This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li><li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+morphogenesis:+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo.">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis.">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li><li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502/ROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis.">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li><li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation:+LET-502/ROCK,+MRCK-1+and+PAK-1,+three+kinases+with+different+roles.">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li><li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase,+MEL-11+myosin+phosphatase,+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase.">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li><li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans.">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684 (2014).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods. , 587-606 (1988).</li><li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform,+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains.">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li><li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry.">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li><li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function.">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).</li><li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness.">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li><li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin/IGF-1+signal.">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular &amp; cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li><li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size.">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43 (2014).</li><li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li><li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar. 1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık hiçbiri hava geçirgen bulunmaktadır. bakteriler (ya da embriyo) büyük bir ped üzerinde mevcut olduğunda Sonuç olarak, kendi erken ölüme yol açan, bir kaç saat sonra, oksijen yoksun olabilir. üç kat embriyoların sahip - olmayan uzatılmış embriyoların karşılaştırıldığında uzunluğu 3 kat olan embriyolar tekabül - Potansiyel hipoksik koşullar iyi bir göstergesi olacaktır ilgi embriyoları ile birlikte kaydedilen bu embriyolar thei hareket durur berioksijen yokluğunda R yumurta kabukları. Hiçbir morfolojik ölçümler hipoksik koşullar ya da ölü embriyolar üzerinde yapılmalıdır. time-lapse görüntüleme kullanarak başka kritik bir adım embriyo gelişimi oluştuğu sıcaklıktır. Isı duyarlı mutantlar şu C&#39;de kullanılan elegans. Sıcaklık kayması biyolojik etkisi hızlı olabilir veya proteinin yarılanma ömrü ve onun taşıyan mutasyon doğasına bağlı olarak ertelenebilir. Dolayısıyla, embriyo maruz kaldığı sıcaklık zaman içerisinde sabit olmalı ve mikroskop sahnede mikroskopi oda ya da ısıtma-soğutma bölmesinin uygun bir havalandırma ile kontrol edilmelidir. Bölüm 2 alkali hipoklorit tedavisi ile larvalar senkronizasyonu bağlıdır. Belirli koşullar altında, bu tedavi embriyonik öldürücülüğü (Emb) yol açabilir. Ağırlık popülasyonda% 20&#39;nin üzerinde Emb hipoklorit tedavi sırasında yüksek bir toksisite göstermektedirolumsuz morfolojilerinden etkileyebilir ment. Ağırlık arka yüksek Emb görüntülendiği Senkronize L1 daha fazla analiz için kullanılmamalıdır. Bu kısıtlama, protokol 3 için de geçerlidir. Biz larva hareketsiz anestezik ilaçların kullanımını tavsiye etmiyoruz. Levamisol özellikle deneysel önyargı tanıtan larvaları küçültmek eğilimindedir kas tetani indüksiyonu yoluyla nematod hareketsiz. maruz kalma süresi mikroskop sınırlamaları nedeniyle yeterince hızlı değildir, biz pedde agaroz konsantrasyonu artar ve yastık ve kapak arasında sıvı miktarını azaltarak larva motilitesini azaltan önerilir. Bakım kurutma boyutlarını azaltır, çünkü larva kurutulması için değil, ancak alınmalıdır. 3. bölümde, larvaların uzunluğu ölçümleri analiz numuneleri arasındaki akış oranlarının karşılaştırılması kullanılır. Bunu yapmak için, kontrol parçacıklarının dağılımı iştigal olması gerekirkırmızı. Bu değerler normalize olması gerekmez eğer tam bindirme dağılımları ise, TOF (time-of-flight) örnekleri karşılık gelen elde edilen değerler, mukayese edilebilir. (3.4.5.1 ayrıntıları verildiği gibi) PAK-1 (ok448) (Şekil 3C ve Şekil 5B) için gösterildiği gibi, kontrol parçacıkları-TOF fazla numune TOF normalizasyonu başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Ağırlıkça vs Pak-1 (ok448) göreceli uzunluğu ve normalizasyonsuz en az 3 bağımsız deneyde benzer olduğu tespit edildi (veriler gösterilmemiştir). küçük boy farklılıkları ile larva karşılaştırarak özellikle Ancak, biz onsuz elde edilenlerle normalleşme elde edilen sonuçların teyit tavsiye ederiz. Akış sitometri kullanılarak larva uzunluğu ölçümleri, larva yerine görüntü analizi gibi mikrometre mutlak uzunluğu ağırlıkça, bu durumda, bir kontrol numunesine uzunluğu göreli sağladığı not edilmelidir. Bu, bağımsız deneyden gelen ölçümler olamaz imaağırlıkça üzerinde boyut oranını hesaplama sürece kombine edilebilir. Örnek kap içinde seyreltme için kullanılan tampon akış oranı üzerinde bir etkiye sahip olacaktır. Biz üretici tarafından önerilen kılıf tampon alımı sırasında oluşan kabarcıkların miktarını artırır deterjanı içerdiği görülmektedir. deterjan içermeyen, M9 tampon kullanarak, önemli ölçüde kabarcık oluşumunu azaltmakla birlikte, numune akış oranına etki sıralayıcı, tübülleri yumurta tıkanması kaçınmak daha az etkili oldu. Yumurta tıkanması kolayca birkaç saniye de yüksek bir TOF- ardından bir kaç saniye için kontrol parçacıkların gözlemlenebilir TOF belirgin bir azalma ile satın alma sırasında tespit edilir. Yumurta takmayı da kanalın tıkanması ve parçacık akışı (saniyede az olduğu 5 nesneler) tam tutuklama yol açabilir. Bu meydana gelirse debi geri gelene kadar, TEMİZ butonuna tıklayınız. Bu olay sırasında meydana gelen her türlü ölçümlersn veri analize dahil edilmelidir. Kılıf tampon ölü yumurtaların yüksek oranlarda ile karakterize suşları içeren deneyler için tavsiye edilebilir. (Aşama 3.2.3 ayarlanır) bir numune ve kılıf basıncı, zamanla (biraz) değişebilir ve çok sabit bir akış hızı sağlamak için deney boyunca elle ayarlanması gerekmektedir. Sonuçları analiz etme ve zaman (Şekil 3C) üzerinde kontrol parçacıkların TOFs komplo yaparken azaltılması veya düşük oranda artış gözlemlenebilir olacak. akış hızı artışı karşısında neden olurken akış hızının azaltılması, zaman içinde parçacıkların ortalama TOFs artmasına neden olur. akış hızının değiştirilmesi olumsuz larva popülasyonları arasındaki küçük boyut farklılıkları tespit yönteminin duyarlılığını etkileyecektir. uzama kontrol genleri tanımlamak için amaçlayan ve zaman atlamalı mikroskopi kayıt gerektiren yöntemleri genellikle yüksekBirkaç genotipleri fenotipleme zaman ly zaman alıcı ve sıkıcı. tüm laboratuvarlar için geçerli değildir ekipman gerektiren iken akış sitometresinde-temelli yaklaşım, daha az zaman alıcı ve birkaç suşları karakterize gerektiğinde dolayısıyla daha verimli. (Mutant ve ağırlık TOF dağılımları karşılaştıran öğrencinin t-testi ile değerlendirildi; Şekil 5A ve B) Bu yöntem görüntü analizi kullanılarak ölçümlere göre de daha istatistiksel sağlamdır. Bu yöntem, daha sonra düşük ekspressivite / penetre uzama kusurları ifade suşlar için oldukça uygun olabilir. Akış sitometri kullanılarak çeşitli yöntemler nematod 9-12 kondisyonunuzu ölçmek için geçmişte geliştirilmiştir. Bu yöntemler, 96 çukurlu bir levha ve sonsuz sıralayıcı &#39;Refleks modülünde tevzi hayvanların kullanımı. Refleks modülü 96 oyuklu plakalar içinde tevzi nematod nüfusun doğrudan analiz edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntemler, karakterize, mümkünbir senkronize olmayan nüfusun uygunluğu ölçmek için sağlam bir şekilde günde koşulları yüzlerce rize ve oluşturmaktadır. Onlar, ancak iyi senkronize L1 arasındaki küçük boyut farklılıkları tanımlamak için uygun değildir. L1 larvalarının arasındaki küçük farklar ölçümü 96 oyuklu plakalar ve verimli bir şekilde göz başına en fazla 100 nesne karakterize edilebilir Refleks modülünün kullanımı ile uyumlu olmayan bir hayvan çok sayıda boyunca ölçümünü gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, önemli ölçüde azalır throughput pahasına, bu amaç için tasarlanmıştır. Bu protokolde 2 görüntü analizi kullanılarak üzerinde belirgin bir iyileşme olduğunu alet kalibre saatte bir 3 ila 4 koşulların karakterizasyonu, sağlar. Baş ve kuyruk genişliği oranı ölçümü embriyo 7 anteroposterior ekseni boyunca dengesiz meydana morfojenik süreçleri karakterize etmek geliştirilen ilk yöntemdir. Ne zamanErken uzama kontrol etmek için gösterilen genlere uygulandığı, bu yöntemler bu aşamada morfolojilerinden kontrol sinyal yollarının mekansal dağılımını açıklığa kavuşacaktır. Görüntü analizi ya da erken uzama sonunda embriyo uzunluğunun ölçülmesi ile kombinasyon halinde akış sitometrisi kullanılarak tutuklandı larva uzunluğunun ölçümü yüksek hassasiyet ve kesinlik ile erken veya geç uzama veya her ikisi de kontrol eden genlerin tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu prosedürler sonra C. embriyonik uzama kontrol sinyal yollarının zamansal ve mekansal düzenlemenin gelecek anlaşılmasına önemli katkıda bulunabilir elegans. Ayrıca, bu yaklaşımlar aynı zamanda insülin ve TGF-beta gibi vücut uzunluğu kontrol sinyal yolları incelemek için adapte edilebilir çevresel kirleticiler 15, 16 13, 14 ve kronik maruziyet yolları. Bu ölçümler usin farklı larva aşamasında veya yetişkin yapılabilirL1 Protokoller 2 ve 3. Ölçme büyüklüğü farklılıkları g küçük varyasyonlar gibi L3, L4 larva veya yetişkin gibi büyük nesneleri daha solucan sıralayıcı ile daha zordur. Protokol 3 daha sonra kolayca bu ölçümleri yapmak için adapte edilebilir.

Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi 1 gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeniden nasıl bir grup olarak göç nasıl epitel daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve onların bireysel morfolojisi yanı sıra işlevsel epitel içinde göreceli konumunu değiştirmek kabiliyetini önemli ölçüde dikkat çekti.Epidermal morfogenezisi dört evreye ayrılır: dorsal epidermal hücrelerin yeniden organizasyonunda oluşan sırt interkalasyon, hipodermis olarak anılacaktır; böylece epitel hücre tek tabaka embriyo encasing ventral orta hat doğru ventral hipodermal hücrelerinin göç oluşan ventral muhafaza; erken ve geç uzama vermiform larva haline fasulye şeklinde embriyoyu dönüştürme. Aşağıdaki morfogenezi, embriyo kapak ve L1 larvaları kendi yakın çevrede mevcut bakterileri kullanarak beslemeye başlarlar. Embriyonik uzama nedenle embriyonik gelişim geç bir aşamasıdır. Bu uzunlamasına ekseni boyunca embriyo uzatılması ve enine çapa sahip bir azalma oluşur. Bu hipodermal hücre şeklinin dramatik bir değişiklik gerektirir. Uzama, erken ve geç faz ayrılmıştır. Vücut duvarı kasları w 1.75 kat aşamada sözleşme başladığınızda erken evre virgül aşamasında başlar ve biterILD tipi (WT) embriyo - olmayan uzatılmış embriyolar göre uzunluğu 1.75 kat olan embriyolar tekabül etmektedir. Bu aşamada ortaya çıkan morfojenik süreçler esas embriyo 2 anteroposterior ekseni boyunca onların uzama sürücü hipodermal hücrelerinin apikal kutbunda bulunan ipliksi aktin demetleri (FB&#39;ler) kasılmasıyla tarafından tahrik edilmektedir. FBs Daralma üç kinazlar LET-502 / ROCK, MRCK-1 ve PAK-1 5 ile miyozin-hafif zincirlerin fosforilasyon ile kontrol edilmesidir. vücut duvarı kasları işlevsel hale ve taahhüt başlattığınızda uzama geç faz başlar. Bu sırt ve karın hipodermal hücrelere vücut duvarı kasları gelen mechanotransduction sinyalizasyon içerir ve hayvanlar 3 yumurtadan biter. ve L1 larvaları (Larva tutuklama fenotip olarak bu durdurma onların gelişimi; uzama kusurları genellikle embriyolar olarak ölen hayvanların yüzdesi (Emb Embriyonik öldürücü); ile karakterize edilir Lva) ve ağırlık önemli ölçüde daha kısa olması. gelişimsel duraklama evresi tanımlanması ölü embriyo mikroskobik gözlem gerektirir ve Larva 3-6 tutukladı. Son zamanlarda, bu Cdc42 / rac regülatörü ve efektör pix-1 ve Pak-1 gibi birçok gen, erken ve geç uzama 3,7 sırasında hem morfojenik süreçlerini kontrol gösterilmiştir. Biz de son zamanlarda morfojenik süreçler erken uzama 3 7 sırasında embriyoların anteroposterior ekseni boyunca farklı olduğunu gösterdi. Bu bulgular, özellikle erken uzama sırasında ön-arka eksen boyunca embriyoların morfolojik karakterizasyonu sağlayan erken ya da geç uzama aşamalarını ve diğer ölçümleri hedefleyen yeni metrik gelişimini motive etti. Bu yeni yöntemler kendi genişliği yanı sıra başında ve erken uzama sonunda embriyoların uzunluğu ölçülerek ibaret oreklamlar ve kuyrukları. 7 İki protokolleri de L1 aşamada 7&#39;de senkronize yumurtadan yeni çıkmış larvaların uzunluğunu ölçmek için geliştirilmiştir. larva, yetişkin ve kültür ortamı mevcut bakteri tedavisi ile çözülür ise embriyoların yumurta kabukları alkali hipoklorit muameleye karşı korunmaları. Bu işlem daha sonra besili yetişkin 8 çoğunluğunu ihtiva eden bir senkronize olmayan nüfusu embriyolar saflaştırmak için kullanılır. Gıda kısıtlama yeni yumurtadan larva senkronize etmek için kullanılır. Bu larvaların uzunluğunun ölçülmesi sonra uzama kusurları tespit etmek için kullanılır. yumurtadan larva olmayan tam olarak uzatılmış embriyolar beslerken, &quot;normal uzunluğu&quot; olarak geri ancak gıda yokluğunda yakalandıklarında indirgenmiş büyüklüğünü korumak çünkü bu ölçüm kültür levhaları üzerinde tutuklandı larva ölçülmesi tercih edilmektedir. Burada, biz le ölçümünü sağlayan ayrıntılı protokolleri mevcutzaman atlamalı DIC mikroskopi ve görüntü analizi (Protokol 1) kullanılarak embriyolar ve bunların baş genişliği ve kuyruk uzatılması ngth. Biz de görüntü analizi (Protokol 2) ve Flow-Sitometri (Protokol 3) kullanılarak senkronize larva uzunluğunu ölçmek için ayrıntılı protokolleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium Chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution&amp;nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>High fluorescent control particles</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, monobasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (magnesium sulfate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;( sodium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>SDB0487</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Drawing Gum 45&amp;nbsp;ml</td><td>p&amp;eacute;b&amp;eacute;o</td><td>PDG033000</td><td>any art/craft store</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics to characterize embryonic elongation of the nematode caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Baş, bagaj ve Baş / Kuyruk genişliği Oranı Sağlam Metrik vardır. Burada anlatılan protokoller başarılı düzenleyiciler ve Rho GTPases pix-1 efektör işlevini, pak-1 karakterize ve let-502 erken uzama 7 sırasında kullanılmıştır. Bir guanin-değişim faktörü pix-1 ve sırasıyla pak-1 kod (GEF) ve RHO&#39;daki-1 7 için bir efektör için Rac / Cdc42 GTPases için özel ve let-502 kodlar bir efektör. Bu çalışmada, PIX-1 ve PAK-1 ilk uzama 7 esnasında epidermal morfojenezi kontrol gösterildi. metrik olarak bu çalışma kullanılan baş ve kuyruk genişliği ölçümü, ilk kez ön emb bulunan bu hipodermal hücrelerini göstermektedirryo kendi posterior 7 bulunan daha farklı morfojenik programlarını takip. Bu ölçümlerin tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı kurmak için, baş genişliği 1.2 kat aşamada bağımsız 12 yabani tip (wt) embriyolar üzerinde beş kez ölçüldü. Bir grup için ölçümlerin düşündüren; ölçüm beş farklı gruplar arasında varyansları karşılaştırıldı sonra ölçümlerin arasında anlamlı farklılık (Şekil 4A F testi p değeri&gt; 0.5) ortaya (R istatistik paketi kullanılarak) Brown-Forsythe testi kullanılarak değerlendirildi embriyoların tekrarlanabilir. Bu ölçümler ile bağlantılı tekrarlanabilirlik ve parti etkilerinin değerlendirilmesi üç farklı gün (n = 12 embriyo) üzerinde yapılan 4D-DIC görüntüleme 1.2 kat aşamada ağırlık embriyoların baş genişliğinin ölçümü yoluyla yapıldı. Bu üç ölçüm gruplar arasında, varyans önemli ölçüde farklı değildi ve anlamlı toplu etkisi baş w darbeye bulundulikli ölçüm sonuçları (F-testi p-değeri&gt; 0.5; Şekil 4B). Benzer sonuçlar kuyruk genişlik ölçümleri ve erken uzama farklı aşamalarında yapılan ölçümler için elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu veriler erken uzama kusurları karakterize etmek için sağlam metrik olarak baş-genişliği, kuyruk genişliği ve baş / kuyruk genişliği oranını kurdu. Baş ve Kuyruk Genişlik yanı sıra Embriyolar Uzunluğu Ölçme Embriyo ve Antero-posterior ekseni boyunca Erken Uzama Kontrol Genler Karakterizasyonu için izin verir. Embriyoların uzunluğu, hem de baş ve kuyruk genişliğinin ölçümü taşıyan wt ve mutant embriyo üzerinde yapıldı erken uzama kontrol eden gen fonksiyonu allel kaybı güçlü null veya ısıya: pix-1 (gk416);(ok448)-1 pak ve let-502 (sb118ts) 7. Bu kafa / kuyruk (H / T) başlangıçta wt ve mutant embriyoların genişlik oranı (1.2-kat aşamada) ölçüldü ve non-permisif sıcaklıklarda erken uzama sonunda (Şekil 4C sol ve sağ panel) mevcuttur. Erken uzama başında hiçbir tarafındaki değiştirme ya da daha düşük bir H varken / T oranı pak-1, PIX-1 gözlendi ve let-502 mutantlar wt hayvanlarda (1.2 kat aşamada, Şekil 2C, sol panele kıyasla Şekil 4C;; sağ panel)), erken uzama sonunda her üç mutant ağırlık embriyolar önemli ölçüde daha yüksek H / T oranı (t-testi p-değerleri &lt;0.006 gösterdi. Bu pix-1, pak-1 ve let-502 mutant embriyoların erken uzama sonunda anormal ön-arka morfolojisi görüntüler ortaya koymuştur. Daha fazla analiz kafa genişliği karşılaştırma ve kuyruk betwee genişliği1.2 kat sahne ve aynı ölçüm parametreleri kullanarak erken uzama sonu n kafa genişliği daha az, PIX-1 pak-1 azaltılmış ve let-502 mutantlar kuyruk genişliği let-502 mutantlar önemli ölçüde daha az azaltır olduğunu ortaya sadece 7. Pix-1 ve pak-1 kontrol morfojenik süreçler embriyo 7 ön kısmında ağırlıklı olarak meydana gelen ise bu, embriyonun anteroposterior ekseni boyunca benzer olduğunu let-502 kontrol morfojenik süreçleri ortaya çıkardı. Erken uzama (Şekil 4D) başlangıcında karşı ucunda embriyoları arasındaki uzunluk farkı da ölçülmüştür. Bu tek başına önemli ölçüde elongatio azaltmaya yetecek karşılaştırıldığında erken uzama anlamlı pix-1 ve PAK-1 mutant ön morfojenezinin değişikliğin öne ağırlıkça PAK-1, PIX-1 azaltılmış ve izin-502 mutantlan olarak bulunduembriyonun n. Protokol 2 ve 3 wt ve mutant arka tutuklandı larva uzunluğunu belirlemek için kullanıldı. (; Yayınlanmamış veri Protokolü 3), bu larvaların uzunluğu hem görüntü analizi (Protokol 2) 7 ve akış sitometri kullanılarak değerlendirildi. Sağlam ve yüksek tekrarlanabilir bir şekilde (Şekil 5A) içinde mikrometre içinde hayvanların uzunluğunun mutlak ölçümlerde görüntü analiz sonuçlarını kullanarak larva uzunluğunun ölçülmesi. Bu analiz, ağırlıkça (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında senkronize mutant larva görüntüleme önemli ölçüde uzunluğu azalttığını ortaya 7. Akış sitometri tabanlı bir protokol (Protokol 3) ile, bu larvaların ölçümü benzer sonuçlar (Şekil 5B) vermiştir. Bununla birlikte, ikinci bir yaklaşım kullanılarak ölçülmüştür larva sayıda önemli ölçüde genotip karşılaştırması (t istatistiksel sağlamlığını artış olduğuna dikkat edilmelidir -<html> Test p-değerleri &lt;10 -24). Bu bulgulara dayanarak, akım sitometri yaklaşım çok ince uzama kusurları göstererek mutant hayvanlar karakterize etmek amacıyla görüntü analizi üzerinde daha iyi bir seçim olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig1.jpg" /> Agaroz Pad 1. Hazırlık Şekil. Bant. B maskeleme iki kat kapsadığı iki boşluk-slaytlar arasına yerleştirilen A, Mikroskop slayt, agaroz ped iki boşluk-slaytlar tarafından desteklenen başka bir slayt ile kaplıdır. C, ile kestikten sonra son şeklini ve agaroz pad boyutu bir jilet lamel sığdırmak için. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> g2.jpg &quot;/&gt; . Şekil 2. Erken ve Geç Uzama Defektlerde Ölçüm A - B, virgül aşaması (A) bir embriyo uzunluğu ve erken uzama (B) sonunda ölçülmesi. Embriyoların ölçmek için kullanılan kırmızı çizgi, (solda) 1.2 kat aşamada ve erken uzama (sağda) sonunda embriyolar ölçülür ImageJ. C, Baş ve kuyruk genişliği segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Oklar ölçülen alanların lokalizasyonu temsil (Martin ve ark modifiye., 2014). Ölçü bar:. 20 um D, larva uzunluğu senkronize L1-larvaları için ölçülür. Sağ panel yakalanan görüntü (sol) büyütülmüş bir görünüşüdür. kırmızı çizgi ImageJ segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Larva uzunluğunu ölçmek için kullanılır. Ölçek çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Akış sitometri. A, Ayırıcı ve Green ve kontrol parçacıkların Kırmızı emisyonu gösteren COPAS Biosort sıralama penceresini kullanarak Senkronize Larva uzunluğu Şekil 3. Ölçme, (ölü ve Time-Of-Flight göre yaşayan hayvanlar, TOF kabarcıklar ). B, Örnek deney için farklı zaman noktalarında kontrol parçacıklarının TOF. Zamana karşı TOF doğrusal fonksiyonu eğim kontrolü parçacıklarının TOF deney boyunca zaman içinde sabit olduğunu gösteren, yaklaşık 10 -5 olan.: C, dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilen, kontrol partikül TOFs dağılımı. Sigara normalize ve normalize kontrol parçacık dağılımları için temsil edilir pak-1 (ok448). Diğer dağıtımlar normalize değildir. D yaşam için TOFs dağıtımıHayvanlar dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilmiştir. TOFs belirtildiği gibi pak-1 (ok448) hariç, kontrol parçacıkları üzerinde normalize değildir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53712/53712fig4.jpg" /> Şekil 4. Pix-1, Pak-1 ve Let-502 Mutantlar Günümüze Erken Uzama Kusur. A - B, baş Tekrarlanabilirlik ve sağlamlığı değerlendirme ölçümleri genişliği A, 1.2 kat aşamada (n = 12 embriyolar) de ağırlık embriyolar için kafa genişliği beş bağımsız ölçümleri.. Ortalamalar ve standart sapmalar (hata çubukları) gösterilir. ölçümler arasında anlamlı olmayan (ns) farklar Brown-Forsythe testi kullanılarak hesaplandı (biziing R istatistik paketi) (F-testi p değeri&gt; 0.5). B, üç farklı günde (n = 12 embriyolar wt embriyolar Baş genişliği ölçümü). Ortalamalar ve standart sapmalar da belirtilmiştir; Ölçümler arasında Varyans anlamlı bir fark yoktu (ns; Brown-Forsythe F-testi p değeri&gt; 0.5) C, kafa / kuyruk genişlik oranı dağılımı erken sonunda 1.2 kat aşamada (sol panel), en. ağırlıkça uzama (sağ panel), pIX-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve 23 ° C&#39;de izin-502 (sb118ts) mutantlar - 24 ° C. Arasındaki bu çalışma için kullanılan let-502ts embriyoların anne 25.5 ° C. D, ağırlık olarak uzama, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) Dağıtım büyütüldü unutmayın ve let-502 (sb118ts) mutantlar virgül sahne ve geç uzama başlangıç. Kutu araziler min, max, 25 inci, 50 inci (ortanca) ve 75 temsilnüfusun inci yüzdelik. * T-testi p-değeri &lt;0.05, ** t-testi p-değeri &lt;0.006 (Martin ve ark modifiye., 2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53712/53712fig5.jpg" /> Şekil 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve L et-502 (sb118ts) Larva Mevcut Uzunluk Kusurları. Ağırlıkça ölçülen larvaların A, Uzunluk, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) ve let-502 (sb118ts) hayvanlar görüntü analizi (Protokol 2). B, akış Sitometreyi kullanılarak ölçülen Bağıl larva uzunluğu (kullanılarak ölçülen protokol 3). Parantez içindeki sayılar th için kullanılan hayvanların sayısına tekabüle ölçümleri. uzunlukları ve ortalama standart hata araçları (SEM; hata çubukları) temsil edilir. P değerleri -test Student t. (P) gösterilir <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

6.0K Görüntüleme.  Université du Québec à Montréal. Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo. 

Video: Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Nörobilim

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Genetik

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Gelişim Biyolojisi

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biyoloji

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Lifespan Analysis: Measuring C. elegans Longevity

Source: Cornwell, A. B., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57819/the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively">The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure&#160;Caenorhabditis elegans&#160;Lifespan</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2018).
This video describes a traditional, plate-based method of measuring the lifespan of C. elegans. The example protocol measures the lifespan of worms treated with RNAi.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler