurde durch Kernresonanzspektroskopie (NMR) validiert. Verbindungen können zusätzlich durch Schmelzpunkt, sondern nur überprüft werden, wenn der Schmelzpunkt für die gewünschte widerrufen zuvor festgestellt wurde.

Abbildung 2: Da die Verbindungen durch die stationäre Phase durchlaufen beginnen sie zu trennen. In diesem Experiment die TPP (dunkles violett-rötliche Band) durch die Spalte etwas schneller als die Fluorenone (gelbes Band reist).

Abbildung 3. Wie die Verbindungen aus der Spalte eluieren werden im Reagenzglas aufgefangen. Die Verbindungen werden getrennt in diesem Experiment werden eingefärbt, sodass sie visuell erkannt werden können.

Zusammenfassung

Säulenchromatographie ist eine bequeme und vielseitige Methode zur Reinigung von Verbindungen. Diese Methode trennt Verbindungen basierend auf Polarität. Durch die Ausnutzung von Unterschieden in der Polarität der Moleküle, kann Säulenchromatographie facilely Verbindungen durch die Rate trennen, bei denen die Verbindungen der stationären Phase der Spalte durchlaufen. Einer der Vorteile der Säulenchromatographie (vor allem im Vergleich zur Rekristallisation) ist das sehr wenig über die Verbindungen vor dem Reinigungsprozess bekannt sein müssen. Der andere Vorteil von Säulenchromatographie ist, dass es verwendet werden kann, um sowohl Feststoffe als auch Öle, zu reinigen, während Rekristallisation nur verwendet werden, kann um Feststoffe zu reinigen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um eine Reihe von Verbindungen aus einer Mischung zu isolieren.

Anwendungen

Säulenchromatographie ist einer der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur Reinigung von Verbindungen. Oft synthetische Reaktionen produzieren mehrere Produkte und Säulenchromatographie verwendet werden, um jede der Verbindungen zur weiteren Untersuchung zu isolieren. Säulenchromatographie ist äußerst wertvoll bei der Synthese oder neuartige Substanzen zu isolieren, da sehr wenig über eine Verbindung bekannt sein muss und seine "physikalischen Eigenschaften vor dem Reinigungsprozess.

Die Pharmaindustrie verwendet routinemäßig Säulenchromatographie Verbindungen als Teil seiner frühen Phase Arzneimittelentwicklung zu reinigen. ³ oft in diese Vorstufen-Forscher wird Bibliotheken von Verbindungen um eine Blei-Verbindung zu konstruieren, dann anschließend mit Säulenchromatographie, um die neu synthetisierten Verbindungen zu reinigen. ⁴ die extensive Nutzung und Vielseitigkeit dieser Reinigung Technik veranlasste Pädagogen, die Technik in den undergraduate Curriculum zu integrieren. ^5,6

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