التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

هنا، نصف بروتوكول لتصور وتحليل الشرايين القوس البلعوم3، 4، و 6 من أجنة الفئران باستخدام كامل جبل الفلورالس، تطهير الأنسجة، المجهر الكونكور، وإعادة الإعمار 3D.

تشكيل غير لائق أو إعادة عرض الشرايين القوس البلعوم (PAAs) 3, 4, و 6 تسهم في بعض من أشد أشكال أمراض القلب الخلقية. لدراسة تشكيل PAAs ، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام الفلور المناعة كامل التركيب إلى جانب الكحول البنزيل / البنزوات (BABB) تطهير الأنسجة ، والمجهر confocal. وهذا يسمح لتصور الاندوثيوليوم القوس البلعوم في دقة الخلوية غرامة، فضلا عن اتصال 3D من الأوعية الدموية. باستخدام البرمجيات، وضعنا بروتوكولالتحديد عدد الخلايا الانتوليالية (ECs) في PAAs، فضلا عن عدد ECs داخل الضفيرة الوعائية المحيطة PAAs داخل أقواس البلعوم 3 و 4 و 6. عند تطبيقها على الجنين بأكمله ، توفر هذه المنهجية تصورًا شاملًا وتحليلًا كميًا للخلايا النفاسية الجنينية.

أثناء تكوين الجنين بالماوس ، تنشأ شرايين القوس البلعومية (PAAs) كأزواج متناظرة ثنائية الأطراف من الشرايين التي تربط القلب بالأورتاي الظهري^1. مع تطور الجنين ، يتراجع أول وثاني أزواج PAAs ، في حين أن 3^rdو⁴th و⁶ TH PAAs تخضع لسلسلة من أحداث إعادة عرض غير متناظرة لتشكيل الشرايين القوس الأبهري².

وPAAs 3 و 4 و 6 تطوير عن طريق تكوين الأوعية الدموية، وهو تشكيل دي نوفو من الأوعية الدموية³. عيوب في تشكيل أو إعادة عرض هذه الشرايين القوس تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية المختلفة, مثل تلك التي ينظر إليها في المرضى الذين يعانون من متلازمة ديجورج^4,5. ولذلك، يمكن أن تؤدي آليات الفهم التي تنظم تطور PAAs إلى فهم أفضل لأمراض القلب الخلقية (CHD).

النهج الحالية لتصور وتحليل تطوير PAA تشمل الفلور المناعي ة من أقسام الأنسجة، يلقي الأوعية الدموية، حقن الحبر الهند، عالية الدقة المجهر episcopic، و / أو كامل جبل المناعيالهيستوكيمياء^{1،,4،,5،,6،,7.} هنا، نحن نصف بروتوكول يجمع بين الفلورالية كامل جبل، المجهر confocal وتقديم صورة 3D من أجل جمع وتحليل وقياس البيانات الحجمية، والاتصال الأوعية الدموية وهوية الخلية. علاوة على ذلك ، نقوم بتفصيل طريقة لتقسيم وقياس أعداد ECs في كل قوس بلعوم كوسيلة لدراسة تشكيل الضفيرة الوعائية القوس البلعومية وإعادة عرضها في PAAs. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل تطوير PAA ، يمكن استخدامه لتحليل شبكات الأوعية الدموية النامية الأخرى.

ووافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة روتجرز على استخدام الحيوانات وإجراءاتها.

1- إعداد الحلول

1. إعداد 1 لتر من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا مع 0.1٪ تريتون-X-100 (PBST) وتعقيم تصفية. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة عام على الأقل.
2. إعداد 600 ميكرولتر من حظر عازلة تتكون من 10٪ من مصل الحمار العادي في PBST. اجعل هذا الحل طازجًا في كل مرة.
3. إعداد 50 مل من الميثانول التالية (MeOH) التخفيفات في غطاء تدفق: 25٪ MeOH في المياه المنزوعة (dH₂O)، 50٪ MeOH في dH₂O، و 75٪ MeOH في dH₂O. Vortex لخلط. تخزين في RT.
4. إعداد 50 مل من البنزيل الكحول البنزيل التالية حلول بنزوات (باب) في أنابيب مخروطية 50 مل.
   1. ل100٪ باب، إضافة 32 مل من بنزوات البنزيل إلى 16 مل من الكحول البنزيل (2:1 حجم لكل نسبة حجم).
   2. ل50٪ باب، إضافة 16 مل من بنزوات البنزيل و 8 مل من الكحول البنزيل إلى 24 مل من MeOH.
   3. تغطية الأنابيب المخروطية في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. يمكن تخزين هذه الحلول في RT لمدة تصل إلى عام.
      تنبيه: باب سام ومسبب للتآكل. وينبغي التعامل معها والتخلص منها وفقا لMSDS.

2- تشريح الجنين والتثبيت

ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لأجنة الماوس E9.5 و E10.5 (ذكور أو إناث) معزولة عن أي سلالة فأرة. بالنسبة للأجنة الأصغر سناً والأكبر سناً، ينبغي تحديد أوقات الحضانة تجريبياً لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإشارة الفلورسينس.

1. ملء واحد 35 ملم وواحد 60 ملم أطباق بيتري مع 1x PBS ومكان على الجليد حتى الحاجة.
2. القتل الرحيم للفأرالحامل عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون_2. إجراء خلع عنق الرحم كمقياس ثانوي للقتل الرحيم.
3. تنظيف منطقة البطن من السد مع 70٪ الإيثانول. قرصة منطقة البطن باستخدام ملقط وجعل شق مثل V باستخدام مقص الجراحية بدءا من قاعدة جدار البطن في خط الوسط; الاستمرار في فتح تجويف الصدر. ارفع يُرفع الأنسجة البطنية وحرّك الأمعاء إلى الجانب ليعرض قرون الرحم.
4. جعل قطع في قاعدة القناة المهبلية، ومع ملقط، وسحب الرحم بعيدا عن السد. قم بقص إضافي في كل مبيض لتحرير الرحم. نقل الرحم إلى واحدة من 60 ملم أطباق بيتري التي تحتوي على الباردة 1x PBS.
5. باستخدام مقص مستقيم، وقطع جدار الرحم بين كل موقع زرع. التقاط النفضية مع أنبوب زجاجي ونقل إلى 35 ملم بيتري الطبق مع 1x PBS. تحت المجهر تشريح، أدخل مقص مستقيم في المسافة بين النفضية وجدار الرحم. قطع وإزالة جدار الرحم.
6. مع ملقط غرامة، وإزالة الأغشية النفضية وReichert من الجنين عن طريق إجراء شقوق عرضية بعناية على طول الأنسجة وسحب الأنسجة بعيدا عن كيس صفار. إزالة كيس صفار وكيس السلوي عن طريق سحب بعناية الأنسجة بعيدا عن الجنين وجعل التخفيضات في الألانتوني والوريد السري.
   ملاحظة: يمكن استخدام الحويصلات صفار لجينوب الأجنة.
7. نقل كل جنين مع أنبوب زجاجي إلى أنابيب 2 مل الفردية مليئة 1 مل من 1x PBS. قم بتسمية كل أنبوب بمعرف فريد.
8. لإصلاح الأجنة، قم بإزالة 1x PBS بعناية وإضافة محلول بارافورمالديهايد (PFA) بنسبة 4٪ في 1x PBS. احتضان في 4 °C مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: 4% تثبيت PFA مناسب للأجسام المضادة المذكورة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب تحسين إجراءات التثبيت للأجسام المضادة إضافية.

3. تلطيخ الجنين

ملاحظة: في هذا القسم، يتم permeabilized الأجنة وملطخة بالأجسام المضادة الأولية والثانوية. ولأن تطوير PAA يسير بسرعة، فإن الاختلافات في المرحلة الجنينية ستؤثر بشكل كبير على التحليل المصب. لذلك ، يجب أن تكون الأجنة متطابقة حسب العمر عن طريق العد الدقيق للسوميتات لمطابقة التحكم والأزواج المتحولة قبل المزيد من التلاعب.

1. لغسل الجنين (الأجنة)، قم بإزالة 4% PFA بعناية وإضافة 1x PBS. عكس بلطف أنبوب (s) عدة مرات. ضع أنبوب (الأنابيب) الجانب الأيمن للأعلى والسماح للجنين (الأجنة) للغرق. كرر يغسل 3 مرات. ضع الأنبوب (الأجنة) مع الجنين (الأجنة) على الجليد.
   ملاحظة: (نقطة التوقف الاختيارية) بعد النُهج، يمكن تجفيف الأجنة في سلسلة متدرجة من MeOH لمدة 30 دقيقة لكل تخفيف، كما هو الحال في القسم 1.3، وتخزينها عند -20 درجة مئوية في 100٪ MeOH لاستخدامها في وقت لاحق لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. بالنسبة للأجنة E10.5، استخدم أنبوبزجاجي لنقل جنين واحد إلى طبق بتري 35 مم مملوء بـ 1x PBS المبرد. قرصة بعناية الجنين فقط فوق الطرف الخلفي مع ملقط غرامة وجعل قطع عرضية لإزالة النصف الخلفي من الجنين. وهذا يسمح للجنين بوضع مسطح في وضع مخطط للخطوة 4.2. ضع الجنين مرة أخرى في أنبوب 2 مل مع PBS 1x الطازجة.
   ملاحظة: يمكن إقران عنصر التحكم والجنين المتحول وتلطيخه بنفس محلول الأجسام المضادة في أنبوب واحد، للخطوات من 3.3 إلى 3.8.
   1. إذا تلطيخ جنينين معا، وقطع رأس من جنين واحد فوق القوس البلعوم الأول عن طريق معسر مع ملقط غرامة لجعل قطع عرضية. وهذا سوف يميز الأجنة من نوعين من الأنماط الجينية المختلفة داخل كل أنبوب.
3. لpermeabilize الجنين (ق)، pipet من 1x PBS من الأنبوب، والحرص على عدم لمس الجنين (ق). إضافة 1 مل من PBST. ضع الأنبوب عند درجة حرارة 4°C مع تهيج لطيف بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: (نقطة التوقف الاختيارية) يمكن الاحتفاظ بالأجنة في محلول PBST عند 4 درجات مئوية لعدة أيام.
4. لمنع الربط غير المحدد للأجسام المضادة ، قم أولاً بإزالة PBST من الأنبوب ، مع الحرص على عدم لمس الجنين (الأجنة). أضف 600 ميكرولتر من محلول العازلة العازلة إلى الجنين (الأجنة). منع الجنين (الأجنة) في 4 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يجب نسج حل الحجب بسرعة قصوى على جهاز طرد مركزي على قمة مقاعد البدلاء مباشرة قبل استخدامه لإزالة الحطام.
5. لتلطيخ وقياس ECs، استخدم الأجسام المضادة ضد VEGFR2 و ERG. يتم إجراء حلول الأجسام المضادة في المخزن المؤقت الحظر. يتم تخفيف الأجسام المضادة لمكافحة VEGFR2 1:200 ويتم تخفيف الأجسام المضادة ERG 1:1000.
   ملاحظة: يجب نسج حلول الأجسام المضادة بسرعة قصوى على جهاز طرد مركزي على أعلى مقاعد البدلاء مباشرة قبل استخدامها لإزالة الجسيمات.
   1. لاحتضان الجنين (الأجنة) بالأجسام المضادة الأولية، قم بإزالة محلول العازلة المانع من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين (الأجنة). أضف 600 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل أنبوب. تضن الجنين (الأجنة) عند درجة حرارة 4 درجة مئوية مع تهيج لطيف لمدة 4-5 أيام.
6. لغسل الجنين (الأجنة) من محلول الأجسام المضادة، قم أولاً بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من الأنبوب. غسل الجنين (الأجنة) كل ساعة مع 1 مل من PBST في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الانفعالات لطيف. غسل الجنين (الأجنة) 4-5 مرات خلال النهار ثم احتضان في 4 °C مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها. كرر النُهُس في اليوم التالي.
7. جعل حلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف المضادة للماعز اليكسا فلور 488 والمضادة للفأرة اليكسا فلور 555 1:300 في منع العازلة. تمييع الأسهم DAPI 1:1000 في حظر المخزن المؤقت.
   ملاحظة: يجب نسج حلول الأجسام المضادة بسرعة قصوى على جهاز طرد مركزي على أعلى مقاعد البدلاء مباشرة قبل استخدامها لإزالة الجسيمات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أصباغ Alexa Fluor الأخرى بدلاً من 488 أو 555.
   1. لاحتضان الجنين (الأجنة) بالأجسام المضادة الثانوية، قم بإزالة PBST من الأنبوب. أضف 600 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل أنبوب. تضن الجنين (الأجنة) عند درجة حرارة 4 درجة مئوية مع تهيج لطيف لمدة 4-5 أيام.
8. لغسل الجنين (الأجنة) من محلول الأجسام المضادة، قم أولاً بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي من الأنبوب. اغسل الجنين كل ساعة بـ 1 مل من PBST في RT مع الانفعالاللطيف. غسل الجنين (الأجنة) 4-5 مرات خلال النهار ثم احتضان في 4 °C مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها. كرر النُهُس في اليوم التالي.

4. تضمين الأجنة في أغاروز

ملاحظة: في القسم 4، سيتم تضمين الجنين (الأجنة) في أغاروز. تخدم عملية التضمين هذه غرضين: توجيه الجنين بشكل صحيح قبل التصوير، والمساعدة في تحديد مكان الجنين بعد تطهيره في BABB (الخطوات 5.2.2 - 5.3.2).

1. إعداد 200 مل من 1٪ محلول agarose عن طريق إضافة 2 غرام من agarose إلى 200 مل من dH₂O. الميكروويف حتى يذوب كل agarose.
   ملاحظة: يمكن تخزين agarose المتبقية في 4 درجة مئوية وإعادة تسخينها للاستخدامات اللاحقة.
2. باستخدام قالب البارافين البلاستيكي والأنابيب الزجاجية ، نقل بلطف جنين واحد إلى القالب. إزالة بعناية PBST من الجنين. ضع الجنين في وضع ية. بسرعة، إضافة حوالي 0.5 مل من agarose الساخنة إلى القالب - فقط ما يكفي لتغطية الجنين وملء القالب. تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية تحيط بالجنين.
3. ضع القالب على الثلج وغطيه برقائق الألومنيوم حتى يتوطد الاغاروز.
   ملاحظة: لا تسمح للجنين بالجفاف بعد إزالة PBST. يجب أن يكون محلول أغاروز دافئًا بما يكفي ليظل سائلًا عند إضافته إلى الجنين. إضافة فقط ما يكفي من agarose لتغطية الجنين، ولكن ليس كثيرا، وإلا سيكون من الصعب على الصورة. يتم تحديد عمق الصورة جزئيًا من خلال مسافة العمل للهدف.

5. الجفاف وتطهير الأنسجة

ملاحظة: في هذا القسم، يتم تجفيف الجنين (الأجنة) باستخدام سلسلة الميثانول، ثم مسحها في المذيبات العضوية، باب، وشنت بين اثنين من coverslips مفصولة من قبل فاصل المطاط؛ في هذا البروتوكول يتم استخدام الفواصل المطاطية بسرعة بئر. المصد سريع بئر لديه سطح لاصق على الوجهين. الفاصل مطلوب لإنشاء بئر ، حيث سيتم وضع الجنين والاحتفاظ به بين اثنين من التغطيات.

1. جفاف الميثانول
   1. تسمية جديدة 2 أنابيب مل، واحد لكل جنين. إضافة 1 مل من 25٪ MeOH لكل أنبوب.
   2. باستخدام مشرط نظيف ، قطع بلطف agarose حول الجنين ، وترك ما يكفي حول الجنين بحيث يمكن التقاطها عن طريق ملقط. استخدام ملقط غرامة للاستيلاء بلطف agarose مع الجنين جزءا لا يتجزأ ووضعه في أنبوب المسمى مع 25٪ MeOH. لا تسمح للملقط بلمس الجنين.
   3. احتضان الجنين (الأجنة) في RT مع هياج لطيف لمدة ساعة واحدة في الظلام.
   4. إزالة 25٪ MeOH من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين. إضافة 1 مل من 50٪ MeOH لكل أنبوب. احتضان في RT مع هياج لطيف لمدة 1 ساعة في الظلام.
   5. إزالة 50٪ MeOH من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين. إضافة 1 مل من 75٪ MeOH لكل أنبوب. احتضان في RT مع هياج لطيف لمدة 1 ساعة في الظلام.
   6. إزالة 75٪ MeOH من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين (ق). إضافة 1 مل من 100٪ MeOH لكل أنبوب. احتضان في RT مع هياج لطيف لمدة 1 ساعة في الظلام. كرر 100٪ MeOH يغسل مرتين.
2. المقاصة مع باب
   1. إزالة 100٪ MeOH من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين. أضف 1 مل من 50٪ باب لكل أنبوب. احتضان في RT مع هياج لطيف لمدة 1 ساعة في الظلام.
   2. إزالة 50٪ باب من الأنبوب، مع الحرص على عدم لمس الجنين. أضف 1 مل من 100٪ باب لكل أنبوب. احتضان في RT مع هياج لطيف لمدة 1 ساعة في الظلام. كرر 100٪ يغسل BABB مرتين.
      ملاحظة: (نقطة التوقف الاختيارية) يمكن أن تبقى الأجنة في 100٪ باب في أنابيب لمدة أسبوع تقريبا. تخزين أطول سوف يسبب BABB لإذابة البلاستيك من الأنابيب.
3. تركيب الأجنة للتصوير
   1. ضع مصد Fast Well على قسيمة غطاء زجاجية مقاس 24 مم × 60 مم #1.5، عن طريق تقشير المادة اللاصقة البلاستيكية من جانب واحد. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء بين coverslip والمصد عن طريق تطبيق ضغط لطيف على لاصقة بلاستيكية فوق المصد المطاط. قم بتسمية قسيمة الغطاء وفقًا لعدد الجنين والنمط الجيني والأجسام المضادة المستخدمة للتلطيخ.
      ملاحظة: يمكن وضع أي فاصل بين قسائم التغطية طالما أنها سميكة بما يكفي لمنع سحق أو سحق الجنين. نحن نستخدم الفواصل السريعة البئر بسبب سماكتها وراحتها ، والتي تشمل أسطحًا لاصقة على جانبي الفاصل لتأمينها على قسائم التغطية.
   2. أنبوب بعناية والتخلص من باب 100٪ من الأنبوب. بعد تصور الجنين المدمج في الأغاروز في الأنبوب ، استخدم ملقط ًا دقيقًا لالتقاط الأغاروز ونقل الجنين بعناية إلى قسيمة الغطاء داخل البئر السريع - لا تسمح للملقط بلمس الجنين.
   3. إزالة لاصقة بلاستيكية ثانية من المصد ووضع غطاء الثاني على القمة. إزالة فقاعات الهواء عن طريق الضغط بلطف على coverslip. كن حذرا ً لعدم كسر الزجاج.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات مسطحة في حامل شريحة في الظلام في RT لمدة تصل إلى عام إذا كان الختم ضيقًا.

6 - الحصول على البيانات

ملاحظة: في الخطوات التالية، سيتم تصوير البطانة من الأقواس البلعوم ية 3 و 4 و 6 باستخدام المجهر confocal.

1. تحديد موضع الشرائح على خشبة المجهر
   1. لتصوير الأجنة، استخدم مجهر ًا بؤريًا مجهزًا بهدف غمر الماء 20 أضعاف، وفتحة رقمية 0.95، ومسافة العمل 0.95 مم، وبرنامج NIS-Elements AR 5.11.01 64 بت.
   2. باستخدام الفلورسينس واسعة المجال، وتحديد موقع بصريا الأقواس البلعومية. مركز عرض الحقل حول PAA^4.
   3. إذا كان مجال رؤية الهدف لا يلتقط منطقة القوس البلعوم ية بأكملها ، فالتقط وغرزة لوحة كبيرة من الصور مع تداخل 1٪. لمنع حركة العينة أثناء الحصول على الصورة الكبيرة ، قم بتأمين تجميع زلة الغطاء برفق إلى المرحلة باستخدام طين الصب.
2. إعداد معلمات الاستحواذ
   1. تعيين حجم الثقب إلى 1.0.
   2. ضمن علامة التبويب ND Acquisition، قم بتعيين الحدود العلوية والسفلية للتصوير باستخدام التعديل الخشن. تعيين Z حجم الخطوة وفقا لمواصفات البرنامج. تحديد سمك التي يمكن أن تكون صورة من مسافة العمل من الهدف ووضوح العينة.
   3. بسبب سمك الجنين، وضبط المكاسب في جميع أنحاء Z-كومة. تعيين كثافة الليزر وكسب في منتصف المكدس Z لكل قناة (405 و 488 و 555) وتعيين القيم تحت علامة التبويب تصحيح كثافة Z. تعيين نفس القيم للشريحة السفلية.
   4. قم بالتمرير عبر الجنين حتى تبدأ إشارات الفلورسية في الظهور باهتًا. زيادة كسب كل قناة حتى تظهر كثافة الإشارة مشابهة للجزء السابق. تعيين القيمة الجديدة تحت علامة التبويب تصحيح كثافة Z. كرر حتى اكتمال z-مكدس. إعدادات الاستيراد مرة أخرى إلى الاستحواذ ND.
   5. تشغيل المسح الضوئي باستخدام خيار تصحيح تشغيل Z.

7. تحليل باستخدام برنامج Imaris

ملاحظة: في هذه الخطوات، سيتم تحليل الصور المحورية باستخدام برنامج تحليل الصور المجهرية، إصدار Imaris 9.2.0. خلال هذا التحليل، سوف نختار أولاً المناطق ذات الأهمية التي سيتم تحليلها من خلال إنشاء أسطح. بعد ذلك، سنستخدم وظيفة القناع لفصل هذه المناطق بصريًا. وأخيراً، سنستخدم وظيفة Spot لتحديد عدد ECs داخل كل منطقة ذات أهمية.

1. اعتمادًا على برنامج التصوير المستخدم في الخطوة 6، قم بتحويل الصور إلى .ims باستخدام محول ملفات Imaris.
2. افتح ملفات .ims. تعيين الصورة إلى Orthogonal تحت الكاميرا / التسميات | لوحة نوع الكاميرا.
3. تحديد موقع PAAs وتوجيه الصورة لالظهور.
   ملاحظة: عند فتح الملفات لأول مرة، ستظهر كتجميع ثلاثي الأبعاد لكافة الشرائح التي تم صورها. في هذه الخطوة ، سيتم تحديد PAAs من خلال جعل الصورة ثلاثية الأبعاد في صورة 2D. الصورة 2D ثم يسمح لPAAs لتكون موجهة بشكل صحيح للتحليل.
   1. ضمن لوحة الخصائص، قم بإيقاف تشغيل وحدة التخزين. ضمن لوحة الخصائص، انقر على إضافة شريحة تقويم العظام الجديدة. تعيين اتجاه الشريحة إلى مستوى XY. استخدم موضع الشريحة للتمرير خلال الصورة حتى العثور على PAAs.
   2. إذا لم تكن PAAs موازية لأعلى وأسفل الصورة، قم بتدوير الصورة بحرية باستخدام مؤشر الماوس بحيث تعمل PAAs من اليسار إلى اليمين عبر الشاشة. ضمن القائمة المنسدلة لمعالجة الصور، حدد التدوير المجاني وانقر فوق موافق.
4. تطفو على السطح 3 القوس البلعوم ^الثالث (الشكل 2A، B - B")
   ملاحظة: في هذه الخطوات، سيتم تتبع الأقواس البلعومية وPAAs باستخدام أداة Surface لإنشاء منطقة "سطحية" ذات أهمية. وهذا سيسمح لكل منطقة من الأهمية أن تكون معزولة بصريا من الأنسجة المحيطة بها. هنا نحن وصف الخطوات إلى السطح وتحليل المكونات الانهوفية للقوس البلعوم^{3 rd.} يتم تحليل الأقواس البلعومية 4 و 6 بالمثل.
   1. لسطح البطانة في كامل قوس البلعوم^{3 rd،} انقر على زر إضافة سطح جديد الموجود تحت لوحة الخصائص. انقر نقرا مزدوجا على سطح 1 وإعادة تسمية السطح الجديد إلى "3 قوس البلعوم^rd".
   2. حدد تخطي الإنشاء التلقائي، ثم قم بتحريره يدويًا. تعيين اتجاه السطح إلى مستوى YZ (الاتجاه التاجي). استخدام موقف شريحة لوضع 3^rd البلعوم القوس السطح السطح إلى حيث 3^RD PAA وDorsal أورتا الاتصال.
   3. تدوير الصورة بحيث 3^rd البلعوم القوس السطح الطائرة في العرض. إيقاف تقطيع أورثو 1.
   4. تحت القرعة | كفاف | علامة التبويب الوضع، حدد وظيفة وضع الرسم عن بعد. ضبط إعدادات المعلمة إذا لزم الأمر. الحفاظ على معلمات تسطح متناسقة بين العينات. على سبيل المثال، تباعد فيرتس هو 10 ميكرومتر.
   5. لبدء الظهور، اضغط على مفتاح Esc ثم انقر على زر السحب. تتبع محيط القوس البلعوم^{3 rd} مع مؤشر الماوس. استخدم موضع الشريحة لنقل 10-25 شريحة. تتبع محيط القوس البلعوم. كرر حتى يتم تتبع القوس البلعوم بالكامل.
   6. لإنشاء سطح المنطقة التي تم تتبعها، حدد الزر إنشاء Surface في لوحة الخصائص.
5. الظهور في PAA 3 ^rd (الشكل 2C -C")
   1. لسطح بطانة PAA³ rd، أولا إيقاف المنطقة السطحية من الخطوة 7.4، عن طريق إلغاء اختيار 3^rd مربع سطح القوس البلعوم. ثم انقر على زر إضافة سطح جديد مرة أخرى. انقر نقرا مزدوجا على سطح 1 وإعادة تسمية السطح الجديد إلى "3^RD PAA".
   2. حدد تخطي الإنشاء التلقائي، ثم قم بتحريره يدويًا. تعيين اتجاه السطح إلى مستوى YZ (الاتجاه التاجي). استخدم موضع الشريحة لوضع مستوى سطح PAA³ إلى حيث يتصل^PAA 3 rd و Dorsal Orta، ثم كرر الخطوات 7.4.
6. إخفاء الهياكل السطحية
   ملاحظة: في الخطوات التالية، سيتم ملثمين كل منطقة على السطح من الفائدة. يسمح الإخفاء للمنطقة ذات الاهتمام بأن تكون متميزة بصريًا عن بقية الأنسجة المصوّرة ويسمح بالقياس الكمي لهذه الهياكل المتميزة ذات الاهتمام. أدناه، ونحن نصف الخطوات في Imaris لتصور وتحليل بطانة PAA، فضلا عن الضفيرة - الأوعية الدموية أصغر المحيطة PAAs داخل أقواس البلعوم. في هذه الخطوات، سيتم ملثمين سطح PAA^{3 rd} من أجل تصور وإجراء التحليل فقط على PAAs باستخدام وظيفة بقعة الموضحة في القسم 7.7.
   1. حدد وحدة التخزين من أجل تصور جميع القنوات الملثمين. اضغط على مفتاح Esc من أجل تدوير الصورة ووضع الصورة في موضع XY.
   2. ضمن علامة التبويب تحرير، حدد تحديد القناع لـ PAA^{3 rd.} حدد قناة DAPI وانقر فوق موافق. كرر للقنوات المتبقية.
   3. على لوحة المفاتيح، اضغط على Ctrl + D لعرض لوحة تعديلات الشاشة. حدد كل قناة جديدة وإعادة تسميتها لتوضيح ما تظهره كل قناة. على سبيل المثال، سيؤدي ذلك إلى ثلاث قنوات جديدة: "3^RD PAA DAPI"، "3^RD PAA ERG"، و "3^RD PAA VEGFR2".
      ملاحظة: في الخطوات 7.6.4-7.6.7 سنقوم بإنشاء قنوات للضفيرة القوس البلعومية فقط.
   4. لتصور الضفيرة الانبوثيولية بشكل منفصل عن PAA ، سنقوم أولاً بتحديد اختيار القناع لسطح PAA^{3 rd.} حدد قناة DAPI. إلغاء تحديد تحديد voxels خارج السطح إلى والتحقق من تحديد voxels داخل السطح إلى أزرار، تعيين حدد voxels داخل السطح إلى الصفر. انقر فوق موافق.
   5. كرر للقنوات المتبقية. وستستثنى هذه العملية المنطقة التي تحتوي على سلطة الحماية الفلسطينية من القنوات الملثمة الجديدة. إعادة تسمية القنوات لتوضيح ما تعرض كل قناة. فعلى سبيل المثال، سيؤدي ذلك إلى ثلاث قنوات جديدة: "غير PAA DAPI"، و "غير PAA ERG"، و "غير PAA VEGFR2".
   6. لتصور الضفيرة الانبوثلية داخل قوس البلعوم^{3 rd،} حدد اختيار قناع تحت علامة التبويب تحرير، لسطح القوس البلعوم^3. حدد قناة DAPI غير PAA. انقر فوق موافق.
   7. كرر للقنوات المتبقية غير PAA. إعادة تسمية القنوات لتوضيح ما تعرض كل قناة. على سبيل المثال، سيؤدي ذلك إلى ثلاث قنوات جديدة: "Plexus DAPI"، "Plexus ERG"، و "Plexus VEGFR2".
7. القياس الكمي لأرقام المفوضية الأوروبية
   ملاحظة: تعبير ERG علامات النوى الانبية مما يجعلها مريحة لقياس أرقام المفوضية الأوروبية. في هذه الخطوات، سيتم قياس عدد ECs باستخدام دالة Spot لإنشاء بقعة لكل EC تميزت بتعبير ERG في PAA وplexus. في القسم 7.7 ، سيتم إنشاء بقع لكل خلية إيجابية ERG في PAA الملثمين ، تليها إزالة البقع في خلايا EDG-positive إيجابية ، VEGFR2-negative.
   1. على لوحة المفاتيح، اضغط على Ctrl + D لعرض لوحة تعديلات الشاشة. إيقاف جميع القنوات باستثناء PAA ERG.
   2. ضمن علامة التبويب الخصائص، انقر على زر إضافة بقع جديدة. انقر على البقع 1 وإعادة تسميته إلى "عدد PAA الإجمالي من ECs". انقر على زر السهم الأزرق. بالنسبة للقناة المصدر،حدد قناة PAA ERG. ضبط القطر XY المقدر إلى 4 ميكرومتر. انتقل إلى اللوحة التالية بالنقر على زر السهم الأزرق.
   3. ضبط عدد البقع التي تم رؤيتها باستخدام المقياس المنزلق، لضمان تمثيل كل نواة EC (التي تم تمييزها بتعبير ERG) ببقعة واحدة. انقر على زر السهم المزدوج الأخضر.
   4. إيقاف تشغيل قناة PAA ERG في ضبط الشاشة. بدوره على قناة PAA VEGFR2 لتصور PAA endothelium.
   5. ولتحديد عدد الـ ECs بدقة، نضمن أن تعبر كل بقعة عن كل من علامات EC، ERG و VEGFR2. للقيام بذلك، حدد سطح الكائن تحت علامة التبويب تحرير | إضافة/حذف لوحة. اضغط على مفتاح Esc وحذف أي بقع ليست إيجابية VEGFR2، عن طريق الضغط باستمرار التحول واختيار المكان.
      ملاحظة: في الخطوة التالية، سيتم إنشاء بقع لكل خلية إيجابية ERG في الضفيرة ملثمين، تليها deselection من البقع في ERG-إيجابية، VEGFR2-الخلايا السلبية.
   6. ضمن علامة التبويب الخصائص، انقر على زر إضافة بقع جديدة. حدد البقع 1 وإعادة تسمية إلى "عدد الإجمالي Plexus من ECs". انقر على زر السهم الأزرق. بالنسبة للقناة المصدر، حدد قناة Plexus ERG. ضبط القطر XY المقدر إلى 4 ميكرومتر. كرر الخطوات 7.7.1 - 7.7.5 للعدد الإجمالي للمراكز الإلكترونية للبلكسوس.
   7. انقر على علامة التبويب إحصائيات كل وظيفة بقعة لتحديد العدد الإجمالي للشركات الإلكترونية في الضفيرة القوس 3^rd PAA والبلعوم.
   8. كرر الخطوات 7.7.1 - 7.7.6 للPAAs المتبقية والضفيرة القوس البلعومية.

ينتج بروتوكول الفلوروريسسين الكامل المعروض هنا نتائج واضحة ونظيفة ، مما يسمح بإعادة بناء البطانة القوسية البلعومية ثلاثية الأبعاد ، كما رأينا في الشكل 1A. من المهم احتضان الأجنة لفترة كافية من الوقت في كل محلول من الأجسام المضادة لضمان الاختراق الكامل من خلال العينة ، وكذلك غسل الأجنة تمامًا بعد حضانة الأجسام المضادة. في الشكل 1B، تظهر نقاط كبيرة ومشرقة نتيجة للجسيمات في الأجسام المضادة أو عرقلة الحلول العازلة. لقد وجدنا أن الطرد المركزي لكل حل قبل الاستخدام وفترات أطول من الغسل PBST بعد كل حضانة الأجسام المضادة يحل هذه المشكلة.

ويوضح الشكل 2 العملية المستخدمة لسطح قوس البلعوم وPAA للتحليل على النحو المبين في الفرع 7 من البروتوكول. باستخدام وظيفة ملثمين ، برنامج Imaris يسمح المناطق السطحية ليتم فصلها بصريا وتحليلها بشكل مستقل.

يوضح الشكل 3 إخفاء الفردية للمقصورات الوعائية المختلفة في أقواس البلعوم: PAA(الشكل 3A, B, C)والضفيرة(الشكل 3A', B', C'). يسمح الإخفاء بتحليل وتقدير أرقام المفوضية الأوروبية في كل هيكل على حدة. في الشكل 3C-C ،يتم استخدام ميزة Spot لتحديد العدد الإجمالي للشركات الإلكترونية في كل من PAA و plexus ، عن طريق تعيين بقعة واحدة لكل نواة تعبر عن ERG. من المهم ملاحظة أن الخوارزمية المستخدمة لدالة Spot مصممة لإنشاء نقطة لأي بكسل من حجم محدد. ERG، الذي يستخدم هنا كعلامة من نواة الجماعة الأوروبية، وأعرب أيضا في خلايا كريست^{العصبية 8}. خلايا كريست العصبية لا تعبر عن VEGFR2. يوضح الشكل 3D مثالًا على بقعة إيجابية (خضراء) (خضراء) وVEGFR2 سالبة (وردية) تم إنشاؤها بواسطة وظيفة Imaris Spot. ونتيجة لذلك، من الضروري التحقق من أن كل نقطة تمثل EC واحدة وتسمى مع كل من ERG و VEGFR2.

الجدول 1: نظرة عامة على بروتوكول الفلورالنسي الكامل. O/N - بين عشية وضحاها؛ RT - درجة حرارة الغرفة.

الشكل 1: مقارنة الصور النظيفة والقذرة بعد الفلورالنسية الكاملة. تظهر وجهات النظر الساغتيتية للجنين E10.5 استخدام الأجسام المضادة المضادة لـ VEGFR2 (أبيض) لتصور البطانة PAA. الأجنة غسلها جيدا مع PBST بعد حضانة الأجسام المضادة(A)لديها نسبة أعلى إشارة إلى الضوضاء وتنتج صورة أنظف، بالمقارنة مع الأجنة التي لا يتم غسلها جيدا(B). تظهر السهام في B مناطق الضوضاء / الأوساخ التي ظهرت في الصورة عندما لا يتم غسل الجنين تمامًا أو لم يتم طرد محلول الأجسام المضادة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ظهور قوس البلعوم (PA) وPAA. يتم استخدام عرض sagittal 2D(A)لتحديد موقع PAAs في الصورة المحورية. شريحة تقويم العظام التاجية(A، الخط الأصفر)هو مكان من خلال PAAs. ثم يظهر القوس البلعوم(B)وPAA(C)في الاتجاه التاجي باستخدام أداة الرسم عن بعد في إيماريس. يتم استخدام أداة الرسم عن بعد ، التي تم تعيينها إلى 10 ميكرومتر ، لتتبع محيط القوس البلعوم^الثالث (B)أو PAA(C). يتم رسم الخطوط العريضة كل 10-25 شريحة من خلال القوس بأكمله(B' ، C ' ). يتم الجمع بين الخطوط العريضة لتوليد سطح 3D من القوس البلعوم(B") أو PAA(C"). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: القياس الكمي لأرقام الجماعة الأوروبية في وكالة الـPAA وplexus. وتستخدم إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لتصور هيكل السفينة والتعبير عن علامات الجماعة الأوروبية في وكالة تشجيع الإنشاء اتّحدة أو في ضفيرة الجماعة الأوروبية بشكل منفصل. لوحات A-A' تظهر التعبير عن VEGFR2 في PAA(A، أصفر)وفي الضفيرة(A'، الوردي). لوحة A" يوضح دمج التعبير PAA وplexus VEGFR2. لوحات B-B' إظهار التعبير عن ERG في PAA(B, أحمر)وفي الضفيرة(B', الأخضر). لوحة B" يوضح دمج PAA وplexus. سي سي. يتم استخدام وظيفة بقعة في Imaris لتحديد عدد ECs إما في PAA أو الضفيرة. يتم تعيين كل خلية إيجابية ERG في PAA(C أو red)أو plexus(C'، Green)بقعة واحدة للاحتفال بنسخة واحدة من EC. يظهر السهم في C'D مثال ERG-إيجابية، VEGFR2-السلبية بقعة في الضفيرة التي تم إنشاؤها بواسطة وظيفة بقعة Imaris. هذه البقعة مستثناة من القياس الكمي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد وفرت القدرة على تصور البطانة في أجنة الماوس في 3D رؤى جديدة في تطورها³. نقدم هنا بروتوكولًا يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأجنة ، وتصور الاتصال بالأوعية الدموية ، والتحليلات الكمية لتشكيل PAA. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمعرفة كيف تؤثر التعديلات الوراثية أو الإهانات البيئية على تطوير PAA. الإجراء المبلغ عنه هنا يستخدم الأجسام المضادة ضد VEGFR2 و ERG لتصور تشكيل PAA وقياس عدد المفوضية الأوروبية؛ ومع ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة إضافية لتصور وتحليل جوانب أخرى من تطوير الشريان القوس، مثل تجنيد كريست العصبية أو تمايز خلايا العضلات الملساء. إذا كان هذا الإجراء هو أن تستخدم في المراحل المبكرة من تكوين الجنين، من المهم أن نلاحظ أن بعض المستضدات (على سبيل المثال، ERG) المكتشفة في هذا البروتوكول قد لا يتم التعبير عنها بعد. يمكن استخدام البقع النووية الأخرى مثل DAPI أو DRAQ5 أو وضع علامات النسب مع أجهزة التتبع الموسومة نوويًا لتحديد عدد EC.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول: ضمان عدم جفاف الأجنة 1 بين تغييرات الحل؛ وضمان عدم وضع الأجنة بين التغييرات في المحلول؛ وضمان عدم التوصل إلى حلول للأجنة. 2) يتم غسلالأجنة جيدا بعد حاضنات الأجسام المضادة؛ و 3) أن الأجنة هي المجففة تماما مع MeOH قبل تطهير الأنسجة مع BABB.

تعمل مغسلات الميثانول قبل تطهير الأنسجة على غرضين: القضاء على الفلورسينس بسبب التعبير عن البروتينات الفلورية (مثل التعبير عن EGFP أو tdTomato المستخدمة لتتبع النسب) في الجنين ، وتجفيف الأنسجة. القضاء على الفلورسينس من البروتينات الفلورية يسمح لاستخدام أي مزيج من الفلوروفورورس للتصوير. يمكن استخدام الأجسام المضادة ضد EGFP و TdTomato (الكرز) لتصور التعبير عن هذه البروتينات الفلورية. بدلا من ذلك، يمكن استبدال MeOH برباعي هيدروفوران للحفاظ على فلورسسينس من البروتينات الفلورية⁹.

لقد وجدنا أن الأجنة التي لم يتم تجفيفها بشكل صحيح قبل تطهير BABB يصعب صورتها بسبب تشتت الضوء. BABB هو محلول كاره للماء يتطلب جفافًا كاملًا في مذيب عضوي من أجل مسح الأنسجة المبهمة. تطهير كامل يضمن القدرة على الحصول على الصور في أعمق المستويات الممكنة داخل الجنين^10،11. في هذا البروتوكول، استخدمنا هدف الغمر 20x المياه، نظرا لمسافة العمل الطويلة وتوافر في وقت تجاربنا. أهداف الغمر النفط هي أفضل مناسبة لهذا البروتوكول، كما باب والنفط لديها مؤشرات الانكسار أقرب من المياه وباب. ومع ذلك ، على الرغم من الفرق في مؤشر الانكسار ، فإن هدف غمر المياه المستخدم في هذا البروتوكول قدم جودة صورة ممتازة.

هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. BABB المقاصة المستخدمة هنا سامة وتآكل^11،12،13. BABB يذوب الغراء والبلاستيك. إذا لم يتم التعامل مع العينات بشكل صحيح أثناء التصوير ، يمكن أن تتلف عدسة المجهر الموضوعية من قبل BABB التي قد تهرب من العينة عبر الشقوق في قسيمة الغطاء أو ختم مكسور بين المصد Fast Well وقسيمة الغطاء. يمكن استخدام طرق المقاصة التي لا تستخدم المذيبات العضوية ، مثل CLARITY ، كبدائل^10،11،14. يحتوي حل مطابقة مؤشر الوضوح الانكساري على مؤشر انكسار مشابه لمؤشر المياه ، مما يجعله طريقة مقاصة مناسبة إذا كان استخدام هدف غمر الماء. وهناك قيد إضافي لهذا البروتوكول هو أنه لا يمكن تنفيذه إلا على الأنسجة غير الحية، وبالتالي منع تطبيقه للتصوير الحي.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

نشكر بريانا ألكسندر وتساولان أودونيل ومايكل واركالا على القراءة الدقيقة لهذه المخطوطة وتحريرها. وقد دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعهد الوطني للصحة العامة R01 HL103920، R01 HL134935، R21 OD025323-01 إلى SA؛ ويدعم AJR من قبل HL103920-08S1 NHLBI والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية منحة التدريب T32052283-11.