Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.
Jüngste Fortschritte in den viralen Vektor- und Nanomaterialwissenschaften haben den Weg für neue innovative Ansätze zur Untersuchung oder Manipulation des Zentralnervensystems (ZNS) geebnet. Eine weitere Optimierung dieser Technologien würde jedoch von Methoden profitieren, die eine schnelle und schlanke Bestimmung des Ausmaßes von ZNS und zellspezifischem Targeting bei verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln im Körper ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die hohen Durchsatz- und Multiplexing-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie nutzt, um eine einfache Quantifizierung verschiedener Zellsubtypen zu ermöglichen, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus isoliert sind, nämlich Mikroglia/Makrophagen, Lymphozyten, Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen und Endothelzellen. Wir wenden diesen Ansatz an, um kritische Unterschiede zwischen zwei Gewebehomogenisierungsmethoden in Bezug auf Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Zusammensetzung hervorzuheben. Dies könnte den Benutzer anweisen, die beste Methode zu wählen, abhängig von den von Interesse sindden Zelltypen und der spezifischen Anwendung. Diese Methode eignet sich nicht für die Analyse der anatomischen Verteilung, da das Gewebe homogenisiert ist, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Es ermöglicht jedoch die Arbeit mit lebensfähigen Zellen und kann mit zellsortierung kombiniert werden, was den Weg für mehrere Anwendungen öffnet, die das Repertoire an Werkzeugen in den Händen des Neurowissenschaftlers erweitern könnten, von der Etablierung von Primärkulturen aus reinen Zellpopulationen bis hin zu Genexpressionsanalysen und biochemischen oder funktionellen Assays zu gut definierten Zellsubtypen im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen, zur pharmakologischen Behandlung oder Gentherapie.
Gen- und Medikamentenabgabetechnologien (wie virale Vektoren und Nanopartikel) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, das angewendet werden kann, um bessere Einblicke in spezifische molekulare Pfade zu gewinnen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen verändert wurden, und für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze1,2,3. Die Optimierung dieser Werkzeuge beruht auf der Quantifizierung von: (1) dem Ausmaß der Penetration im ZNS auf verschiedenen Verabreichungswegen und (2) der Ausrichtung auf bestimmte Zellpopulationen. Histologische Analysen werden in der Regel angewendet, um fluoreszierende Reportergene oder fluoreszierend markierte Nanopartikel in verschiedenen ZNS-Bereichen und über verschiedene Zelltypen hinweg zu visualisieren, die durch Immunfärbung für bestimmte Zellmarker identifiziert werden4,5. Obwohl dieser Ansatz wertvolle Informationen über die Bioverteilung des verabreichten Gens oder der Instrumente zur Medikamentenabgabe liefert, kann die Technik zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein, da sie Folgendes erfordert: (1) Gewebefixierung, Kryokonservierung oder Paraffineinbettung und Schneiden; (2) Färbung für bestimmte zelluläre Marker, die manchmal Antigen-Retrieval erfordern; (3) Erfassung durch Fluoreszenzmikroskopie, die in der Regel die Analyse einer begrenzten Anzahl verschiedener Marker innerhalb desselben Experiments ermöglicht; (4) Bildverarbeitung, um eine ordnungsgemäße Quantifizierung des Interessensignals zu ermöglichen.
Die Durchflusszytometrie ist zu einer weit verbreiteten Technik geworden, die sehr spezifische Fluoreszenzmarker nutzt, um nicht nur eine schnelle quantitative Auswertung verschiedener Zellphänotypen in Zellsuspensionen zu ermöglichen, basierend auf der Expression von Oberflächen- oder intrazellulären Antigenen, sondern auch funktionelle Messungen (z. B. Apoptoserate, Proliferation, Zellzyklusanalyse usw.). Die physikalische Isolierung von Zellen durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung ist ebenfalls möglich, was weitere nachgelagerte Anwendungen (z.B. Zellkultur, RNAseq, biochemische Analysen usw.) ermöglicht. 6,7,8.
Die Gewebehomogenisierung ist ein kritischer Schritt, der notwendig ist, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, um zuverlässige und reproduzierbare zytometrische Auswertungen nachdemdurchzuermöglichen. Für die Homogenisierung des Gehirns und des Gehirngewebes wurden verschiedene Methoden beschrieben, hauptsächlich mit dem Ziel, Mikrogliazellen9,10,11zu isolieren; sie können insgesamt in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: (1) mechanische Dissoziation, die Schleif- oder Scherkraft durch einen Dounce Homogenisator (DH) verwendet, um Zellen aus ihren Nischen zu reißen und eine relativ homogenisierte Einzelzellsuspension zu bilden, und (2) enzymatische Verdauung, die auf inkubation von hackenden Gewebestücken bei 37 °C in Gegenwart von proteolytischen Enzymen wie Trypsin oder Papain beruht, was den Abbau der extrazellulären Matrix begünstigt, um eine fair homogeneZellezu erzeugen.
Unabhängig davon, welche Methode verwendet wird, wird nach der Gewebehomogenisierung ein Reinigungsschritt empfohlen, um Myelin durch Zentrifugation auf einem Dichtegradienten oder durch magnetische Selektion9,12zu entfernen, bevor man zu den nachgeschalteten Anwendungen übergeht.
Hier beschreiben wir ein Gewebeverarbeitungsverfahren auf Basis der Papainverdauung (PD), gefolgt von der Reinigung auf einem Dichtegradienten, optimiert, um lebensfähige heterogene Zellsuspensionen aus dem Maushirn oder Rückenmark zeitempfindlich und für die Durchflusszytometrie geeignet zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir ein 9-farbene Strömungszytometrie-Panel und die Gating-Strategie, die wir im Labor angenommen haben, um die gleichzeitige Diskriminierung verschiedener ZNS-Populationen, lebender/toter Zellen oder Positivität für fluoreszierende Reporter wie grünes fluoreszierendes Protein oder Rhodaminfarbstoff zu ermöglichen. Durch die Anwendung dieser zytometrischen Durchflussanalyse können wir verschiedene Methoden der Gewebeverarbeitung, d.h. PD versus DH, in Bezug auf die Erhaltung der zellulären Lebensfähigkeit und der Erträge verschiedener Zelltypen vergleichen.
Die Details, die wir hierin angeben, können die Entscheidung über das Homogenisierungsprotokoll und die Antikörperkombination in der Durchflusszytometrie-Platte auf der Grundlage der spezifischen Zelltypen von Interesse und der nachgelagerten Analysen (z. B. temperaturempfindliche Anwendungen, Verfolgung spezifischer Fluoreszenzmarker, In-vitro-Kultur, funktionelle Analysen).
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Dana Farber Cancer Institute (Protokollnummer 16-024) genehmigt.
1. Vorbereitung der für das Experiment erforderlichen Lösungen
2. Tierische Euthanasie durch intrakardiale Perfusion und Gewebesektion
HINWEIS: Acht Wochen alte C57BL/6J-Mäuse, beide Geschlechtsmäuse, wurden in den Experimenten verwendet. Perfusion mit PBS-Lösung wird durchgeführt, um Blutkontamination von Organen zu beseitigen, bevor sie mit der Gewebeverdauung fortfährt.
3. Enzymatische Verdauung von Gehirn und Rückenmark
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina reichen für die Verdauung von halb Gehirn oder Rückenmark aus.
4. Mechanische Homogenisierung von Gehirn und Rückenmark
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina reichen für die Homogenisierung von halb Hirn oder Rückenmark aus. Das in diesem Abschnitt beschriebene Protokoll kann je nach Benutzerbedarf als Alternative zu dem in Abschnitt 3 beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie unten erläutert.
5. Trümmerentfernung
ANMERKUNG: Die Entfernung von Schmutz, die hauptsächlich aus unverdautem Gewebe und Myelinscheiden besteht, ist ein entscheidender Schritt, um eine effiziente Färbung des Gewebehomogenats für nachfolgende zytometrische Durchflussanalysen zu ermöglichen.
6. Färbung zur zytometrischen Durchflussbewertung mehrerer Zelltypen
Wir verglichen zwei verschiedene Homogenisierungsmethoden (DH versus PD), die auf Das Maushirn und Rückenmark angewendet wurden, um die Effizienz beim Abrufen verschiedener lebensfähiger Zelltypen zu testen, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet sind. Dazu nutzten wir ein 9-farbiges Flow-Zytometrie-Panel, das verschiedene ZNS-Zelltypen wie Mikroglia, Lymphozyten, Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Endothel charakterisieren soll.
Hirn- und Rückenmarksgewebe wurden von verschiedenen Mäusen (n 6) entnommen, in zwei Hälften längs aufgeteilt, gewogen und parallel verarbeitet, indem entweder mechanische Störungen nach dem Dounce Homogenizer (DH-Methode) angewendet oder sanft gehackt und enzymatisch mit dem kommerziellen NTDK auf Basis von Papain (PD-Methode)(Abbildung 1A)verdaut und verdaut wurden. Nach der Entfernung von Schmutz wurden Zellen aus dem Gehirn oder dem Rückenmark in Trypan-Blau verdünnt, um die Zellausbeute und Lebensfähigkeit mit einer Neubauer-Kammer zu bestimmen (Abbildung 1B,C). Die DH-Methode produzierte insgesamt eine höhere Zellausbeute sowohl aus Gehirn als auch rückendem Mark. Die Mehrheit der entnommenen Zellen war jedoch tot, was nur zu 13,8 % bis 3,3 % der lebensfähigen Zellen im Gehirn und 10,5 % bis 1,5 % im Rückenmark führte (Abbildung 1B). Viele der abgestorbenen Zellen bildeten Aggregate (Abbildung 1C); Dieses Phänomen könnte auf das Vorhandensein von stark miteinander verbundenen Zellnetzwerken (wie die endotheliale und glial Zellen, die die ZNS-Vaskulatur auskleidung), zurückzuführen sein, die nicht durch die mit der DH aufgebrachte Scherkraft disaggregiert werden konnten. Diese Aggregate von Todeszellen wurden wahrscheinlich nicht durch den Dichtegradienten entfernt und landeten im endgültigen Zellpellet, das für die zytofluorimetrische Analyse verwendet wurde. Im Gegenteil, die PD-Methode bestimmt eine insgesamt bessere Erhaltung der zellulären Lebensfähigkeit (90,6 % bis 0,6 % im Gehirn und 85,2 % bis 2,8 % im Rückenmark). Papain ist in der Lage, die extrazelluläre Matrix und Zell-zu-Zell-Verbindungen effizient zu verdauen, was zu einer gleichmäßigeren einzelzelligen Suspension führt. Einige der Zellen, die während des Hackprozesses absterben, könnten durch Papain weiter verdaut werden, was zur Bildung von Zellablagerungen führt, die durch den Dichtegradienten effizienter getrennt werden. Insgesamt wurde dadurch wahrscheinlich eine bessere Erhaltung der Zelllebensfähigkeit mit DER PD-Methode bestimmt, trotz einer etwas geringeren Zellausbeute im Vergleich zur DH-Methode.
Ein Aliquot von 100 l aus den Suspensionen der Gehirn- und Rückenmarkszellen wurde mit dem Antikörpermix(Tabelle 1) gebeizt und durch Durchflusszytometrie mit einem 9-Farben-Panel analysiert. Abbildung 2A zeigt die Gating-Strategie, mit der die verschiedenen Zelltypen aus den Suspensionen des Gehirns und der Rückenmarkszellen identifiziert werden. Kurz gesagt, das erste Tor identifiziert die allgemeine Population nach Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), ausgenommen Kleinzellablagerungen. Dann werden lebende (7-AAD-) Zellen identifiziert. Innerhalb der gesamten Lebendzellenpopulation werden CD45+ und CD45-Zellen hervorgehoben. Innerhalb des CD45+ Gates werden CD45+CD11b+ Mikroglia/Makrophagen und CD45+CD11b-Lymphozyten identifiziert. Innerhalb des CD45-Tors werden Zellen je nach Positivität für ACSA2 (Astrozyten) oder O4 (Oligodendrozyten) diskriminiert. CD45-ACS2-O4-Zellen werden nach Positivität für Thy1 (Neuronen) oder CD31 (Endothel) weiter unterteilt. Verbleibende Thy1-CD31-Zellen werden als "andere Zelltypen" klassifiziert, die nicht durch unseren Antikörpermix berücksichtigt werden.
Wie in Abbildung 2Bdargestellt, waren bei der DH-Methode etwa 38 % der aus dem Gehirn entnommenen lebensfähigen Zellen und etwa 32 % der aus dem Rückenmark entnommenen lebensfähigen Zellen hämatopoetischen Ursprungs (CD45+). Auf der anderen Seite erlaubte die PD-Methode, eine signifikant hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen in beiden Geweben abzurufen, wobei eine sehr große Fraktion durch nicht-hämatopoetische CD45-Zellen (etwa 82% im Gehirn und 92% im Rückenmark) repräsentiert wurde. Bemerkenswerterweise stellten CD45+CD11b+ Mikroglia/Makrophagen mit der DH-Methode die am häufigsten vorhandene lebensfähige Zellfraktion dar (Abbildung 2C). Die PD-Methode erzeugte jedoch eine heterogenere Darstellung von Zelltypen, einschließlich ACSA+-Astrozyten, O4+-Oligodendrozyten, CD31+-Endothelzellen und Thy1+-Neuronen (Abbildung 2C). Interessanterweise waren lebensfähige Neuronen und Endothelzellen mit der DH-Methode kaum nachweisbar.
Die DH-Methode beruht auf dem mechanischen Schleifen des Gewebes zwischen dem Glasstöße und dem Mörtel des Dounce Homogenisators, um eine Gewebehomogenisierung zu erhalten. Dies könnte einige Scherstress verursachen, die wahrscheinlich beschädigen und die Lebensfähigkeit von großen oder sehr empfindlichen Zellen wie Neuronen oder Zellen der Neurovaskulatur beeinträchtigen. Wir haben die zelluläre Lebensfähigkeit (Prozentsatz der 7-AAD-Zellen) innerhalb jeder Zellsubpopulation bewertet, die durch das Antikörperpanel identifiziert wurde (Abbildung 3). Hämatopoetische Zellen (CD45+), die aus Gehirn und Rückenmark isoliert sind, einschließlich Mikroglia/Makrophagen (CD45+CD11b+) und andere nicht-myeloische Zellen (CD45+Cd11b-), zeigten unabhängig von der verwendeten Homogenisierungsmethode eine sehr hohe Lebensfähigkeit (Abbildung 3A). Im Gegenteil, das DH-Verfahren bestimmt eine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit von CD45-Populationen (Abbildung 3B), während die PD-Methode eine umfassende Erhaltung verschiedener ZNS-Zelltypen bestimmt. Im Detail waren Neuronen und Endothelzellen die Subpopulationen, die am stärksten von DH betroffen waren und durch die PD-Methode konserviert wurden.
Abbildung 4ist eine schematische Darstellung der kritischen Schritte zusammengefasst, die für eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung und effiziente Entfernung von Abfällen erforderlich sind.
Abbildung 1: Die Ausbeute der aus Gehirn und Rückenmark entnommenen Zellen wird durch die Homogenisierungsmethode beeinflusst.
(A) Experimentelle Randlinie. Mäuse wurden anästhesisiert und intrakardial mit PBS durchdrungen, um intravaskuläre zirkulierende Blutzellen zu entfernen. Gehirn und Rückenmark wurden sorgfältig seziert und längs in zwei Hälften geteilt. Gewebe wurden entweder mit Dounce Homogenisator (DH) oder Papain-Verdauung (PD) homogenisiert, wie im Haupttext beschrieben. Myelin und Gewebeablagerungen wurden dann durch Zentrifugation in einer 30%igen Dichtegradienten-Mittellösung entfernt, was zu einer heterogenen Zellsuspension mit verschiedenen Zelltypen führte, die durch Durchflusszytometrie analysiert werden konnte. (B) Histogramme, die die Ausbeute von Zellen zeigen, die bei der Gewebehomogenisierung mit der DH- oder PD-Methode aus dem Gehirn oder dem Rückenmark entnommen wurden. Es wird der Mittelwert von mindestens 6 Tieren pro Zustand dargestellt. (C) Repräsentative Hellfeldmikroskop-Photomikroskope von Trypan-Blau-Positiven(tot) und negativen (lebenden) Zellen, die mit den beiden Methoden aus dem Gehirn oder Rückenmark entnommen wurden. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Relative Anteile verschiedener Zelltypen, die aus dem ZNS abgerufen werden, werden von der Gewebehomogenisierungsmethode beeinflusst.
(A) Repräsentative Strömungszytometrie-Plots, die die Gating-Strategie zur Identifizierung verschiedener Zellsubpopulationen innerhalb von Zellpräparaten aus Gehirn oder Rückenmark zeigen: Die Zellpopulation wird nach physikalischen Parametern von FSC und SSC abgegrenzt, gefolgt von der Auswahl für 7-AAD-lebende Zellen; dann werden Zellen entsprechend der Positivität für CD45 Marker diskriminiert; Mikroglia/Makrophagen werden als CD11b+-Zellen innerhalb der CD45+-Fraktion identifiziert, während Lymphozyten CD11b-sind. Astrozyten, Oligodendrozyten, endotheliale und neuronale Zellen werden als ACSA2+, O4+, CD31+ oder Thy1+ Zellen innerhalb von CD45- bzw. identifiziert. (B) Histogramme, die den Prozentsatz der CD45+ und CD45-Zellen innerhalb der gesamten lebenden oder toten Zellpopulationen im Gehirn oder Rückenmark bei Homogenisierung mit der DH- oder PD-Methode zeigen. Die statistische Analyse der in den Schaubildern dargestellten Ergebnisse ist in Tabelle 2dargestellt. (C) Kreisdiagramme, die den Prozentsatz verschiedener lebensfähiger Zellsubtypen innerhalb der Gesamten Zellpopulation im Gehirn oder Rückenmark nach Homogenisierung mit der DH- oder PD-Methode zeigen. Der Prozentsatz der gesamten abgestorbenen Zellen wird ebenfalls gemeldet. N bis 6. CD45+CD11b+ = Mikroglia/Makrophagen; CD45+CD11b- = Lymphozyten/nicht-myeloische Zellen; CD45-ACSA2+ = Astrozyten; CD45-O4+ = Oligodendrozyten; CD45-Thy1+ = Neuronen; CD45-CD31+ = Endothelzellen; Andere = Zellen negativ für alle oben genannten Marker. Die statistische Analyse der in den Schaubildern dargestellten Ergebnisse ist in Tabelle 2dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die zelluläre Lebensfähigkeit verschiedener ZNS-Zelltypen wird durch die angewendete Homogenisierungsmethode beeinflusst.
(A) Histogramme, die den Prozentsatz von 7-AAD- Lebendzellen innerhalb von CD45+ hämatopoetischen Populationen einschließlich CD11b+ Mikroglia/Makrophagen und CD11b- nicht myeloischer Zellen zeigen. (B) Histogramme, die den Prozentsatz von 7-AAD-Lebendzellen innerhalb von CD45- nicht-hämatopoetischen Populationen einschließlich Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen, Endothel und anderen Zelltypen zeigen. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, Mann-Whitney zwischen DH und PD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der kritischen Schritte, die für die ordnungsgemäße Gewebeverarbeitung erforderlich sind.
Eine Liste der wichtigsten Schritte, die für die ordnungsgemäße Gewebeverarbeitung und effiziente Entfernung von Schmutz erforderlich sind, wird gezeigt. Es ist wichtig, die Trümmerscheibe (schwarzer Pfeil) und das Zellpellet (blauer Pfeil), das nach der Zentrifugation der Proben auf dem 30%igen Dichtegradienten gebildet wurde, richtig zu identifizieren. Die Trümmerscheibe muss zusammen mit dem Rest des Überstandes sorgfältig durch Aspiration entfernt werden, ohne das Zellpellet zu entfernen, um Probenverlust zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Antikörper-Mix | Anfangskonzentration (g/ml) | Endkonzentration (g/ml) | Verdünnungsfaktor |
Anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
Anti CD11b/APC.780 | 200 | 2 | 100 |
Anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
Anti ACSA2/APC | 150 | 0.75 | 200 |
Anti O4/Biotin | Na | Na | 40 |
Anti-CD90.2/PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
Streptavidin-Mischung | Anfangskonzentration (g/ml) | Endkonzentration (g/ml) | Verdünnungsfaktor |
Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tabelle 1: Rezept für die Herstellung von Mischungen für die Durchflusszytometriefärbung. Die Tabelle beschreibt die optimalen Konzentrationen von Antikörpern und Streptavidin, die verwendet werden, um zytometrische Flussanalysen mehrerer Zelltypen zu ermöglichen. Einzelheiten zu den Katalognummern der einzelnen in der Tabelle genannten Reagenzen finden Sie in der Tabelle.
Statistiken für Abbildung 2B | ||||||||||
BRAIN (% Zellen) | ||||||||||
CD45+ | CD45- | |||||||||
Live | Tot | Live | Tot | |||||||
Methode | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | ||
DH | 15.20 | € 2,32 | 1.90 | € 0,30 | 24.78 | € 4,045 | 51.58 | € 6,033 | ||
Pd | 15.20 | € 2,65 | 2.33 | € 1,10 | 68.53 | € 3,618 | 13.93 | € 2,180 | ||
Mann-Whitney | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
p-Wert | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
SPINAL CORD (% Zellen) | ||||||||||
CD45+ | CD45- | |||||||||
Live | Tot | Live | Tot | |||||||
Methode | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | ||
DH | 15.00 | € 8,21 | 1.41 | € 0,11 | 31.64 | € 8,21 | 51.95 | € 16,52 | ||
Pd | 7.49 | € 4,99 | 1.15 | € 0,68 | 84.27 | € 9,39 | 7.09 | € 3,75 | ||
Mann-Whitney | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
p-Wert | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 |
Statistiken für Abbildung 2C | |||||||||||||||||
BRAIN (% Zellen) | |||||||||||||||||
CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andere | Tot | ||||||||||
Methode | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | |
DH | 19.32 | € 3,88 | 1.17 | € 0,27 | 9.52 | € 2,68 | 3.41 | € 1,01 | 1.39 | € 0,77 | 0.48 | € 0,29 | 10.52 | € 4,49 | 53.83 | € 5,79 | |
Pd | 10.88 | € 2,03 | 1.65 | € 0,48 | 8.17 | € 2,66 | 6.54 | € 0,76 | 6.37 | € 1,76 | 8.27 | €1.25 | 33.28 | € 6,34 | 23.72 | € 5,31 | |
Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
p-Wert | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
SPINAL CORD (% Zellen) | |||||||||||||||||
CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andere | Tot | ||||||||||
Methode | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | Bedeuten | • SEM | |
DH | 21.23 | € 6,25 | 2.51 | € 0,57 | 4.26 | € 2,34 | 9.40 | € 1,89 | 2.82 | € 1,51 | 0.97 | € 0,50 | 22.74 | € 9,04 | 35.28 | € 1,89 | |
Pd | 9.63 | € 1,67 | 2.77 | € 0,48 | 4.23 | € 1,59 | 28.62 | € 3,57 | 1.26 | € 0,49 | 6.94 | € 2,14 | 26.39 | € 8,17 | 19.09 | € 4,76 | |
Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
p-Wert | 0.1905 | >0,9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 |
Tabelle 2: Statistische Analyse verschiedener Populationen, die unter Anwendung der DH- oder PD-Methode abgerufen werden. Die Tabelle beschreibt die Statistiken für die in Abbildung 2B und Abbildung 2Cdargestellten Diagramme. Der Durchschnitt und das SEM von mindestens sechs unabhängigen Stichproben sind dargestellt. Der p-Wert und die Angaben zu den statistischen Tests, die für jeden Vergleich angewendet werden, werden ebenfalls gemeldet.
Hierin beschreiben wir ein Protokoll zur Koreinigung und parallelen zytometrischen Analyse von einigen der relevantesten ZNS-Zellen aus Demhirn und Rückenmark. Traditionell wurden histologische Analysen durchgeführt, um die Verteilung von Nanopartikeln oder die Transduktionseffizienz viraler Vektoren im ZNS5,13zu beschreiben oder Um Erkenntnisse über morphologische und molekulare Veränderungen zu geben, die in bestimmten Zelltypen während einer Pathologie oder bei der pharmakologischen Behandlung auftreten14. Die Histologie mangelt jedoch an Prozessivität und erlaubt aufgrund der begrenzten Anzahl von Markern, die gleichzeitig analysiert werden können, keine umfassende Untersuchung mehrerer Merkmale in denselben histologischen Proben. Unser Ansatz kann die traditionellen histologischen Analysen ergänzen und mit mehreren nachgelagerten Anwendungen (Sortier-, Primärkultur-, biochemische oder Next-Generation-Sequenzierungsanalysen) gekoppelt werden, um die Zusammenstellung von Informationen zu erweitern, die aus einzelnen Proben gewonnen werden können. Einige der unten aufgeführten Schlüsselfaktoren müssen jedoch berücksichtigt werden, da sie den Erfolg dieses Ansatzes entscheidend beeinflussen können:
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll eine schonende enzymatische Verdauung nutzt, gefolgt von einer 9-farbenigen Färbung, die eine effiziente simultane zytometrische Auswertung verschiedener Zelltypen aus dem Gehirn und dem Rückenmark ermöglicht. Das Protokoll könnte genutzt werden, um die Effizienz des Zellziels durch Nanopartikel oder virale Vektoren, die im CNS15verabreicht werden, auf schlanke und umfassende Weise zu überwachen. Darüber hinaus könnte das Protokoll leicht für sehr empfindliche nachgelagerte Anwendungen wie Zellsortierung, Ex-vivo-Subkultur, Einzelzell-RNAseq übernommen werden, was nicht nur für die präklinische Bewertung von Zelltargeting durch Therapeutika, sondern auch für die tiefgehende Charakterisierung pathologischer Prozesse bei neurodegenerativen Erkrankungen von größter Bedeutung ist.
Ein Bruchteil der gesamten ZNS-Zellpopulation wird durch dieses Protokoll nicht diskriminiert (siehe "andere" Zelltypen in Abbildung 2); Dies kann durch das Vorhandensein anderer Zellsubtypen erklärt werden, die im ZNS vorhanden sind, aber nicht von den von uns verwendeten Antikörpern erfasst werden. In unseren vorläufigen Analysen sind etwa 14% der "anderen Zellen"-Fraktion positiv für CD73, einen mesenchymalen Zellmarker, der in der Neurovaskulatur angereichert ist und an mehreren neuroinflammatorischen Prozessen beteiligt ist16,17. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass die Fraktion "andere Zellen" auch weniger differenzierte Zellen umfassen könnte, wie Vorläufer in verschiedenen Reifestadien, wie z. B. nestin+ neuronale Stammzellen, nestin+ vimentin+ radiale Gliavorläufer, Doublecortin+ neuronale Vorläufer, NG2+ Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, unter anderem. Diese Zelluntertypen könnten leicht durch Anwendung unseres Flow-Zytometrie-Protokolls untersucht werden, da wir eine Konfiguration von Fluoreszenzfarbstoffen gewählt haben, die es ermöglicht, bis zu zwei zusätzliche Zellmarker aufzunehmen, die entweder mit dem Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) Fluorophoren konjugiert sind.
Insgesamt könnte unser Ansatz ein neues Instrument für umfassendere Untersuchungen im Zusammenhang mit dem ZNS (in den Gesundheits- und Krankheitskrankheiten) bieten, das die Vorteile einer gut konsolidierten Technologie nutzt, die sowohl qualitative als auch quantitative Bewertungen mit hohem Durchsatz ermöglicht. wie Z.B. Durchflusszytometrie.
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Diese Studie wurde von Denbeinen des Boston Children es Hospital an A.B., ALSA-Stipendium nr. 17-IIP-343 an M.P., und das Büro des Stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsangelegenheiten durch das Amyotrophe Lateral sklerose Forschungsprogramm unter Auszeichnung Nr. W81XWH-17-1-0036 zu M.P. Wir würdigen DFCI Flow Cytometry Core für technischen Support.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
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