Method Article
* These authors contributed equally
يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.
الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs) هي الأساس الخلوي للهياكل المعقدة ووظائف الدماغ. وهي تقع في محاريب متخصصة في الجسم الحي ويمكن عزلها وتوسيعها في المختبر، بمثابة مورد مهم لزراعة الخلايا لإصلاح تلف الدماغ. ومع ذلك، فإن الـ NSPCs غير متجانسة وغير محددة بوضوح على المستوى الجزيئي أو يتم تنقيتها بسبب عدم وجود علامات سطح الخلية المحددة. البروتوكول المقدم، الذي تم الإبلاغ عنه سابقاً، يجمع بين نظام الثقافة المشتركة العصبية البطانة مع طريقة وضع العلامات على الغليكان الأيضي لتحديد سطح sialoglycoproteome من NSPCs الأولية. يسمح نظام الثقافة المشتركة NSPC-endothelial بالتجديد الذاتي وتوسيع المراكز الوطنية للدعم والتغذية الأولية في المختبر،مما يولد عدداً كافياً من الـ NSPCs. المجموعات الوظيفية البيوثوغنالية. من خلال مقارنة sialoglycoproteome من NSPCs التجديد الذاتي توسعت في ثقافة مشتركة بطانة مع الثقافة العصبية المختلفة، ونحن تحديد قائمة من البروتينات الغشاء التي يتم إثراء في NSPCs. وينطوي البروتوكول بالتفصيل على ما يلي: (1) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية وثقافة مختلفة؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطان 2) وضع العلامات مع azidosugar لكل O-أسيتيل N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz)؛ و 3) البيوتين الاقتران إلى sialoglycan المعدلة للتصوير بعد تثبيت الثقافة العصبية أو استخراج البروتين من الثقافة العصبية لتحليل الطيف الكتلي. ثم يتم اختيار المرشحين علامة سطح المخصب NSPC عن طريق التحليل المقارن لبيانات قياس الطيف الكتلي من كل من NSPC الموسعة والثقافات العصبية المتمايزة. هذا البروتوكول حساس للغاية لتحديد بروتينات الغشاء ذات الوفرة المنخفضة في مواد البداية، ويمكن تطبيقه على اكتشاف العلامات في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة
يتم تعريف الخلايا الجذعية العصبية على أنها مجموعة خلايا متعددة القوى التي يمكن تجديدها ذاتيا للحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية والتفريق في الخلايا العصبية وغليا. وهي أنواع الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي ويمكن أن توفر إمكانات علاجية كبيرة في الطب التجديدي من خلال زرع الخلايا في العقول المريضة والمصابة1،2. مع تقدم التنمية ، يصبح عدد الخلايا الجذعية العصبية غيرمتجانسة 3،4، وتنخفض نسبة الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ تدريجيا5. بشكل عام، توجد الخلايا الجذعية العصبية الجنينية وغيرها من الخلايا السلف العصبية، وتسمى مجتمعة الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs)، في المناطق الإنباتية، والمنطقة البطينية، والمنطقة التحتية في الفئران6. في الدماغ الجنيني، تولد الخلايا الجذعية العصبية الخلايا العصبية بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال خلايا السلف المتوسطة (IPCs)، وفي بعض الأنواع من خلال الذرية المنطقة الفرعية الخارجية (oRGs)7،8. التوقيع الجزيئي المحدد، مورفولوجيا، الموقع في محراب الخلايا الجذعية، وإمكانات التمايز كلها تحدد دور كل نوع فرعي في تكوين الأعضاء في الدماغ والتطبيقات السريرية9. ومع ذلك، فإن علامات سطح الخلية المتاحة حاليالا يمكن أن تميز بشكل لا لبس فيه وتنقية أنواع فرعية مختلفة من NSPCs، مما يحد من فهم واستخدام هذه الأنواع الفرعية.
ويحد من تحديد العلامات السطحية الأولية للمراكز الوطنية للدعم في مجال الحماية ثلاث عقبات رئيسية. الأول هو عدد الخلايا المحدودة من NSPCs في الأنسجة، مما يجعل من الصعب إعداد عينات بروتين سطح الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي المشترك. والقيد الثاني هو صعوبة إنتاج أنواع فرعية من الخلايا النقية لتوليد بيانات بروتين الغشاء الخاص بالنوع الفرعي. وأخيرا، فإن التحدي الثالث هو انخفاض نسبة البروتينات السطحية للخلايا في بروتينات الخلايا بأكملها، مما يعوق حساسياتها الكشف عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي.
للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير نهج كيميائي لتخصيب وتحديد البروتينات السطحية للخلايا بشكل انتقائي في NSPCs الأولية عن طريق وضع العلامات الأيضية للبروتينات sialoglycoproteins10. لتوليد عدد كاف من النقاط الاستراتيجية الوطنية، استفدنا من بروتوكول راسخ لتوسيع والحفاظ على الـ NSPCs الجنينية الأولية في الدول غير المتمايزة في المختبر، من خلال المشاركة في زراعة NSPCs مع خطوط الخلايا البطانية الدماغ الماوس باستخدام دعم نفاذية مصفوفة إدراج(على سبيل المثال، transwell) نظام11. وعلى النقيض من ذلك، فإن NPSCs المستزرعة وحدها دون الخلايا البطانية تولد ذرية مختلفة11،12. وهكذا، يمكن تحليل عينات البروتين من هذين النظامين الثقافة نسبيا لتحديد البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في NSPCs والخلايا العصبية المتمايزة. كما يتم تعديل معظم البروتينات السطحية الخلية من قبل حمض السياليك13، غير طبيعي حمض السياليك السلائف التناظرية N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz) تم استخدامها لاختطاف المسار الأيضي المتأصلة بحيث الذاتية ، حديثا يتم تسمية sialoglycans توليفها مع مجموعات azido، وتوليد مقبض كيميائي14. من خلال التفاعلات الحيوية الأزيدو-الألكيين بوساطة، والتي تترافق الكائنات الحية إلى السيالوجيكانات، يمكن تصور البروتينات السطحية للخلايا وإثرائها لتحديد البروتيوميك من خلال فلوروفور أو مصفوفة14.
هنا، نقوم بتلطيخ تحليل هلام SDS-PAGE للسطح sialoglycoproteome من NSPCs الموسعة في ثقافة مشتركة بطانة وخلايا مختلفة في نظام غير ثقافة مشتركة. نحن أيضا تنقية انتقائية سطح sialoglycoproteome في نظامين الثقافة للمقارنة البروتيومية. بروتوكولنا، مقارنة مع التقليدية المستندة إلى الطرد المركزي خلية سطح البروتوكولاتتنقية 15،يزيد من فعالية استخراج عن طريق الحد من إجراءات استخراج البروتين السطحي من خلال اقتران علامة محددة وتقارب تنقيه. وفي الوقت نفسه، فإنه يزيد من نقاء استخراج البروتينات سطح الخلية على أساس فرضية أن sialylation يحدث في الغالب في البروتينات سطح الخلية. على الرغم من أن العوامل البطانية لا يمكن أن تمنع تماما التفريق بين NSPCs الموسعة، فإن الدراسة المقارنة بين الثقافة المشتركة والثقافة المتمايزة توفر طريقة ملائمة لتحديد البروتينات السطحية الغنية بالخلايا الجذعية دون الحاجة إلى تحليل البروتينات من NPCs تنقية من قبل FACS16. ونحن نعتقد أن هذا النهج يمكن تطبيقه على دراسات البروتينات السطحية في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة.
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها) من جامعة Tsinghua وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للIACUC. وقد تم اعتماد مرفق الحيوانات المختبرية في جامعة تسينغهوا من قبل رابطة تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات الدولية). لمراحل الأجنة، تم حساب منتصف اليوم من القابس المهبلي المحدد على أنه يوم جنيني 0.5 (E0.5).
ملاحظة: يتم زراعة جميع الخلايا في حاضنة الخلية في ظل ظروف 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
1. إعداد ثقافة البطانة الماوس في إدراج دعم نفاذية
ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BEND3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. إعداد الماوس الابتدائية القشرية NSPCs الثقافة
3. إنشاء العصبية بطانة الثقافة المشتركة وAc4ManNAz نظام وضع العلامات
4. تلطيخ الفلورسنت المناعي من البروتينات السيالوجية في NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة
5. تنقية البروتينات Sialoglyco من NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة
الإجراء الكامل للتوسع في المختبر ووضع العلامات الأيضية من NSPCs الجنينية الأولية يستغرق 6 أيام(الشكل 1A). جودة خط الخلية BEND3 وNSPCs الأولية المعزولة حديثا هي المفتاح لتجربة ناجحة. خلايا BEND3 هي مصدر العوامل القابلة للذوبان التي تحفز التجديد الذاتي وانتشار الشركات غير القابلة للذوبان. وينبغي التأكد من أن الخلايا BEND3 خالية من أي تلوث وتقسيم بنشاط مع الحد الأدنى من موت الخلايا قبل المشاركة في زراعة الخلايا العصبية. ويجب أن تكون المراكز الوطنية للدعم في مجال النُسَّم الأولية مستعدة بعناية لتجنب الأضرار الزائدة أثناء التفكك. وقد لا تزال المراكز الوطنية للدعم في المناطق النضوية المتضررة تنمو وتفرق؛ ومع ذلك، فإنها ليست قادرة على الاستجابة للمحفزات البطانية جيدا للحفاظ على الجذعية والتوسع. وينبغي توخي الحذر الإضافي ليكون مطهرا أثناء زراعة الخلايا، لأن البروتوكول لا يقترح إضافة المضادات الحيوية إلى وسط الثقافة الأولية.
وستؤدي الثقافة المشتركة البطانية الناجحة إلى تشكيل الشركات الصغيرة والشعوب غير الناجحة في شكل مستنسخات كبيرة تشبه الورق. هذه الأشكال استنساخ مميزة تصبح واضحة في اليوم 4 ونموذجية جدا في اليوم 6. داخل الحيوانات المستنسخة، تحافظ الخلايا على اتصال وثيق مع بعضها البعض. مناعة مع الأجسام المضادة ضد علامة NSPC Nestin وعلامة الخلايا العصبية β-tubulin الثالث ينبغي أن تكشف عن أن في استنساخ, معظم الخلايا هي نيستين+ NSPCs وعدد قليل جدا هي β-tubulin الثالث+ الخلايا العصبية. وعلى النقيض من ذلك، فإن النسبة المئوية لخلايا Nestin+ وβ-tubulin III+ الخلايا العصبية في استنساخ شكلت في نظام الثقافة غير المشتركة هي نفسها تقريبا (الشكل 1B، 1D،و 1E).
المراسل الكيميائي، Ac4ManNAz، هو التناظرية الأيضية ويمكن دمجها في مسار sialylation البروتين المتأصلة. جرعات عالية من Ac4ManNAz سامة للخلايا. لكل نوع محدد من الخلايا، يجب أن يتم اختبار تركيز وضع العلامات Ac4ManNAz مسبقًا لتحقيق أعلى كفاءة في وضع العلامات دون سمية خلوية كبيرة. هنا، تركيز وضع العلامات الأمثل من Ac4ManNAz لNSPC الأولية هو 100 μM. التقييم الجمعي لوفيات الخلايا المشار إليها من قبل مورفولوجيا الخلوية والنووية يشير إلى أن هذا التركيز وضع العلامات لا يسبب آثار سامة للخلايا واضحة وغير قادرة على تسمية بكفاءة NSPCs(الشكل 1C و 1D). لا تتأثر المورفولوجيا الكلونية، والتجديد الذاتي، والتمايز من NSPCs في كل من البطانية المشتركة في الثقافة ونظام الثقافة غير المشتركة(الشكل 1C، 1D،و 1E).
يمكن فحص العلامات الناجحة للـ NSPCs من قبل Ac4ManNAz بعد اقتران البيوتين بثقافة توسطت فيها تفاعل حيوي بين الأزيد وألكيين. كل خلية في ثقافة Ac4ManNAz المسمى ملطخة وتصور مع اليكسا فلور 647-streptavidin. لا توجد خلية إيجابية لأليكسا فلور 647-streptavidin تلطيخ في مجموعة التحكم DMSO. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عينات البروتين التي أعدت من Ac4ManNAz المسمى الثقافة من قبل الاقتران البيوتين وتطهير الخرز streptavidin تظهر قوية كوماسي إشارة تلطيخ زرقاء رائعة في المواد الهلامية SDS-PAGE. وفي الوقت نفسه، لم يكن هناك سوى خلفية تلطيخ وإشارات ملزمة غير محددة في الممرات المحملة بعينات البروتين من مجموعة التحكم DMSO. وهذا يشير أيضا إلى كفاءة وضع العلامات على NSPCs من قبل Ac4ManNAz(الشكل 1F).
الشكل 1 تحديد علامات سطح الخلية للمركبات المضادة للخلايا والمياه الأولية بمساعدة نظام الثقافة المشتركة البطانية ووضع العلامات السيالوجية الأيضية. (أ) مخطط سير العمل للبروتوكول. وقد تم تعديل هذا الرقم من باي وآخرون. 10.يتم زرع الخلايا BEND3 في إدراج مصفوفة على D0. ويتم إعداد المراكز الصحية الوطنية القشرية الأولية واقامة نظام للثقافة المشتركة على D1. وضع العلامات الأيضية للثقافة يستمر من D2 إلى D6. يتم إعادة تغذية الثقافة على D3 و D5. (ب) الصور الفلورية المناعية للمستنسخين التي شكلتها المراكز الوطنية للاستنساخ الأولية بعد زراعة لمدة 5 أيام مع الخلايا البطانية أو بدونها. يشير شريط المقياس إلى 20 درجة (C) صور حقل مشرق للمستنسخين التي شكلتها NSPCs الأولية بعد ثقافة 5 أيام مع Ac4ManNAz أو DMSO. كانت النوى ملطخة من قبل DAPI. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. يشير شريط الخطأ SEM (n.s. = غير هام). (د) الصور الفلورسنت المناعية لـ NSPC شكلت استنساخات في الثقافة المشتركة البطانية مع Ac4ManNAz أو DMSO. دائرة متقطعة يرسم استنساخ عصبي واحد. يشير شريط المقياس إلى 50 ميكرومتر (E) القياس الكمي للمركبات العصبية الوطنية والخلايا العصبية المتمايزة في الحيوانات المستنسخة التي شكلتها NSPCs في البطانية المشتركة في الثقافة غير الثقافية ونظام الثقافة المشتركة مع Ac4ManNAz وضع العلامات أو التحكم DMSO. يشير شريط الخطأ إلى SEM (***p < 0.0005; n.s. = غير هام). (F) كوماسي تلطيخ الأزرق اللامع من البروتينات التي تنقيها حبات streptavidin من الخلايا العصبية المسمى مع Ac4ManNAz أو DMSO في البطانية المشتركة الثقافة ونظام غير التشارك في الثقافة. يمثل النطاق 55 كيلو D في مجموعات وضع العلامات على الرقابة بروتينات ملزمة غير محددة. (باء وجيم وهاء وواو) المقابلة لهذا البروتوكول قد تم تكييفها من باي وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتستخدم عادة علامات السطح لتسمية وتنقية أنواع محددة من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي17،18. اكتشاف علامات السطح يساهم إلى حد كبير في الطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية من خلال توفير الأدوات الجزيئية لإثراء انتقائي لسكان الخلايا الجذعية من الأنسجة العادية أو المرضية وأطباق الثقافة، وتقديم خلية نقية الموارد للاستخدام السريري أو دراسة الخصائص البيولوجية. ومع ذلك، كان التقدم في تطوير علامات السطح لبحوث الخلايا الجذعية العصبية بطيئا بسبب صعوبة في عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الأولية. ويستند البروتوكول الموصوف هنا على منصة مبسطة في المختبر. ومن خلال مقارنة المراكز الوطنية للدعم في مجال النقاط الاستراتيجية الأولية التي توسعت بثقافة مشتركة بطانية بثقافة عصبية مفاضلة، يتم تسليط الضوء على البروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في المراكز الوطنية الموسعة للدعم والسماح بمزيد من التحديد. كما يوفر بروتوكولنا استراتيجية بديلة لتنقية البروتينات السطحية للخلايا عن طريق اختطاف المسار الأيضي الجوهري لتسمية السيالوجيكان مع المجموعات البيولوجية. بالمقارنة مع البروتوكولات التقليدية لتنقية البروتينات السطحية الخلية، وترتكز مزايا هذا البروتوكول من قبل اثنين من السمات المحددة: 1) انتشار السيلية على البروتينات سطح الخلية يضمن التغطية القصوى للبروتيوم سطح الخلية، و 2) خصوصية رد الفعل بين المجموعة bioorthogonal وligands لها يمنح نقاء بروتيوم السطح المكتسبة. وهكذا، ينتج بروتوكولنا عن تحليل بروتيومميك أكثر حساسية في حالة المواد التي تبدأ أقل. وقد أثبتنا جدوى هذا البروتوكول في العلامات السطحية الأولية للمراكز الوطنية للدعم في مجال الحماية. مع التعديلات المناسبة على توسيع الخلايا الجذعية في المختبر، وهذا النهج الكيميائي يمكن أن تكون متوافقة مع تحديد علامات السطح من أنواع الخلايا الجذعية الأخرى. ومن الجدير بالذكر أنه كما Ac4ManNAz هو في O-acetylated يمكن أن يؤدي إلى S-glycosylation الاصطناعية. استخدام السكريات غير الطبيعية غير الأسيتيل يمكن تجنب تشكيل القطع الأثرية وتحسين خصوصية وصحة وضع العلامات الغليكان الأيضي في الخلايا الحية19.
إعداد الخلايا السلف العصبية القشرية الأولية والخلايا البطانية هي خطوات حاسمة من البروتوكول. أولا، عند هضم الأنسجة القشرية الجنينية، يجب التحكم بعناية في وقت الهضم، وكمية الإنزيم، وقوة المناولة. الهضم المفرط وقوى القص الميكانيكية سوف تضر سلامة غشاء البلازما ومستقبلات سطح الخلية التي تتوسط انتقال إشارة لبقاء الخلية والنمو، وأنها سوف تخل أيضا استجابة NSPCs لتحفيز الخلايا البطانية وقدرتها على التجديد الذاتي. لتحقيق الهضم السليم، يجب على التجارب تنشيط البابين بالكامل ووقف الهضم بمجرد اختفاء كتل الأنسجة. ثانيا، يجب الحفاظ على خلايا BEND3 في حالة صحية لدعم إفراز. من المستحسن استخدام دفعات الخلايا BEND3 مع عدد أقل من الممرات ومرور الخلايا قبل أن تصل إلى التقاء 100٪. وهذا من شأنه أن يمنع اعتقال دورة الخلية والحساسية الناجمة عن تلف الحمض النووي المتراكمة أثناء الغمر أو بسبب الاتصال المكتظ بين الخلايا.
ارتفاع الإنتاجية تسلسل التكنولوجيا يعزز تحديد علامات سطح الخلية من خلال تحليل التعبير RNA، وخاصة بالنسبة لأنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الأنسجة، والتي غالبا ما تكون موجودة في الجسم الحي بكميات صغيرة جدا لإجراء تحليل بروتيوم من قبل قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن تحليل RNA-seq يمكن تحديد الجينات التي تم التعبير عنها على وجه التحديد في NSPCs، فإنه قد لا يعكس حقا مستويات التعبير البروتين، لأن التعبير RNA لا يتسق دائما مع التعبير البروتين20. وبالإضافة إلى ذلك، الجزيئات الحيوية غير البروتينية التي يمكن أن تعمل كعلامات السطح غير قادرة على الكشف عن هاذين من قبل الدراسات النسخية. على سبيل المثال، oligosaccharide لويس X هو صانع سطح معروف يستخدم على نطاق واسع لتسمية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وNSPCs، على الرغم من أنه يمكن أن يرتبط مع بروتينات متعددة21. ولذلك، فإن تحليل قياس الطيف الكتلي المباشر ليس بعد قابلاً للاستبدال، كما أن تطوير الأساليب التي يمكن أن تجعل تحليل قياس الطيف الكتلي أكثر جدوى وملاءمة أمر ذو أهمية كبيرة بالنسبة للدراسات المقبلة.
بالإضافة إلى التسياليس، تلعب أنواع أخرى من تعديلات البروتين بعد الترجمة دورًا مهمًا في تنظيم وظائف البروتينات المعدلة. هذه التعديلات تؤثر على خصائص البروتين مثل المطابقة، نصف العمر، والتعريب تحت الخلية22،23. العديد من التعديلات البروتين ية خصوصية نوع الخلية24،25،26. مع المحتويات المتنامية من الأدوات الكيميائية، وأنواع التعديل أكثر قابلة لوضع العلامات الأيضية مع الصحفيين الكيميائية27. وبالتالي، يمكن استخدام النهج الكيميائي الموصوف هنا لدراسة الاختلافات الأخرى في تعديل البروتين بين الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة، مما يوضح الآليات الجزيئية وراء الحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية والتمايز تنظيم.
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
الشكل 1 باء و 1 جيم و 1 هاء و 1 واو مستنسخة من باي وآخرون . 10 سنوات بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. نشكر يي هاو في مختبر X.C. لتحرير الرقم. ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 91753206 إلى Q. S. وX.C., No. 31371093 to Q.S., and Nos. 21425204 and 21672013 to X. C.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
DMEM | Gibco | 11960044 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
HBSS | Gibco | 14175095 | |
Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Transwell | Corning | 3450 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Sucrose | Sangon | A100335 | |
DAPI | Gibco | 62248 | |
RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
SDS-PAGE loading buffer 2x | Solarbio | P1018 | |
6-well plate | Corning | 3335 | |
Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
Mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1,000 |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1,000 |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1,000 |
Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Brij97 | Aladdin | B129088 | |
CuSO4 | Sigma | 209198 | |
Alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
9AzSia | synthesized in lab | ||
Sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
EDTA | Sangon | A100322 | |
NaCl | Sangon | A100241 | |
SDS | Sangon | A100227 | |
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1,000 |
Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
Urea | Sigma | U5378 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved