This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario. En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de los selladores utilizados para montar almohadillas de agarosa entre portaobjetos y cubreobjetos son permeable al aire. En consecuencia, cuando está presente en la plataforma de una gran cantidad de bacterias (o embriones), pueden ser privados de oxígeno después de unas pocas horas que conducen a su muerte prematura. Tener embriones de tres veces - que corresponde a los embriones que son de 3 veces en longitud en comparación con los embriones no alargadas - grabadas junto con los embriones de interés será un buen indicador de posibles condiciones de hipoxia, ya que esos embriones dejarán de moverse en theicáscaras de huevo R en ausencia de oxígeno. No hay mediciones morfológicas deben realizarse en condiciones de hipoxia o en embriones muertos. Otro paso importante cuando se utiliza la imagen de lapso de tiempo es la temperatura a la cual ocurre el desarrollo del embrión. Mutantes termosensibles se utilizan actualmente en C. elegans. El efecto biológico de cambio de temperatura puede ser inmediata o retardada en función de la vida media de la proteína y la naturaleza de la mutación su acarreos. En consecuencia, la temperatura a la que se expone el embrión debe ser constante en el tiempo y debe ser controlada por ventilación apropiada de la sala de microscopía o una cámara de calentamiento-enfriamiento en la platina del microscopio. Sección 2 es dependiente de la sincronización de las larvas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino. Bajo ciertas circunstancias, este tratamiento puede dar lugar a la letalidad embrionaria (Emb). Emb por encima del 20% de la población en peso sugiere una toxicidad elevada durante el tratamiento de hipocloritoción que pueda afectar negativamente a la morfogénesis. L1 sincronizada presentan alta Emb en el fondo en peso no debe ser utilizado para un análisis adicional. Esta restricción también se aplica al protocolo 3. No se recomienda el uso de fármacos anestésicos para inmovilizar las larvas. Levamisol, en particular, inmoviliza el nematodo través de la inducción de la tetania muscular que tiende a reducir las larvas introducir un sesgo experimental. Si el tiempo de exposición no es lo suficientemente rápido como resultado de las limitaciones del microscopio, recomendamos reducir la motilidad de las larvas mediante el aumento de la concentración de la agarosa en la almohadilla y la reducción de la cantidad de líquido entre la almohadilla y el cubreobjetos. Se debe tener cuidado, sin embargo, no para desecar las larvas, ya que la desecación reducirá su tamaño. En la sección 3, la medición de la longitud de las larvas utiliza la comparación de las tasas de flujo entre las muestras analizadas. Para ello, la distribución de las partículas de control tiene que ser comparojo. Si las distribuciones totalmente de superposición, el TOF (tiempo de vuelo) valores obtenidos para muestras correspondientes se puede comparar, si no, estos valores deben ser normalizado. La normalización de la muestra-TOF sobre partículas-TOF de control (como se detalla en 3.4.5.1) se ha utilizado con éxito como se muestra para pak-1 (ok448) (Figura 3C y Figura 5B). Se encontró longitud relativa de pak-1 (ok448) vs peso que sea similar en al menos 3 experimentos independientes con o sin normalización (datos no mostrados). Sin embargo, recomendamos, lo que confirma los resultados obtenidos con la normalización con los obtenidos sin él, especialmente cuando se comparan con las larvas pequeñas diferencias de tamaño. Cabe señalar que la medición de la longitud de las larvas mediante citometría de flujo proporciona una longitud en relación con una muestra de control, en este caso, en peso de las larvas en lugar de una longitud absoluta en micrómetros como para análisis de imágenes. Esto implica que las mediciones de experimentos independientes no puedencombinar menos de cálculo de relación tamaño en peso. El tampón utilizado para la dilución en la copa de muestra tendrá un impacto en la tasa de flujo. Hemos observado que la memoria intermedia de vaina recomendado por el fabricante contiene detergente que aumenta la cantidad de burbujas generadas durante la adquisición. Usando tampón M9, que no contiene detergente, redujo significativamente la formación de burbujas, pero era menos eficaz en evitar el taponamiento de los huevos en los túbulos de la clasificadora, que afecta a la velocidad de flujo de muestras. taponamiento del huevo se detecta fácilmente durante la adquisición por una marcada disminución de la TOF observable de las partículas de control por unos pocos segundos seguido de un TOF- elevada también por un par de segundos. taponamiento del huevo también puede conducir a la obstrucción del canal y la detención completa del flujo de partículas (menos de 5 objetos por segundo). Si esto ocurre, haga clic en el botón limpia hasta que se restablezca la velocidad de flujo. Cualquier medida que se producen durante estos eventoss deben ser excluidos de los análisis de datos. tampón funda puede ser recomendado para los experimentos con cepas caracterizadas por altas tasas de huevos muertos. La muestra y la vaina de presión (fijado en la etapa 3.2.3), puede cambiar (ligeramente) en el tiempo y debe ser ajustado manualmente durante todo el experimento con el fin de garantizar una velocidad de flujo muy constante. La reducción o aumento de la tasa de baja serán observables en el análisis de los resultados y el trazado de los TOF de partículas de control con el tiempo (Figura 3C). La reducción de la velocidad de flujo dará lugar a un aumento de los TOF promedio de partículas en el tiempo, mientras que un aumento de la velocidad de flujo dará lugar a la opuesta. La alteración de la velocidad de flujo tendrá un impacto negativo de la sensibilidad del método en la detección de pequeñas diferencias de tamaño entre las poblaciones de larvas. Los métodos destinados a identificar los genes que controlan la elongación y que requieren la grabación microscopía de lapso de tiempo son generalmente altosLy consume tiempo y tedioso cuando fenotipificación varios genotipos. El enfoque basado en citómetro de flujo, mientras que requiere un equipo no está disponible para todos los laboratorios, es menos tiempo y por lo tanto más eficiente cuando varias cepas necesitan ser caracterizado. Este método también es más estadísticamente robusto en comparación con las mediciones utilizando análisis de imagen (evaluado mediante la prueba t de Student comparando las distribuciones de mutantes y WT TOF; Figura 5A y B). Este método puede ser entonces muy adecuado para las cepas que expresan defectos de elongación con baja expresividad / penetrancia. Varios métodos utilizando citometría de flujo se han desarrollado en el pasado para medir la aptitud de los nematodos 9-12. Estos métodos utilizan animales dispensados ​​en un placas de 96 pocillos y el módulo Reflex del gusano clasificador &#39;. El módulo Reflex permite el análisis directo de la población de nematodos dispensada dentro de placas de 96 pocillos. Por consiguiente, estos métodos son capaces de CharacteRize cientos de condiciones por día y constituyen una forma robusta en la cual medir la aptitud de una población no sincronizada. Ellos son, sin embargo, no es apropiado para identificar pequeñas diferencias de tamaño entre L1 sincronizada. La medición de pequeñas diferencias entre las larvas L1 requiere la medición a través de un gran número de animales, que es incompatible con el uso de placas de 96 pocillos y del módulo Reflex que pueden caracterizar de manera eficiente 100 objetos en el más por pocillo. El método aquí descrito está diseñado para este fin, a expensas del rendimiento, que se reduce significativamente. Se permite la caracterización de 3 a 4 condiciones por hora una vez que el instrumento se calibra, que es una mejora marcada sobre el uso de análisis de imagen en el protocolo 2. La medición de la relación cabeza y la cola ancho es el primer método que fue desarrollado para caracterizar los procesos morfogenéticos que se producen de forma desigual a lo largo del eje antero-posterior del embrión 7. Cuandoaplicado a los genes que se muestran para el control de la elongación a tiempo, estos métodos serán aclarar la distribución espacial de vías de control de la morfogénesis en esa etapa de señalización. La medición de la longitud de las larvas detenido utilizando análisis de imagen o citometría de flujo en combinación con la medición de la longitud de los embriones en el extremo de la elongación temprano permitirá la identificación de genes que controlan o bien alargamiento temprana o tardía o ambos con alta sensibilidad y precisión. Estos procedimientos pueden entonces contribuir significativamente a la comprensión futura de la regulación espacial y temporal de las vías de control de la elongación embrionaria en C. señalización elegans. Además, estos métodos también se pueden adaptar para estudiar las vías de señalización que controlan la longitud del cuerpo, tales como la insulina y el TGF-beta vías 13, 14 y crónica de la exposición a los contaminantes ambientales 15, 16. Estas mediciones se pueden realizar en diferentes etapas larvales o en adultos using variaciones menores de los Protocolos 2 y 3. Medir las diferencias de tamaño en L1 es más difícil con el clasificador de tornillo sin fin de objetos más grandes, como L3, L4 larvas o adultos. Protocolo 3 puede ser fácilmente adaptado para hacer estas mediciones.

Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de larvas (L1 a L4), seguido de la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la morfogénesis epidérmica atrajo una considerable atención por su capacidad para permitir una mejor comprensión de cómo epitelial células migran como un grupo, cómo se reorganizan sus uniones y modificar su morfología individual, así como su posición relativa dentro de un epitelio funcional.morfogénesis epidérmico se divide en cuatro etapas: intercalación dorsal que consiste en la reorganización de las células epidérmicas dorsal, referido como la hipodermis; recinto ventral, que consiste en la migración de las células hypodermal ventral hacia la línea media ventral que encierra por lo tanto el embrión en una monocapa de células epiteliales; temprana y tardía de elongación transformar el embrión en forma de frijol en larvas vermiformes. Después de la morfogénesis, la portilla de embriones y larvas L1 comienzan a alimentarse utilizando bacterias disponibles en su entorno inmediato. por lo tanto la elongación embrionarias es una fase tardía del desarrollo embrionario. Se compone de la extensión del embrión a lo largo de su eje longitudinal y una reducción de su diámetro transversal. Esto implica una modificación dramática de la forma de las células hipodermis. Alargamiento se divide en una temprana y una fase tardía. La primera fase comienza en la fase de coma y termina cuando los músculos del cuerpo de paredes comienzan a contraer en la etapa de 1.75 veces en wde tipo ILD (en peso) de embriones - correspondiente a los embriones que son 1,75 veces mayor en longitud en comparación con los embriones no alargada. Procesos morfogenéticos que se producen en esta fase son impulsados ​​principalmente por la contracción de los haces de actina filamentosa (FB) situados en el polo apical de las células hipodérmicas que impulsan su alargamiento a lo largo del eje antero-posterior del embrión 2. La contracción de los FB es el control por la fosforilación de las cadenas de miosina luz por tres quinasas LET-502 / rock, MrCk-1 y PAK-1 5. La fase tardía de la elongación, comienza cuando los músculos del cuerpo se vuelven funcionales de pared y empiezan contratación. Se trata de la señalización mechanotransduction de los músculos del cuerpo de pared a las células dorsales y ventrales hipodermis y termina cuando los animales salen del cascarón 3. defectos de elongación se caracterizan generalmente por el porcentaje de animales que mueren como embriones (embriones de letalidad; Emb) y los deteniendo su desarrollo como larvas L1 (fenotipo detención larval; Lva) y ser significativamente más corto que en peso. Identificación de la etapa de detención del desarrollo requiere la observación microscópica de embriones muertos y detenido larvas 3-6. Recientemente se demostró que varios genes, como el regulador de Cdc42 / Rac y el efector pix-1 y pak-1, el control de los procesos morfogenéticos durante la temprana y tardía de elongación 3,7. También demostraron recientemente que los procesos morfogenéticos difieren a lo largo del eje antero-posterior de los embriones durante la elongación temprana 3 7. Estos hallazgos motivaron el desarrollo de nuevas métricas específicamente dirigidas a las etapas tempranas o tardías de elongación y otras métricas que permiten la caracterización de la morfología de los embriones a lo largo de su eje antero-posterior durante la elongación temprano. Estos nuevos métodos consisten en la medición de la longitud de los embriones al principio y al final de elongación temprano, así como la anchura de su élanuncios y colas. 7 Dos protocolos también se han desarrollado para medir la longitud de las larvas recién eclosionadas, sincronizada en fase L1 7. Las cáscaras de huevo de los embriones a proteger contra el tratamiento con hipoclorito alcalino, mientras que las larvas, adultos y bacterias presentes en el medio de cultivo se disuelven por el tratamiento. Este tratamiento se utiliza a continuación para purificar embriones a partir de una población no sincronizada que contiene una mayoría de los bien alimentados adultos 8. la restricción de alimentos se utiliza para sincronizar las larvas recién eclosionadas. La medición de la longitud de estas larvas se usa entonces para detectar defectos de elongación. Esta medición se prefiere sobre la medición de las larvas detenido en placas de cultivo porque las larvas que eclosionan de que no esté totalmente embriones alargados puede recuperar a &quot;longitud normal&quot; cuando la alimentación pero mantendrá su tamaño reducido cuando detenido en la ausencia de alimento. A continuación, presentamos los protocolos que permitan a la medición de la length de alargarse embriones, así como la anchura de la cabeza y la cola utilizando lapso de tiempo DIC microscopía y análisis de imagen (Protocolo 1). También proporcionamos protocolos detallados para medir la longitud de las larvas sincronizado usando análisis de imágenes (Protocolo 2) y citometría de flujo (Protocolo 3).

<table><tbody><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium Chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution&amp;nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>High fluorescent control particles</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, monobasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (magnesium sulfate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;( sodium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>SDB0487</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Drawing Gum 45&amp;nbsp;ml</td><td>p&amp;eacute;b&amp;eacute;o</td><td>PDG033000</td><td>any art/craft store</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics to characterize embryonic elongation of the nematode caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Partida, con maletero y Jefe / Relación de la cola de ancho son métricas robustas. Los protocolos descritos aquí se han utilizado con éxito para caracterizar la función de los reguladores y efectores de Rho GTPasas pix-1, pak-1 y dejar-502 durante la elongación temprano 7. Pix-1 y pak-1 código, respectivamente, para un factor de intercambio de guanina (GEF) y un efector específico para Rac / Cdc42 GTPasas y LET-502 códigos de un efector de RHO-1 7. En este estudio, se demostró que pix-1 y pak-1 para controlar la morfogénesis epidérmica durante la elongación temprano 7. Este estudio utilizó la cabeza y la anchura de la cola de medida métricas como demuestran, por primera vez, que las células situadas en la hipodermis emb anteriorRyo seguir diferentes programas morfogenéticas que aquellas ubicadas en su posterior 7. Para establecer la reproducibilidad y robustez de estas métricas, ancho de la cabeza se midió independientemente cinco veces en 12 embriones de tipo salvaje (wt) en la etapa de 1,2 veces. Las variaciones entre los cinco grupos diferentes de medición se compararon luego evaluaron mediante la prueba de Brown-Forsythe (utilizando el paquete estadístico R) revela diferencias significativas entre las mediciones (F- valor p de prueba&gt; 0,5; Figura 4A) lo que sugiere que las mediciones de un grupo de embriones son reproducible. Evaluación de la reproducibilidad y de lote efectos asociados con estas mediciones se realiza a través de la medición de la anchura de la cabeza de embriones en peso en la fase de 1,2 veces a partir de imágenes 4D-DIC hecho en tres días diferentes (n = 12 embriones). A través de estos tres grupos de medida, la diferencia no fue significativamente diferente y no se encontraron efectos significativos de lotes para impactar la cabeza-wIDþ resultados de medición (prueba F de valor P&gt; 0,5; Figura 4B). Se obtuvieron resultados similares para las mediciones de la anchura de la cola y para mediciones realizadas en diferentes etapas de alargamiento temprano (datos no mostrados). Estos datos establecen la cabeza de ancho, la cola y la cabeza de ancho / anchura de la cola como métricas robustas para caracterizar los defectos de elongación tempranas. La medición de la cabeza y la cola Ancho así como la longitud de los embriones Permite la caracterización de genes que controlan Elongación temprano a lo largo del eje anteroposterior del embrión. La medición de la longitud de los embriones, así como la anchura de su cabeza y la cola se realizó en embriones de WT y mutantes que llevan nulo o termosensible fuerte pérdida de alelos de función para los genes que controlan la elongación temprano: pix-1 (gk416);pak-1 (ok448) y dejar-502 (7) sb118ts. Se midió la cabeza / cola (H / T) la relación de anchura de embriones WT y mutantes al principio (etapa 1.2 veces) y al final de la elongación temprano a temperaturas no permisivas (Figura 4C fuimos y panel de la derecha respectivamente). Mientras que al comienzo del alargamiento temprano no había cambio- o un H reducida / se observó relación T en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes en comparación con los animales WT (etapa 1.2 veces, la Figura 2C, el panel izquierdo ), al final de elongación a principios de los tres mutantes mostraron una proporción significativamente más alta H / T de embriones en peso de (t-test p-valores &lt;0,006; Figura 4C; panel derecho). Esto demostró que pix-1, pak-1 y let-502 embriones mutantes mostrar morfología anormal antero-posterior al final de elongación temprano. Un análisis más detallado comparando ancho de la cabeza y la cola anchura entrn etapa 1.2 veces y el final de la elongación temprano, usando los mismos parámetros de medición revelaron que el ancho de la cabeza es menos reduce en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes mientras que la anchura de la cola reduce significativamente menor en los mutantes LET-502 sólo el 7. Esto reveló que let-502 controla los procesos morfogenéticos de manera similar a lo largo del eje antero-posterior del embrión, mientras que los procesos morfogenéticos pix-1 y pak-1 de control se presenta principalmente en la parte anterior del embrión 7. También se midió la diferencia de longitud entre los embriones en el extremo con respecto al comienzo de la elongación temprano (Figura 4D). Se encontró que el alargamiento temprano se redujo significativamente en pix-1, pak-1 y dejar-502 mutantes en comparación con peso lo que sugiere que la alteración de la morfogénesis anterior en PIX-1 y PAK-1 mutantes por sí sola es suficiente para reducir significativamente la elongation del embrión. Protocolo 2 y 3 se utilizaron para evaluar la longitud de las larvas detenido en fondos WT y mutantes. La longitud de estas larvas se evaluó utilizando tanto análisis de imágenes (Protocolo 2) 7 y citometría de flujo (Protocolo 3; datos no publicados). Las mediciones de la longitud larvas utilizando los resultados del análisis de la imagen en las mediciones absolutas de la longitud de los animales en micrómetros en una robusta y altamente reproducible de forma (Figura 5A). Este análisis reveló que sincronizado pantalla larvas mutante redujo significativamente la longitud en comparación con wt (Figura 5A) 7. La medición de estas larvas utilizando el protocolo basado en citometría de flujo (Protocolo 3) dio resultados comparables (Figura 5B). Sin embargo, hay que señalar que el gran número de larvas medido usando el último enfoque aumentó significativamente la solidez estadística de la comparación genotipo (t -<html> -valores de prueba p &lt;10 -24). Sobre la base de estos resultados, el enfoque de la citometría de flujo puede ser una mejor opción sobre el análisis de imágenes con el fin de caracterizar los animales mutantes que exhiben defectos de elongación muy sutiles. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig1.jpg" /> Figura 1. Preparación de una almohadilla de agarosa. A, Portaobjetos de microscopio colocado entre dos espaciadores toboganes cubiertos por dos capas de cinta adhesiva. B, la almohadilla de agarosa se ​​cubre con otra diapositiva con el apoyo de los dos espaciadores-diapositivas. C, La forma final y las dimensiones de la almohadilla de agarosa después de cortar con una hoja de afeitar para adaptarse a la cubreobjetos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> g2.jpg &quot;/&gt; . Figura 2. Medición de la temprana y defectos de elongación tardíos A - B, medición de la longitud de un embrión en la fase de coma (A) y al final de la elongación temprana (B). La línea roja, que se utiliza para medir los embriones se dibuja con la herramienta de línea segmentada de ImageJ. C, la cabeza y la anchura de la cola se miden en embriones a 1,2 veces la etapa (a la izquierda) y al final de la elongación temprano (a la derecha). Las flechas representan la localización de áreas medidas (modificado de Martin et al., 2014). Barra de escala:. 20 micras D, longitud de las larvas se mide para L1-larvas sincronizada. Panel derecho es una vista ampliada de la imagen capturada (izquierda). La línea roja se dibuja con la herramienta de línea segmentada de ImageJ. Se utiliza para medir la longitud de la larva. Barra de escala:. 100 micras <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Medición de la longitud de Sincronizada larvas El uso de citometría de flujo. A, apertura de puerta y ventana de la clasificación de COPAS Biosort mostrando Verde y Roja de emisión de partículas de control, burbujas, muertos y los animales que vivían con respecto a su tiempo de vuelo (TOF ). B, TOF de partículas de control en diferentes puntos de tiempo para un experimento representativo. La pendiente de la función lineal de TOF en función del tiempo es de alrededor de 10 -5, lo que indica que TOF de partículas de control es constante en el tiempo durante todo el experimento. C, Distribución de partículas TOF de control expresados ​​como porcentaje del valor máximo de las distribuciones. Distribuciones de partículas de control no normalizados y normalizados están representados por pak-1 (ok448). Otras distribuciones no están normalizados. D, distribución de TOF para la vidaanimales expresan como un porcentaje del valor máximo de las distribuciones. TOF no están normalizados en las partículas del control excepto pak-1 (ok448) como se indica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig4.jpg" /> Figura 4. Pix-1, Pak-1 y LET-502 Mutants presentara alguna anomalía temprana de elongación. A - B, la reproducibilidad y robustez de evaluación de la cabeza de la anchura mediciones A, cinco mediciones independientes de la anchura de la cabeza para los embriones en peso a 1,2 veces la etapa (n = 12 embriones).. Los medios y las desviaciones estándar (barras de error) se indican. No significativas (ns) diferencias entre las mediciones se calcularon utilizando la prueba de Brown-Forsythe nosotros (ING paquete estadístico R) (F-test, p-valor&gt; 0,5). B, Cabeza medida de ancho para los embriones en peso en tres días diferentes (n = 12 embriones). Los medios y las desviaciones estándar se indican también; no hubo diferencia significativa en la varianza entre las medidas (ns; Brown-Forsythe prueba F valor de p&gt; 0,5) C, Distribuciones de anchura cabeza / cola en la etapa de 1,2 veces (panel izquierdo), al final de la primera. elongación (panel derecho) en peso, LET-502 mutantes (sb118ts) a 23 pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y - 24 ° C. Tenga en cuenta que las madres de embriones let-502ts utilizados para este estudio fueron cultivadas a 25,5 ° C. D, Distribución de la elongación en peso, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y dejar-502 (sb118ts) mutantes entre etapa coma y el inicio de la elongación tarde. Los caja de parcelas representan los valores mínimo, máximo, 25º, 50º (la mediana) y 75º percentiles de la población. * T-test p-valor &lt;0,05, ** p-valor de la prueba t &lt;0,006 (modificado de Martin et al., 2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig5.jpg" /> Figura 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) y L et-502 (sb118ts) Larvas defectos presentes longitud. A, Longitud de larvas medido en peso, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) y dejar-502 (sb118ts) animales midió usando análisis de imágenes (Protocolo 2). B, la longitud de las larvas relativa se mide utilizando citómetro de flujo ( Protocolo 3). Los números entre paréntesis corresponden al número de animales utilizados para THmediciones e. Medios de longitudes y error estándar de la media (SEM; las barras de error) se representan. T de Student-test valores p se indican (p). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

6.0K vistas.  Université du Québec à Montréal. Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo. 

Video: Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Investigación

Neurociencias

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Genética

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Biología del Desarrollo

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

Microscopía 4D: Desentrañando el desarrollo embrionario de Caenorhabditis elegans usando Microscopía Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biología

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Lifespan Analysis: Measuring C. elegans Longevity

Source: Cornwell, A. B., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57819/the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively">The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure&#160;Caenorhabditis elegans&#160;Lifespan</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2018).
This video describes a traditional, plate-based method of measuring the lifespan of C. elegans. The example protocol measures the lifespan of worms treated with RNAi.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo

Resumen

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