التصميم والتوليف والخصائص الكيميائية الضوئية لمركبات القفص القابلة للنقر

يتم تقديم بروتوكول لتوليف وقياس الخواص الكيميائية الضوئية للمركبات الحبيسة المعيارية مع الجماليات القابلة للنقر.

المركبات قفص تمكين التلاعب الصورة بوساطة من فسيولوجيا الخلية مع القرار المكانية عاليه. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي المحدود للمجموعات المتاحة حاليا والصعوبات في التعديلات التركيبية دون التضحية بكفاءة التحلل الضوئي هي عقبات امام توسيع ذخيرة المركبات الحبيسة للخلايا الحية التطبيقات. وبما ان التعديل الكيميائي للمجموعات المصورة من نوع الكومارين يعد نهجا واعدا لاعداد المركبات الحبيسة ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المتنوعة ، فاننا نقوم بالإبلاغ عن طريقه لتوليف المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي يمكن تعديلها بسهوله مع مختلف الوحدات الوظيفية عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen الخلوية. جزيء منصة وحدات يحتوي علي (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) الميثيل (Bhc) مجموعه كمجموعه الصورة الشيخوخة ، الذي يسلك كفاءه عاليه التحلل الضوئي مقارنه مع تلك التقليدية 2-نيتروبنزيلز. يتم عرض الإجراءات العامة لاعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الأمينات والكحوليات والكربوكسيلات. يمكن ادراج خصائص اضافيه مثل القدرة علي الذوبان في الماء واستهداف الخلايا بسهوله في المركبات الحبيسة القابلة للنقر. وعلاوة علي ذلك ، تم قياس الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية ، بما في ذلك الغلة الكمية لانحلال الضوء ، وتبين انها اعلي من تلك الموجودة في المركبات الموازية في قفص Bhc. ولذلك يمكن اعتبار البروتوكول الموصوف حلا محتملا للافتقار إلى التنوع الهيكلي في المجمعات الحبيسة المتاحة.

تم تصميم المركبات قفص الجزيئات الاصطناعية التي الوظائف الاصليه هي ملثمين وقتيا بواسطة المرفقة تساهميا الصور القابلة للازاله حماية المجموعات. ومن المثير للاهتمام ، والمركبات قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا توفر وسيله لا غني عنها للسيطرة المكانية من فسيولوجيا الخلوية^{1،2،3،4،5 ،6}. في 1977 ، ذكر انجلس و Schlaeger استر 2-نيتروالبنزيل من كامب كغشاء نفاذيه ومشتق photolabile من كامب⁷. في العام التالي ، وذكرت كابلان 1-(2-نيتروف# ينيل) استر ايثيل من ATP (NPE-ATP) وسميت هذا المركب "قفص" ATP⁸. ومنذ ذلك الحين ، مجموعه من المجموعات الكيميائية القابلة للازاله الضوئية مثل 2-نيتروبنزيلز ، ف-هيدروكسي فيناثلس⁹، 2-(2-نيتروففنين) اثيلس^10،11، 7-نيتروينولين-1-ايلس ^{12، 13}، و (coumarin-4-yl) ميثليس^14،15،16 وقد استخدمت لاعداد المركبات قفص.

ومن المتوقع ان يؤدي تركيب المركبات الحبيسة ذات الخصائص الاضافيه المستصوبه مثل نفاذيه الغشاء ، والذوبان في الماء ، وقدره الاستهداف الخلوي إلى تيسير التطبيقات البيولوجية للخلايا. وبما ان الخواص الفيزيائية والكيميائية لهذه الجزيئات تعتمد في المقام الأول علي التركيب الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية المستخدمة في اعدادها ، فانه يلزم وجود ذخيرة متنوعة من مجموعات الصور. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي للمجموعات المتاحة حاليا التي تظهر كفاءه عاليه في التحلل الضوئي محدود. وقد يشكل ذلك عقبه امام زيادة استخدام المركبات الحبيسة.

ولمعالجه هذه المسالة ، تم توسيع ذخيرة مجموعات الصور الفوتوغرافية بواسطة التعديل الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية الموجودة أو تصميم الكروم الضوئية الجديدة ذات الخواص الفوتوفيسيكاله الفائقة والكيميائية الضوئية. ومن الامثله علي ذلك نيتروديبنيوبورون (ndbf)¹⁷، [3-(4 ، 5-dimethoxy-2-نيتروفيف# ينيل) -2 بوتيل] (دمنبب)^18،19، والكالسيوم حساسة 2-نيتروالبنزيل الضوئية²⁰، المستبدلة الكومارينيلميثيل (DEAC450²¹ , Deadccm²², 7-azetidinyl-4-ميثيلكومارين²³, و styryl كومارينس²⁴), مشتقات كستنائي (كستنائي-pan)²⁵, ومشتقات bodipy^26,27.

الاضافه إلى ذلك ، قمنا مسبقا بتطوير (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) مجموعه الميثيل (bhc) وتوليفها بنجاح مختلف المركبات قفص من الناقلات العصبية²⁸، الرسل الثاني^29،30، و [اوليغكليوكليدس]^31,32,33 يبدي كبيره واحده-و [2-فوتون] أثاره [كروس-لدس]. إذا كان يمكن تثبيت خصائص اضافيه بسهوله في المجموعات حبس دون المساس بحساسيتها للضوء ، ثم مرجع المركبات قفص يمكن توسيع^{34،35،36، 37،38،39}. ولذلك فقد صممنا مركبات حبيسه مكونه من ثلاثه أجزاء ، وهي مجموعه Bhc كنواه مستجيبة للصور ، ومقابض كيميائية لتركيب وظائف اضافيه ، والجزيئات التي سيتم إخفاؤها^{40، 41}.

وهكذا ، توفر هذه المادة طريقه عمليه لاعداد المركبات في قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا. يصف هذا البروتوكول طرق اعداد منصة قابله للنقر للمجموعات المصورة ، وإدخال وظائف اضافيه لتوسيع ذخيرة المركبات الحبيسة ، وقياس المواد الكيميائية الفيزيائية والضوئية خصائص ، والاستهداف الانتقائي من نوع الخلية لمركب محبوس قابل للنقر لمزيد من التطبيقات الخلوية.

1-توليف مجموعه باباتش النمطية لمركبات القفص القابلة للنقر^28،41

1. اعداد (6-برومو-7-هيدروكسيكومارين-4-yl) كلوريد الميثيل (Bhc-CH₂Cl)
   1. ضع 4-بروموريسورسينول (9.742 غ ، 51.5 ملليمول) في قارورة ذات قاع دائري 100 مل مجهزه بشريط الركاب.
   2. يضاف المزيج_الرابع (98 ٪ ، 30 مل) إلى القارورة ويحرك الخليط ليذوب.
   3. أضافه ايثيل 4-كلورواسيتالوخلات (10 مل ، 74 ملليمول) قطره.
   4. استمر في تحريك الخليط في درجه الحرارة المحيطة لمده 5 أيام.
   5. بشكل منفصل ، مكان مكعبات الثلج المسحوق (~ 200 mL) في قارورة 500 mL Erlenmeyer.
   6. يسكب خليط التفاعل في الثلج ويحرك بقوة لمده 30 دقيقه حتى يتم الحصول علي الترسبات المسحوقة ناعما.
   7. جمع الراسب عن طريق الترشيح فراغ. يغسل الضوء البني الراسب مع الماء خمس مرات.
   8. تجفيف الراسب تحت فراغ بين عشيه وضحيها لإنتاج BhcCH₂Cl كمسحوق بني فاتح (13.57 غرام ، 46.9 ملليمول).
2. اعداد (6-برومو-7-هيدروكسيكومارين-4-yl) الميثانول (BhcCH₂OH)
   1. ضع BhcCH₂Cl (1.1440 g ، 3.95 ملليمول) و 1 م HCl (300 مل) في قارورة ذات قاع مستديرة 1 لتر مجهزه بمكثف ديروث. يحرك المزيج عند 140 درجه مئوية لمده 5 أيام. بعد هذا الوقت ، وتبريد الخليط إلى درجه الحرارة المحيطة.
   2. أزاله الماء من رد الفعل عن طريق التبخر الدوارة تحت فراغ لإنتاج BhcCH₂آوه (1) كمسحوق بني فاتح (1.0359 غرام ، 3.82 ملليمول ، 97 ٪ الغلة).
      ملاحظه: استخدام 250 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 م لكل 1 غرام من BhcCH₂Cl يعطي نتيجة مرضيه.
3. اعداد باباتش₂آوه (2) عبر رد الفعل مانيش
   1. مكان بارافورمالدهيد (446.4 ملغ ، 14.9 ملليمول) في قارورة 50 mL جولة القاع. أضافه الايثانول لامائية (5 مل) و N-ميثيلبروبارجيليمين (1.25 ml ، 14.8 ملليمول) إلى القارورة.
   2. يحرك المزيج في درجه حرارة المحيط لمده 1 ساعة تحت الغلاف الجوي.
   3. أضف BhcCH₂OH (1) (1.367 g, 5.04 ملليمول) إلى القارورة. يسخن الخليط إلى 80 درجه مئوية مع جهاز سخان كتله ، ومواصله أثاره الخليط في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة تحت الجو Ar.
   4. وقف سخان كتله وتبريد خليط التفاعل إلى درجه حرارة الغرفة.
   5. جمع الناتج الضوء البني والأصفر يعجل عن طريق الترشيح فراغ. يغسل الراسب مرتين مع كميه صغيره من الايثانول لامائي (1 مل في كل مره).
   6. أزاله الايثانول الزائد تحت فراغ لإنتاج باباتش₂آوه (2) (1.393 g ، 3.96 ملليمول).

2-اعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر

ملاحظه: يمكن تطبيق الإجراءات التالية لاعداد المركبات الأخرى القابلة للنقر التي تحتوي علي الهيدروكسيل والامينيه والمجموعات الوظيفية الكربوكسيل في وقت متاخر.

1. الاجراء العام 1: اعداد أمين قفص قابل للنقر
   1. ضع باباتش₂آوه (2) (709.6 mg, 2.02 ملليمول) و n,n '-الكربوكسيل ديميدازول (CDI, 397.6 ملغ, 2.45 ملليمول) في قارورة 30 مل مستديرة القاع. أضافه الجافة CH₂Cl₂ (6 مل) ويحرك الحل في درجه الحرارة المحيطة لمده 1 ساعة.
   2. أضافه 4-ثنائي ميثيل امينوبيدودين (4-دماب ، 324.8 ملغ ، 2.66 ملليمول) وتيرتيبوتيل (6-aminohexyl) carbamate (533.1 ملغ ، 2.46 ملليمول). يحرك المحلول عند درجه الحرارة المحيطة لمده 3 ساعات.
   3. أزاله المذيبات وغيرها من المواد المتطايرة باستخدام المبخر دواره تحت فراغ. تنقيه بقايا مباشره باستخدام السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.
2. الإجراءات العامة 2: اعداد الكحول في قفص القابل للنقر
   1. مكان باكليتاكسيل (ptx ، 48.7 ملغ ، 0.057 ملليمول) في قارورة 30 مل مستديرة القاع مجهزه محبس ثلاثي الاتجاات وبالون Ar. أضافه الجافة CH₂Cl₂ (1 مل) ، 4-dmap (17.1 ملغ ، 0.14 ملليمول) ، و 4-نيتروف# ينيل كلوروفورماتي (26.0 ملغ ، 0.13 ملليمول).
   2. يحرك المحلول في درجه حرارة المحيطة ل 2.5 h تحت جو Ar.
   3. أضافه 4-دماب (15.7 ملغ ، 0.13 ملليمول) و باباتش₂آوه (2) (39.1 ملغ ، 0.111 ملليمول) إلى الحل. مواصله تحريك الخليط في درجه حرارة المحيطة لمده 17 ساعة.
   4. أضافه CHCl₃ (10 مل) و 15 ٪ هيدروكسيد الماء₃ (5 مل) إلى الخليط. يحرك المزيج بقوة لمده 3 دقائق تقريبا. أزاله الطبقة المائية مع ماصه.
   5. يضاف حمض الستريك 0.5 M (5 مل) إلى القارورة التي تحتوي علي الطبقة العضوية. يحرك المزيج ويزيل الطبقة المائية علي النحو المذكور أعلاه.
   6. افصل الطبقة العضوية باستخدام عمود فصل المرحلة. أزاله المذيبات مع المبخر الدوارة تحت فراغ. تنقيه المنتج باستخدام معيار السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.
3. الاجراء العام 3: اعداد حمض الكربوكسيليه القابل للنقر في قفص
   1. تذوب حمض الاراكيدوريك (33.0 μL ، 0.100 ملليمول) ، باباتش₂آوه (2) (39.6 ملغ ، 0.112 ملليمول) ، و 4-دماب (14.1 ملغ ، 0.115 ملليمول) فيCH 2_{Cl 2 (2 مل} ). أضف n,n غاربار-diisoب# روبيل كربوديوميد (Dipc, 17.0 μl, 0.110 ملليمول) ويحرك المحلول عند درجه الحرارة المحيطة لمده 140 دقيقه.
   2. أزاله المذيب تحت فراغ. تنقيه بقايا مباشره باستخدام السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.

3-تركيب وحده وظيفية في المركبات الحبيسة القابلة للنقر

1. حل النحاس (الثاني) كبريتات pentahydrate (249 ملغ) في المياه المتبادلة بين الأيونات (IEW ، 10 مل) لإعطاء 0.1 M CuSO₄ محلول.
2. تذوب 2 غاربار-بابهموك-PTX (8.0 ملغ ، 6.5 μmol) ، تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريوليلميثيل) أمين (THPTA ، 17.5 ملغ ، 40.3 μmol) ، الصوديوم l-اسكوربات (162.4 ملغ ، 0.825 ملليمول) ، و 15-كلورو-3 ، 6 ، 9-تريوكسيابينادريل أزيد (3.1 ملغ ، 11 μmol) في مذيب مختلط من 0.1 M الفوسفات العازلة (2.5 ml ، pH 7.2) وديميثيل سلفوكسيد (dmso ، 0.5 mL).
3. أضافه الحل 0.1 M CuSO₄ (81.2 μl ، 8.1 μmol) إلى خليط التفاعل. يحرك المزيج في درجه الحرارة المحيطة لمده 80 دقيقه. رصد التقدم المحرز في رد الفعل باستخدام اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC).
4. حل الرواسب عن طريق أضافه 75 ٪ اسيتلونيتريل/محلول المياه (3.5 mL). تطبيق الحل الناتج مباشره إلى نظام HPLC شبه معد لتنقيه المنتج المطلوب.
   ملاحظه: الاذابه من خليط التفاعل باضافه ثالثي-butanol يمكن تسريع تطور رد الفعل.

4. رد فعل التحلل الضوئي من المركبات قفص

1. اعداد حلول الأسهم
   1. حل المجمع المطلوب في قفص (5 ميكرومول) في DMSO (500 μL) لاعداد حل الأسهم 10 ملم. الاستغناء عن كل محلول (10 μL) في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL وتخزينها في الفريزر (− 20 درجه مئوية) حتى قبل الاستخدام مباشره.
   2. 6 ملم K₃[Fe (C₂O₄)₃] (100 mL): أذابه بلوره البوتاسيوم الفيوكسيالات (0.295 غرام ، 0.675 ملليمول) في 80 مل من الماء. أضافه 0.5 M H₂حتى₄ (10 مل) وكميه مناسبه من iew لتشكل حجم إلى 100 مل.
      ملاحظه: يجب تنقيه الفيوكسيالات البوتاسيوم عن طريق تبلور من الماء الساخن وتخزينها في الظلام. يتم الحصول علي بلوره البوتاسيوم الفيوكسيالات كما تريهيدرات. ولذلك ، فان تركيبته هي K₃[Fe (C₂o₄)₃] · 3h₂o ووزن الصيغة من 491.24 ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار اثناء اعداد حل الأسهم. تحقق من نقاء المحلول 6 ملم عن طريق قياس امتصاصه عند 510 نانومتر. إذا كان الامتصاص هو < 0.02 ، فهو مناسب للاستخدام في التجربة.
   3. 0.1 ٪ العازلة-phen (30 مل): أذابه NaOAc · 3H₂O (7.35 g) ، 1 ، 10-الخط الظاهري (phen) · H₂O (30 ملغ) ، و conc. h₂حتى₄ (0.9 ml) في iew (20 مل). أضافه IEW لتشكل حجم إلى 30 مل.
      ملاحظه: يحتوي الحل علي 1.8 M NaOAc ، 0.54 M H₂SO₄، و 0.1% 1 ، 10-الخط الظاهري.
2. قياس عدد الفوتونات باستخدام قياس الاكسده الفيوكسيالات
   1. مكان 6 مم ك₃[Fe (C₂O₄)₃] (V₁ L) في cuvette الكوارتز. يشع الحل مع ضوء 350 nm لمده 5 ليالي.
   2. نقل المحلول المشع إلى كوفيت pyrex مع طول المسار l [cm].
   3. أضافه 0.1 ٪ العازلة-phen (V₂ L) إلى محلول عينه المشع وتخلط جيدا عن طريق التنضيد. قياس امتصاص العينة في 510 نانومتر. يحسب متوسط تغيير الامتصاص لكل وحده زمنيه (ΔA₅₁₀ [s^{− 1}]).
   4. حساب عدد الشامات من الحديد المتولدة^{2 +} الأيونات لكل وحده الوقت وفقا للمعادلة التالية:
      nfe^{2 +} [mol s^{− 1}] = ((v_{1 +} v₂) [ل] × δa₅₁₀ [s^{− 1}])/(l [cm] × ε₅₁₀ [l mol^{− 1} سم^{− 1}]) ،
      حيث (v_{1 +} v₂) هو حجم العينة لقياس الامتصاص ، l هو طول المسار البصري لل cuvette ، و ε₅₁₀ هو امتصاصية المولي من Fe^{2 +}- مجمع فينو في 510 نانومتر.
      ملاحظه: في الظروف التجريبية النموذجية ، قيم v₁ = 2.0 × 10^{− 3} لتر ، v₂ = 0.33 × 10^{− 3} لتر ، l = 1.0 سم ، و ε₅₁₀ = 1.1 × 10⁴ لتر^{مول− 1} استخدمت سم^{− 1} .
   5. احسب عدد الشامات من الفوتونات التي تصل إلى العينة (I₀) باستخدام الصيغة التالية:
      انا₀ [اينشتاين سم^{− 2} س^{− 1}] = nfe^{2 +}/Φ₃₅₀
      حيث Φ ₃₅₀ هو كفاءه الكم من فوتوكسيالات في 350 nm.
      ملاحظه: علي الرغم من انه لم يتم الإبلاغ عن الكفاءة الكمية لمقياس الصوديوم الفيوكسيالات المؤكسد عند 350 نانومتر ، فان القيمة المبلغ عنها 1.25⁴² في 358 نانومتر كانت تستخدم.
3. قياسات كفاءه الكم عند 350 نانومتر
   1. تمييع محلول الأسهم عينه (في DMSO ، 10 μL) مع العازلة K-MOPS (pH 7.2 ، 10 مل) لإعطاء محلول 10 μM في ك-MOPS التي تحتوي علي 0.1 ٪ DMSO.
      ملاحظه: وتالفت العازلة K-MOPS من 100 mM KCl و 10 مم 3-(ن-مورفينو) حمض بروبانيسولفونيك (mops) معايره لدرجه الحموضة 7.2 مع كوة.
   2. نقل المحلول (V₁ L) إلى نفس كوفيت المستخدمة في فوتورياكشن من مقياس الاكاكتيمتر الكيميائي. يشع الحل عينه باستخدام نفس الاعداد كما هو موضح في الخطوة 4-2-1.
   3. أزاله قسامه (50 μl) من المحلول المشع بشكل دوري وتحليل باستخدام hplc.
   4. حددت الإشعاع وقت, في ثانيه, في اي 90% من ال [سترتينغ متريل] يتجاوب ([ت]_90%) ب يلائم قطعات من الاختفاء يعتمد وقت من ال يبدا ماده.
      ملاحظه: يجب الحفاظ علي امتصاص العينة المشعة عند < 0.1 بحيث يمكن إهمال التصفية الداخلية للإشعاع. فمن المستحسن ان استهلاك الضوئية من مواد البداية يمكن ان يقترب من تسوس أحاديه الاسي بحيث لا يوجد اي تاثير ثانوي غير مرغوب فيه ان يتداخل مع عمليه التحلل الضوئي.
   5. حساب الغلة الكم من الاختفاء (Φ_ديس) باستخدام المعادلة التالية²⁸:
      Φ_ديس = 1/(t_{90 ٪} × انا₀ × σ₃₅₀)
      حيث t_{90 ٪} [s] هو الوقت التشعيع الذي تم استهلاك 90 ٪ من مواد البداية ، انا₀ [اينشتاين سم^{− 2} ق^{− 1}] هو عدد من الشامات من الفوتونات ، و σ₃₅₀ [سم ² [مول-¹] [ديكاديك] انقراض معامل من العينة في 350 [نم].
      ملاحظه: σ₃₅₀ [cm² mol −¹] = 10³ε₃₅₀ [م^{− 1} سم^{− 1}].

5. استهداف مجمع قفص قابل للنقر مع الاربطه HaloTag

ملاحظه: قبل الاستخدام ، والحفاظ علي الخلايا هيلا في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM ، وانخفاض الجلوكوز ، بيروفات الصوديوم ، l-الجلوتامين) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (التي تحتوي علي 1 ٪ المضادات الحيوية (كبريتات العقديات ، البنسلين G ، و amphotericin) في 37 درجه مئوية و 5% CO₂.

1. أزاله المتوسطة وتريبسينايز الخلايا عن طريق علاج مع حمض التريبسين-ايثيل ديلينترايتاياستيك (أدتا ، 1 مل) في 37 درجه مئوية لمده 1 دقيقه. أضافه DMEM (4 مل) إلى الخلايا وأعاده تعليق الخلايا عن طريق التنقيط برفق. البذور تقريبا 5 × 10⁵ خلايا لكل طبق في الاطباق السفلية من الزجاج 35 مم في dmem (2 مل) 24 ساعة قبل التحويل.
2. لأربعه اطباق ، في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ، تمييع الحمض النووي البلازميد (pcDNA3-هاله-egfr ، 14 ميكروغرام) في المتوسط مصل مخفضه (700 μl). بشكل منفصل ، تمييع كاشف الدهون (5 μL) في المصل المنخفض المتوسط (150 μL) في كل من أربعه أنابيب والسماح لهم الوقوف في درجه حرارة المحيطة لمده 5 دقائق.
3. أضافه جزء من الحمض النووي المخفف البلازميد (150 μl) لكل من عينات كاشف ليبوفيكشن المخفف. احتضان في درجه الحرارة المحيطة لمده 5 دقائق.
4. بعد الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ ل 24 ساعة ، يستنشق dmem وشطف الخلايا مع الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني ، 2 مل). يضاف المصل المخفض المتوسط (1.5 مل).
5. يضاف الكاشف الشحمي بالبلازما (150 μL) إلى كل طبق. الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ ل 48 h.
6. يستنشق المتوسطة ، أضافه جزء من DMEM أعدت طازجه (1 مل) التي تحتوي علي 2 μM بابهك-عرافه-FITC/هاله ، واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ لمده 30 دقيقه.
7. يستنشق المتوسطة التي تحتوي علي المركب في قفص وشطف الخلايا مرتين مع تلفزيوني + (1 مل لكل شطف) لأزاله اي مركبات غير منضم. يضاف متوسط المصل المخفض (500 μL) واحتضان الخلايا عند 37 درجه مئوية و 5% CO₂ لمده 30 دقيقه لأزاله المركبات التي دخلت الخلايا.
   ملاحظه_{: وهو} الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة مع 2 مم cacl 2 و 1 مم_{mgcl 2}.
8. أزاله المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع تلفزيوني + (1 مل). أضف جزءا من متوسط (1 مل) لا يحتوي علي الفينول الأحمر. سجل الصور الفلورية عن طريق المسح الضوئي بالليزر المجهر مضان البؤري.

6. التحوير photomediated من التعريب كيناز باستخدام مجمع قفص القابل للنقر

ملاحظه: قبل الاستخدام ، والحفاظ علي الخلايا تشو-K1 في المتوسطة F-12 Ham المضافة مع 10 ٪ في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂.

1. اعداد 100 العمل × الحل (1 ملم) من باباتش-AA (5) في dmso.
   ملاحظه: يتم اعداد حل الأسهم 10 ملم من المجمع وتخزينها في الفريزر (-20 درجه مئوية).
2. البذور تقريبا 5 × 10⁵ خلايا لكل طبق في الاطباق السفلية من الزجاج 35 مم في dmem (2 مل) 24 ساعة قبل التحويل.
3. Transfect تشو-K1 الخلايا مع الترميز البلازميد ل gfp-dgkγ 48 h قبل التجارب غير المزدحمة.
   ملاحظه: يتم تنفيذ التحويل وفقا للخطوات 5.2 – 5.5.
4. استبدل الوسط بوسط مصل مخفض (2 مل). أضافه 100 × الحل العمل بابهك-AA (20 μL) واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ لمده تتراوح بين 5 دقيقه و 1 ساعة.
   ملاحظه: يعتمد وقت التحميل علي المركب المستخدم.
5. ضع الخلايا علي المرحلة الموضوعية من المجهر الفلوري المقلوب المزود بمصباح مضان للضوء المزدوج.
6. خذ صوره فلورية كل 10 ليالي. يشع الخلايا مع 330-385 نانومتر الضوء من خلال هدف المجهر لوقت مناسب. بدلا من ذلك ، تشع الخلايا مع ضوء 405 nm باستخدام مصباح Xe من خلال ألياف الكوارتز المرنة.
7. استمر في تسجيل الصور الفلورية لمده 10 دقائق.

مركبات قفص قابل للنقر من بعض الجزيئات المثيرة للاهتمام بيولوجيا ، بما في ذلك حمض الاراشيدوريك و paclitaxel ، تم توليفها بنجاح (الشكل 1)^28،41. وقدمت خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية في بابهموك-PTX عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen cyclization ("انقر" رد فعل) (الشكل 2). ثم تم فحص هذه PTXs القابلة للنقر في قفص لإنتاج PTXs الام عند التشعيع عند 350 نانومتر (الشكل 3) ، ويلخص الجدول 1 الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات القابلة للنقر في القفص. غله الكم من المركبات قفص قابل للنقر 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX (φ_ديس 0.14) و باباتش-AA (φ_ديس 0.083) كانت أكثر من ضعف تلك المركبات التقليدية قفص BHC 2 غاربار-bhcموك-ptx (Φ_ديس 0.040) و Bhc-AA (Φ_dis 0.038)⁴³. الاضافه إلى ذلك ، لوحظ تحسن الذوبان في الماء لمده 2 غاربار-glc-بابهموك-PTX ، الذي يحتوي علي الجلوكوز moiety.

في تجارب الخلايا الحية ، تم تحقيق استهداف باباتش-عرافه-FITC/هاله إلى خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار من بروتين HaloTag ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) بنجاح. ولوحظ الفلورية الخضراء من فلوريسئين شارده من باباتش عرافه-fitc/هاله علي غشاء الخلية (الشكل 4). وقد تم التوصل إلى تشكيل التعريب الخلوي للكيناز باستخدام مركب باباتش في قفص. تم الإبلاغ عن النقل من γ كيناز التشكيل (DGKγ) ليتم تنشيطها في وجود حمض الاراكيدوريك (AA)⁴⁴. تم التعامل مع الخلايا تشو-K1 عابره التعبير عن GFP-DGKγ مع اما AA أو باباتش-AA (5). وتسببت أضافه AA في تحوير التوطين تحت الخلوية من DGKγ (الشكل 5ا ، ب). ولوحظت تغييرات مماثله في توطين DGKγ للخلايا المعالجة باباتش-AA بعد التعرض للضوء فوق البنفسجي (الشكل 5ج ، د).

الشكل 1: اعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر.
(ا) الكواشف والشروط: ا. ايثيل 4-كلورواسيتالوخلات/كونك. ح₂حتى₄/rt/7 أيام/91 ٪ العائد ، b. 1 م HCl/الجزر/3 أيام/97 ٪ العائد. c. N-ميثيلبروبارجيليمين/Hcho/etoh ، ثم أضافه (1) والحرارة في الجزر ل 17 h/79 ٪ العائد. (ب) التوليفات من أمين قفص القابلة للنقر ، ptx ، وحمض الاراشيدوريك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تركيب الوحدات الوظيفية في المركبات الحبيسة القابلة للنقر.
(ا) توليف الأقفاص القابلة للذوبان في الماء بواسطة النحاس (I)-يحفز الخلايا الخلوية. (ب) هياكل المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الاربطه الخلوية ولاستهداف الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التحلل الضوئي لغاربارين (6).
عينات (10 μM) في الحل ك-MOPS (pH 7.2) كانت المشع في 350 نانومتر. (ا) اثار hplc النموذجية للتحلل الضوئي ل 6 (مقاسه عند 254 نانومتر). تم تحليل العينات في وقت التشعيع المحدد. (ب) الدورة الزمنيه لتحلل الصور من 6. الدوائر الزرقاء تظهر استهلاك 6. خط الصلبة يظهر منحني الأقل المربعات يصلح لاسي المتحللة بسيطه ل 6. تظهر المربعات الحمراء العائد من PTX. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري (± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الصور الفلورية لخلايا الثدييات المثقفة المحتضنة مع باباتش-هيكس-FITC/Halo (8).
تم احتضان الخلايا مع pcDNA3-هاله-EGFR مع محلول 2 μM من مجمع 8 في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. تم الحصول علي الصور بعد الغسيل المتكرر مع تلفزيوني +. الخلايا HEK293T المعالجة الصورية (A: صوره تباين التداخل التفاضلي (DIC) و D: صورهمضان). خلايا HEK293T (b و E) والخلايا هيلا (c و F) تعبر بصوره عابره هاله-egfr (B و C: الصور DIC و E و F: الصور الفلورية). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الصور الفلورية بعد الاشعه فوق البنفسجية للخلايا تشو-K1 حضنت مع bhc في قفص الاراكيدونيك حمض. تم نقل خلايا تشو K1 مع بروتين الانصهار DGKγ-EGFP.
(ا) صوره مضانه للخلايا الناقلة. (B) 100 s بعد أضافه محلول 10 μM من حمض الاراكيدوريك. (ج) تم احتضان الخلايا مع محلول 10 ΜM من باباتش-AA (5) عند 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق (د) 100 ثانيه بعد الاشعه فوق البنفسجية 20-s (330-385 نانومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات المحبوسة القابلة للنقر.
ا. امتصاص الحد الأقصى (نانومتر) ، b. امتصاصية المولي في λ_max (م^{− 1} سم^{− 1}) ، c. الغلة الكم من اختفاء مواد البداية في 350 نانومتر ، د. المنتج من امتصاصية المولي والغلة الكم من الاختفاء في 350 نانومتر ، ه. تركيز المحلول المشبع في K-MOPS (pH 7.2) (ميكروغرام mL^{− 1}).

وضعنا سابقا bhc المركبات قفص من مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تظهر كفاءه عاليه الضوئية^{28،45،46،47}. وبهدف توسيع نطاق مرجع مجموعات bhc ، أبلغنا أيضا عن منصات للمركبات الحبيسة المعيارية التي يمكن تعديلها بسهوله عنطريق إدخال وحدات وظيفية^{مختلفه 32 ،40،41}. ولذلك فان هذا البروتوكول يمثل طريقه لتوليف سلائف قابله للنقر عليها من مجموعات Bhc التي يمكن تعديلها عن طريق النحاس (I)-الذي يحفز الخلايا الخلوية. وقد تحقق توليف السلائف القابلة للنقر ، باباتش₂آوه (2) ، عن طريق تسلسل رد فعل من أربع خطوات بدءا من المتاحة تجاريا 4-بروموريسورسينول (الشكل 1a). وميزه هذا البروتوكول هي انه لا يلزم اتخاذ خطوات تنقيه مضنيه (مثل فصل الفواصل اللونية للعمود).

كما السلائف القابلة للنقر باباتش₂آوه (2) يمكن استخدامها لإخفاء المجموعات الوظيفية المختلفة ، المركبات قفص قابل للنقر من الأمينات والكحول ، وتم توليفها الأحماض الكربوكسيليه باستخدام 2 كما السلائف (الشكل 1b). تم تعديل الأمينات كما بكارباميت في حين تم تعديل الكحول والكربونات الخاصة بهم. في الإجراءات العامة 1 و 2 ، تم استخدام CDI لاعداد carbamates القابلة للنقر ، في حين تم استخدام 4-نيتروف# ينيل كلوروفورماتي لاعداد الكربونات. كما هو مبين من قبل اليه رد الفعل ، يمكن استخدام كل من الكواشف لاعداد كارباماتيس والكربونات. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان الغلة من المجمع قفص المطلوب يعتمد علي التركيب الكيميائي لجزيء ان يكون في قفص. ويمكن النظر إلى أمثله أخرى في تقاريرنا السابقة^{28،30،33،48}.

انقر فوق التعديل ثم أجريت باستخدام تعديل طفيف للاجراء المبلغ عنه⁴⁹. أضافه تريس (تريرازيلميثيل) المستندة إلى أمين يغاندس ضروري للحصول علي المنتجات المطلوبة في جيده لغلات عاليه. منذ مجموعه متنوعة من أزيد متاحه بسهوله علي حد سواء من المصادر التجارية ومن الإجراءات الادبيه ، يمكننا اعداد مختلف المركبات قفص وحدات مع خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية (الشكل 2).

ثم قيس المحصول الكمي من التحلل الضوئي وفقا للاجراء المبلغ عنه^28،50. ويبين الشكل 3 ان استهلاك الصور الضوئية من 2 غاربار--Glc-بابهموك-ptx والإفراج عن ptx كانت تقريبيه الاضمحلال الاسي واحد وارتفاع ، علي التوالي ، مما يوحي بعدم وجود تصفيه داخلية للإشعاع أو الآثار الثانوية غير المرغوب فيها. لوحظ تحسن في غله الكم الكمي (φ) وكفاءه التحلل الضوئي (εφ) لمركبات باباتش القابلة للنقر بالمقارنة مع مركبات bhc المحبوسة^سابقا (الجدول 1)⁴¹، ⁴³. وبما ان كفاءه التحلل الضوئي (εφ) من مركبات bhc في قفص هي أكثر من 100 مره اعلي من تلك المركبات 2-نيتروالبنزيل-نوع قفص⁴⁸، والتحسن الملحوظ بسبب وجود مجموعات الشيخوخة باباتش بشكل واضح ميزه لهذا النظام.

كتجربة إثبات المفهوم ، أدخلت شارده المائية إلى 2 غاربار-بابهموك-ptx (4) والخلوية استهداف يجند أدخلت إلى مجمع 3 (الشكل 2). وكان ذوبان الماء من 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX 650 مرات اعلي من ذلك من PTX الأصل (الجدول 1). وتم تحقيق الاستهداف الخلوي الانتقائي باستخدام نظام التحقق من العلامات ، وكانت بابهموك-عرافه-FITC/Halo (8) التي تحمل الجهاز halotag واستهدفت بنجاح إلى غشاء الخلية من خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار halotag/egfr ( الشكل 4). كما تم التوصل إلى تحوير الصورة الخلوية للكيناز باستخدام المركب المحبوس القابل للنقر 5 (الشكل 5).

في الختام ، نجحنا في إثبات طريقه لاعداد منصات قابله للنقر للمركبات الصورة في قفص من جزيئات مثيره للاهتمام بيولوجيا التي يمكن تعديلها بسهوله مع خصائص اضافيه ، مثل الذوبان في الماء والخلوية استهداف القدرة. وبما انه يمكن استخدام مجموعه "باباتش" لاعداد اي جزيئات ذات مجموعات وظيفية قابله للتعديل ، فان تطبيق هذا البروتوكول لا يقتصر علي الجزيئات الموصوفة هنا. باستخدام منصة وحدات ، وهي مجموعه باباتش الشيخوخة ، ويمكن اعداد المركبات قفص المطلوب بسهوله ، ويمكن التضمين خصائصها الفيزيائية والكيميائية عن طريق تعديل النقر.

ليس لدينا ما نكشف عنه

وكان هذا العمل مدعوما من قبل JSPS KAKENHI منحه رقم JP16H01282 (TF) ، ومنحه في المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره "دينامية الذاكرة" ، و JP19H05778 (TF) ، "MolMovies".