Yazarlar, Rioja Salud Vakfı (Fondos FEDER) ve İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00) desteğine teşekkür etmek istiyor. Cristina Romero Aranda, AECC'den (Asociación Española Contra el Cáncer) bir burs ile finanse edilmektedir.

1. Petri tabaklarında C. elegans yetiştirin
<ol><li>NGM plakaları hazırlayın ve besin kaynağı olarak E. coli OP50 ile tohumlayın (Şekil 1). C. elegans'ı tarif edildiği gibi büyütün ve koruyun17. Tohumlanmış plakaları 4 ° C'de bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>Solucanları eklemeden önce plakaları istenen sıcaklığa ayarlayın.<ol>
<li>Solucanları aktarmak için, eski bir plakadan bir parça agar çıkarın ve taze bir tabağa yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, steril bir solucan toplayıcı (bir Pasteur pipetinin ucuna monte edilmiş, düzleştirilmiş bir ucu olan 1 inçlik 32 gauge platin tel parçası) ile tek hayvanları yakalayın ve yeni plakaya yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanları istenen sıcaklıkta büyütün.<ol>
<li>C. elegans solucanlarını standart sıcaklık olan 20 ° C'de büyütün. Bununla birlikte, ısıya duyarlı mutantların gelişimini analiz etmek için, genellikle 25 ° C'de bir gece inkübasyonu gerçekleştirin. Belirli mutantlara bağlı olarak, bu inkübasyonun süresini ve sıcaklığını gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Embriyoları monte etmeden önce 4D mikroskopi kaydını hazırlayın (Şekil 2)
<ol><li>Embriyoyu hazırlamadan önce mikroskop ve sıcaklık kontrollerini ayarlayın. C. elegans embriyoları çok hızlı bir şekilde bölünür. Embriyoları monte ettikten hemen sonra kayda başlamaya hazır olun.</li>
	<li>Kayıt sıcaklığını 15 °C, 20 °C veya 25 °C olarak ayarlayın.<ol>
<li>Embriyoları rutin olarak 25 ° C'de kaydedin. Fenotiplerini göstermek için ısıya duyarlı mutantları kısıtlayıcı sıcaklıkta kaydedin. Bir WT kontrolünü (farklı bir preparatta yapılırsa) mutantlarla aynı sıcaklıkta kaydedin. NOT: WT embriyoları, hücre soyunda ek farklılıklar olmaksızın 25 ° C'de daha hızlı ve 15 ° C'de daha yavaş gelişir. Mikroskopları sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirin. Sürgüyü soğutarak veya ısıtarak ek kontrol son derece arzu edilir. Bu, suyun mikroskop hedefi ve kondenserin etrafındaki metal bir halka aracılığıyla belirli bir sıcaklıkta dolaştırılmasıyla sağlanabilir. Amaç ve hazırlık, daldırma yağı ile doğrudan temas halindedir ve sıcaklık transferi verimlidir. Bu sistem, kayıt sıcaklığının hassas bir şekilde kontrol edilmesini ve embriyo gelişimi sırasında sıcaklık değişimlerinin gerçekleştirilmesini sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopi yazılımında kayıt parametrelerini tanımlayın.<ol>
<li>Standart bir C. elegans kaydı için (floresan taramaları olmadan) şunları seçin: Her biri 1 mikron mesafede 30 odak düzleminden oluşan z-yığınları. Her z-yığınının başlangıcı arasında 30 saniyelik aralıklar. 1500 z-yığını (12,5 saatlik kayıt). NOT: Hem ticari hem de açık kaynaklı mikroskop kontrol programları, görüntüleri yakalamak için bu iş akışını tanımlamak için kullanılabilir. Şimdi mikroskop kaydetmeye hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embriyoları hazırlayın ve monte edin
<ol><li>Güzel bir görüntü elde etmenin ilk adımı olarak ince, homojen bir agar pedi hazırlayın (Şekil 3).<ol>
<li>Deiyonize suda 50 ml% 4.5'lik bir agar çözeltisi hazırlayın. Mikrodalgada kaynamaya ısıtın ve 3 ml'lik cam tüplere 0.5 – 1 ml dökün.</li>
		<li>Kurulaşmayı önlemek için tüpleri balmumu filmi ile dikkatlice kapatın. Kapalı agar tüpleri oda sıcaklığında iki aya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Laboratuvar tezgahında, 80 ° C'de bir ısı bloğuna sahip olun: içinde ince bir boya fırçası bulunan saf petrol jölesi (erimiş) bir test tüpü. Pasteur pipet içeren damıtılmış su içeren bir test tüpü. NOT: Bu, gerekli tüm malzemelerin sıcak olmasını ve agarın pedi yapma sürecinde katılaşmamasını sağlar.</li>
		<li>Balmumu filmini agar tüplerinden birinin üstünden çıkarın ve agar'ı eritmek için bir alkol brülörü üzerinde dikkatlice ısıtın. Cam tüpten atılan sıcak agar yanıklara neden olabileceğinden dikkatli olun.</li>
		<li>Agar eritildikten sonra, agar'ı sıvı halde tutmak için tüpü ısı bloğuna yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, agar tüplerini bir brülör kullanmadan eritmek için deneyden 1 saat önce ısı bloğuna yerleştirin. Erimiş agar bir gün sonra atılmalıdır.</li>
		<li>Bir plastik parçası üzerine diğer iki kişi arasına bir mikroskop slaytı (Slayt A) yerleştirin.</li>
		<li>Başka bir slayt alın (Slayt B) ve bir elinizde parmaklarınızla tutun.</li>
		<li>Öte yandan, sıcak Pasteur pipetini kullanarak Slayt A'nın ortasına küçük bir damla erimiş agar yerleştirin.</li>
		<li>Slaytlar A ve B arasında çok ince bir ped oluşturmak için hemen B slaytını agar damlasına bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoları monte edin.<ol>
<li>Toplayıcı ile 5-10 gravid hermafrodit toplayın ve bunları suyla dolu bir saat ustası bardağına yerleştirin.</li>
		<li>Hermafrodit nematodlarını kesmek ve stereomikroskop altında uterustan erken yumurtaları (1-4 hücre) çıkarmak için bir neşter kullanın.</li>
		<li>3.1.10 adımındaki slaytı alın ve agar pedini Slayt A'da göstermek için yavaşça Slayt B'yi kaydırın.</li>
		<li>Kılcal bir tüp ile pipetleyerek agar pedinin ortasına erken bir yumurta yerleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, agar pedine bir dizi embriyo içeren bir damla pipet yerleştirin ve daha sonra erken evre embriyoları arayın. Bu adımı stereomikroskop altında yapın.</li>
		<li>Gerekirse, yumurtayı kürdanın ucuna yapıştırılmış bir kirpikle dürterek hareket ettirin.</li>
		<li>Kılcal pipetle fazla suyu çıkarın. NOT: Bir kılcal pipet, bir Pasteur pipeti bir alkol brülörü üzerinde ısıtıp her iki ucundan çekerek kolayca hazırlanabilir.</li>
		<li>Hazırlığı dikkatlice bir kapak fişi ile örtün. Hava kabarcıklarını önlemek için, kapak kaymasının bir kenarını slaytın üzerine yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça ve eğik bir şekilde preparasyona örtmek için bitişik kenar boyunca bir neşteri yavaşça kaydırın.</li>
		<li>Agar pedini çevreleyen alanın 3/4'ünü suyla doldurmak için pipet kullanın. Alanın 1 / 4'ünü hava ile bırakın.</li>
		<li>Uzun kayıt süreleri boyunca kurumasını önlemek için kapak kapağını petrol jölesi ile kapatın.</li>
		<li>İnce fırçayı, ince bir erimiş petrol jölesi tabakasını kapak kapağının kenarına uzatmak için kullanın. NOT: Şimdi hazırlık kayıt için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DIC'yi ayarlayın ve 4D mikroskopi kaydını başlatın
<ol><li>Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin. Düşük büyütme hedefini (5x veya 10x) kullanarak embriyoyu odaklayın.</li>
	<li>100x daldırma hedefine geçin.</li>
	<li>Nomarski görüntüsü elde etmek için mikroskobun optik bileşenlerini ayarlayın.<ol>
<li>Kondenseri odaklayın.</li>
		<li>Kondenserin diyaframını tamamen açın ve alan diyaframını kapatın (bu, daha yüksek bir sayısal diyafram açıklığı ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlük sağlayacaktır).</li>
		<li>Mikroskoptaki her iki polarizörün de maksimum ışık sönmesine neden olacak şekilde yönlendirildiğini kontrol edin.</li>
		<li>Wollaston prizmasını çevirerek embriyonun bir taraftan aydınlatılmış üç boyutlu güzel bir görüntüsünü elde edin. Embriyonun diğer tarafta aydınlatılmasının etkisini elde etmek için prizmayı diğer yöne çevirin. NOT: Bu adımlar, kayıttan önce bir test numunesi üzerinde gerçekleştirilebilir, böylece analiz edilen numunede yalnızca ince ayar yapılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü yakalamayı mikroskopta başlatın.</li>
</ol>5. 4D filmi analiz edin (Şekil 4).
NOT: Kayıt tamamlandıktan sonra, hücre kökenini yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için hücre kökeni izleme yazılımını kullanın.
Hücre soyu izleme yazılımı, hücre kültürlerindeki veya doku fragmanlarındaki embriyonik gelişim veya dinamiklerin ayrıntılı analizlerini yapmak için güçlü bir araçtır. Program, hücre bölünmeleri, hücre döngüsü uzunluğu, göç veya apoptozun yanı sıra kinetiği de dahil olmak üzere, kaydedilen her hücrenin tam hücre soyunun oluşturulmasını içeren numunenin hücresel dinamikleri hakkında çeşitli veri setlerini çıkarır ve nicelleştirir. Ek olarak, hücre farklılaşması, hücrenin morfolojik değişiklikleri veya spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile puanlanabilir. Temel olarak, yazılım ekranı iki pencere görüntüler: sol pencerede, 4D film ileri ve geri veya yukarı ve aşağı üst veya alt seviyelere oynatılabilir, böylece her hücre kayıt boyunca zaman ve mekanda takip edilebilir. Sağ dulda, hücre soyu oluşturulur. 4B filmde bir hücre çekirdeğine tıklamak, soy penceresinde hücre adı, kaderi ve uzamsal koordinatların bilgilerini depolayan bir nokta oluşturur. Belirli bir hücrenin hücre soyundan, 4B filmi ileri doğru oynatarak ve zaman içinde o belirli hücrenin mitozunu işaretlemek için periyodik olarak çekirdeğe tıklanarak oluşturulur. Kaydedilen hücrelerin her biri için bu işlemin tekrarlanması, embriyonun veya numunenin tam hücre soyunu oluşturur. Her hücrenin uzamsal koordinatları için depolanan bilgiler daha sonra 3B embriyo modellerini ve hücre göç yollarını yeniden yapılandırmak için kullanılır.
<ol><li>Soy izleme yazılımını açın ve üst çubuk menüsüne gidip aşağıdakileri seçerek yeni bir proje oluşturun: Dosya | Yeni proje.</li>
	<li>Kayıt sıcaklığına bağlı olarak hücre soyağacı şablonunu seçin: 25 °C'de kayıt için DB08, 20 °C'de kayıt için DB10 ve 15 °C'de kayıt için DB12.</li>
	<li>Ortaya çıkan pencerede kayıt parametrelerini ayarlayın: tarama sayısı (genellikle 1500), taramalar arasındaki süre (30 saniye), düzey sayısı (30) ve düzeyler arasındaki mesafe (1 mikron).</li>
	<li>Görüntü dosyasını ve biçimini seçin.<ol>
<li>Görüntülerin kaydedildiği görüntü dizinini seçin.</li>
		<li>Görüntülerin tek görüntü (düzey ve zaman başına bir görüntü) olarak mı yoksa çok görüntülü z yığınları olarak mı kaydedileceğini seçin.</li>
		<li>Dosya adını ve görüntü biçimini belirleyin. Rutin olarak, tek görüntüler aşağıdaki adlar altında kaydedilir: X0000L00C1 (tarama 0, seviye 0, kanal 1 için) X0000L01C1 (tarama 0, seviye 1, kanal 1 için) X0000L02C1 (tarama 0, düzey 2, kanal 1 için) ... X0001L00C1 (tarama 1, düzey 0, kanal 1 için) X0001L01C1 (tarama 1, düzey 1, kanal 1 için) ... X0300L04C1 (tarama 300, seviye 4, kanal 1 için) ... NOT: Görüntüleri sıkıştırılmış bir biçimde kaydetmek, sabit diskinizde yer tasarrufu sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işık kanallarını tanımlayın: DIC optikleri için 1, GFP için 2, RFP için 3, vb. 4B kayıtta kullanılanları ekleyin. Bunları tespit etmek için "kanal işleme etkin" i tıklayın.</li>
	<li>Embriyonun hücre soyunu izlemeye başlayın. Ekran artık iki ana pencere içeriyor: video penceresi ve hücre kökeni penceresi.<ol>
<li>Soy penceresinde, bir soy dalı seçin ve video penceresinde bu hücreye karşılık gelen hücre çekirdeğini tıklatmak için fareyi kullanın.</li>
		<li>İmleç tuşlarını kullanarak 4B filmi ileri, geri veya yukarı veya aşağı bir seviyede oynatarak hücreyi uzamsal olarak ve zaman içinde takip edin.</li>
		<li>Periyodik olarak hücre çekirdeğine tıklayın. Bu, soy dalında bir nokta oluşturur ve şu anda hücrenin uzamsal koordinatlarını kaydeder. Sonuç olarak, hücre soyu ilerler ve embriyonun 3D rekonstrüksiyonları mümkündür.</li>
		<li>return tuşuna tıklayarak mitozu işaretleyin. Ardından yavru hücrelerden birini seçin ve daha önce olduğu gibi izleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyonik hücrelerin geri kalanının tüm hücre soyunu izlemesi veya apoptoz geçirenler gibi ilgilenilen spesifik hücreleri takip etmesi için işlemi tekrarlayın (5.6.1 ila 5.6.4 arasındaki adımlar).</li>
	<li>Mutant soyu kalıplaşmış WT C. elegans hücre soyu ile karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Modern biyolojideki en büyük zorluklardan biri, çok hücreli organizmaların gelişimini anlamaktır. C. elegans, gelişmekte olan embriyoda hücre çoğalması ve hücre farklılaşması arasındaki ince koordinasyonu incelemek için en uygun modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, şeffaf gövdesi ve küçük boyutu bu nematodu DIC mikroskobu için ideal bir örnek haline getirir. Benzer özelliklere sahip diğer organizmalar da 4D mikroskopi analizine tabi tutulmuştur 11,12,13,14,15,16.
Bu gelişimsel çalışmalar için, ileri veya geri genetik ile gen inaktivasyonu, embriyogenezdeki katılımına dair bir ipucu sağlar. Bir genin gelişimde rol oynadığı kanıtlandıktan sonra, bir sonraki adım, doğru vücut planının oluşturulmasındaki rolünü tanımlamaktır. İmmün boyama çoğu model için seçilen yaklaşımdır. Bu teknik, hücre farklılaşmasındaki veya spesifik belirteçlerin ekspresyonundaki sorunları aydınlatır. Bununla birlikte, bu yaklaşımın önemli bir sınırlaması, yalnızca gelişimin sabit bir noktasında tek veya daha fazla işaretleyicinin ifadesinin statik bir görünümünü sağlamasıdır. Bu belirteçlerin gelişim boyunca dinamik bir görünümü ancak farklı embriyoların farklı zaman noktalarında boyanmasıyla elde edilebilir. Ek olarak, bu tür sabit örneklerde hücre soyu rekonstrüksiyonu mümkün değildir.
4D mikroskopi, embriyonik gelişimi incelemek için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Bu teknik, hücre düzeyinde çözünürlükte gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Embriyodaki iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz, hücre kaderi spesifikasyonu gibi herhangi bir kusur, araştırmacı tarafından ileri ve geri görselleştirilebilen, nicelleştirilebilen ve puanlanabilen bir 4D filmde ortaya çıkacaktır. Bu tekniği kullanarak, embriyodaki hemen hemen her hücre, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Sadece görünür ışık ve Nomarski optikleri ile 4D mikroskopiye tabi tutulan embriyolar fotohasara maruz kalmaz. Floresan taramalar, bir genin ne zaman ve nerede ifade edildiğini tespit etmek için kayıt içinde de birleştirilebilir. Önemli fotohasara maruz kalan embriyolar, standart bir WT soy embriyosuna kıyasla güçlü UV ışınlamasına neden olan hücre döngüsü uzantısı ile tanımlanır. Bu durumda, UV lamba yoğunluğunu düşürerek ve kamera hassasiyetini veya pozlama süresini artırarak fotohasar azaltılabilir. Morfolojik özellikler ve moleküler belirteçler, herhangi bir mutantın embriyonik gelişimini netleştirmeye yardımcı olabilir.
Bir 4D mikroskopi sisteminin kurulması laboratuarda uygulanması kolaydır ve bazı uygulamalardan sonra, hücre dinamiklerinin eşsiz bir analizini ve hücre kültürlerinin soy izlemesini ve mikroskop alanındaki her hücrenin çözünürlük seviyesinde yaşayan şeffaf örnekleri mümkün kılar. DIC görüntülerinde hücre soyağacı izleme hala elle işlenir. Zaman alıcıdır ve yazılım aynı hücreyi işaretleyen farklı soy dalları gibi soy hatalarını tespit etse de, hatalar mümkündür. GFP etiketli hücrelerin otomatik tespiti iyi geliştirilmiş2 olsa da, işaretsiz hücrelere ve görünür ışık görüntülerine dayanan tamamlayıcı soy izleme yazılımı hala erken aşamadadır ve tam bir embriyo analizi için gerçekten yararlı değildir. Hiç şüphesiz görüntü tanıma sistemlerinin görünür ışık mikroskobu alanına uygulanması bu alanda büyük bir ilerlemeyi beraberinde getirecektir.

4D mikroskopi, araştırmacıların biyolojik bir numunenin hücre dinamiklerini hem mekansal hem de zaman içinde kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlayan çok odaklı bir hızlandırılmış kayıt sistemidir. Hücre kültürleri, mayalar veya canlı dokular 4D analize tabi tutulabilir, ancak bu teknik özellikle canlı embriyoların gelişimini analiz etmek için uygundur. Bu analizin çözünürlüğü, embriyonun her bir hücresinin seviyesine ulaşır. Her hücre bölünmesi tespit edilebilir ve hücre hareketleri zamanla izlenebilir. Hücre kaderleri, hücrelerin kazandığı konum ve şekle göre değerlendirilir. Nomarski optiklerinin kullanımı, odak düzlemine müdahale eden ortogonal polarize ışık huzmeleri kullanarak lekesiz şeffaf numunelerin kontrastını arttırır. Elde edilen görüntüler üç boyutlu görünür, bir tarafta aydınlatılır.
Çekirdeklerin otomatik tespiti ve hücre soylarının oluşturulması için konfokal mikroskopi ve GFP transgenik hayvanların kullanımına dayanan diğer yöntemler geliştirilmiştir 1,2. Bu sistemlerin avantajı açıktır: Yazılım, her çekirdeği belirli bir süre boyunca manuel olarak işaretleme ihtiyacını büyük ölçüde geçersiz kılar (geç aşamalarda bazı manuel denetimler gerekmesine rağmen). Bununla birlikte, hücre farklılaşması, göç, apoptoz veya ceset yutulması sırasında meydana gelenler gibi hücre şekli veya membran dinamiklerindeki değişiklikleri içeren hücresel süreçler, floresan etiketli çekirdek görüntülerinde siyah bir arka plan olarak gizli kalır.
Buna karşılık, 4D Nomarski mikroskobu (DIC mikroskobu, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu olarak da adlandırılır), vahşi tip veya mutant hayvanların gelişimi sırasında meydana gelen hem çekirdekleri hem de hücre şekli değişikliklerini gösterir. Bu, standart mikroskoplar kullanarak hücre soyağacı izlemesine izin verir ve yalnızca iletilen ışığı kullanır. Belirli ifade kalıplarını göstermek dışında transgenik hayvanları kullanmaya genel bir ihtiyaç yoktur, bu durumda floresan taramaları birbirine karışabilir. Bu nedenle, bu, DIC mikroskobu 3,4,5,6,7 altında vurgulanabilen embriyogenez veya apoptoz gibi dinamik hücre süreçleri üzerinde çalışan birçok laboratuvar için en uygun yaklaşım olabilir.
Mikroskobik görüntüleri yakalamak ve kaydedilen örnekte hücre soylarını, 3B modelleri, hücre geçiş yollarını vb. Yeniden yapılandırmak için çeşitli esnek ve kullanıcı dostu programlar mevcuttur. Standart bir deneyde, görüntüler, sayısı numune kalınlığına bağlı olan sabit bir mesafede, bir dizi odak düzleminde elde edilir. Analizin zamansal çözünürlüğü, tarama sıklığı artırılarak optimize edilebilir. Kayıt süresi için bilgisayar depolama kapasitesi dışında neredeyse hiçbir sınır yoktur. Örneğin, bir C. elegans embriyo gelişim analizi için, 12 saat boyunca her 30 saniyede bir 30 odak düzleminde (her biri 1 mikron adım) rutin olarak görüntüler elde ediyoruz.
Bu sistemler, Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster 11, diğer nematod embriyoları12,13, tardigradlar 14,15 ve hatta erken fare embriyoları 16 gibi çeşitli hayvan embriyolarının analizine uygulanmıştır. Tek şart, mikroskop altında slayt hazırlığında gelişebilen şeffaf bir embriyoya sahip olmaktır.
Özetle, DIC tabanlı 4D mikroskopi özellikle 1) küçük, şeffaf hayvanların embriyonik gelişimini analiz etmek için yararlıdır: hücre soyunun, hücre göç yollarının izlenmesi, 3D modellerin oluşturulması, vb. 2) gen ekspresyon kalıplarını tanımlamak; 3) mayadan insan hücrelerine kadar hücre kültürü dinamiklerini incelemek; 4) doku dinamiklerini veya embriyo parçalarını analiz etmek; 5) hücre ölümü kinetiğini ve ceset yutulmasını ölçmek; ve 6) embriyonik gelişimsel özelliklere dayalı karşılaştırmalı filojeni analizi yapmak. Bu konulardan herhangi birine (veya benzerlerine) ilgi varsa, 4D mikroskopi kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

4D mikroskopi, farklı hayvanlarda embriyonik gelişim sürecini çözmek için paha biçilmez bir araçtır. Son yıllarda, Caenorhabditis elegans , gelişimi incelemek için en iyi modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, boyutu ve şeffaf gövdesi bu nematodu DIC (Diferansiyel Girişim Kontrastı veya Nomarski) mikroskopisi için ideal bir örnek haline getirir. Bu makalede, C. elegans nematodlarının yetiştirilmesi, embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskopi ve hücre soyağacı takibinin yapılması için bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, Nomarski görüntülerinin çok odaklı hızlandırılmış kayıtlarına ve belirli bir yazılımla yapılan analizlere dayanmaktadır. Bu teknik, hücresel düzeyde embriyonik gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz veya hücre kaderi spesifikasyonu gibi mutantlardaki herhangi bir embriyonik kusur etkili bir şekilde tespit edilebilir ve puanlanabilir. Embriyonun hemen hemen her bir hücresi, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Bir C. elegans embriyosunun tüm hücre soyunun 4D DIC mikroskopisi ile izlenmesi zahmetlidir, ancak belirli bir yazılımın kullanılması bu görevi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ek olarak, bu tekniğin laboratuvarda uygulanması kolaydır. 4D mikroskopi çok yönlü bir araçtır ve embriyonik gelişimin benzersiz bir analizini yapma olasılığını açar.

İndirgenmiş glutatyonu (GSH) yenilemek için gerekli olan ve nematodda redoks homeostazını sürdürmeye dahil olan glutatyon redüktaz enzimini kodlayan gsr-1 geni için bir C. elegans mutantının embriyonik gelişimini karakterize etmek için, erken embriyonik arrest fenotip18'e neden olan fonksiyon aleli olan bir gsr-1 (tm3574) delesyon mutantının 4D mikroskopisini gerçekleştirdik. Hem WT hem de dengeli gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematodları, besin kaynağı17 olarak E. coli OP50 ile tohumlanan NGM plakalarında yetiştirildi. gsr-1 (tm3574) solucanları iki nesil boyunca 20 ° C'de heterozigot olarak yetiştirildi ve daha sonra homozigot solucanları ayıran (anne yükü sayesinde yetişkinliğe kadar büyüyebilen) embriyo analizinden önce bir gecede inkübasyon için 25 ° C'ye kaydırıldı. Yoğuşmayı önlemek için solucan plakalar karton kutular içinde inkübe edildi (Şekil 1). Genç embriyoları çıkarmak için gravid nematodları kesilerek açıldı.
Aynı koşullar altında mutantın embriyonik gelişimini stereotiplenmiş WT'ye karşı karşılaştırmak için, bir WT (kontrol olarak) ve bir gsr-1 (tm3574) embriyosu yan yana aynı preparasyona yerleştirildi. 4D mikroskopi iş akışı, DIC optikleri ile donatılmış standart bir motorlu dik mikroskop üzerinde çalıştırıldı. Mikroskop kontrol programında seçilen kayıt parametreleri şunlardı: her biri 1 mikron mesafede 30 odak düzleminin z-yığınları, her bir z-yığınının başlangıcı ile 1500 z-yığını arasında 30 saniyelik aralıklar (12.5 saatlik kayıt). Kayıt sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlandı (hem odada hem de mikroskop aşamasında) (Şekil 2).
Kayıt tamamlandıktan sonra, görüntü dosyası açıldı ve video penceresinde gösterilen hücre çekirdeklerine tıklanarak soy izleme yazılımı kullanılarak hücre soyu yeniden yapılandırıldı (Şekil 4). İzlenen gsr-1 (tm3574) mutant embriyonik hücre soyu arka planda tasvir edilen C. elegans WT soyu ile karşılaştırıldı. Önemli bir sonuç, embriyonik gelişim sırasında hücre döngüsünün ilerleyici bir gecikmesinin tespit edilmesiydi. Sonuç olarak, mutant embriyolar ara aşamalarda tutuklanırken, WT embriyoları ilerledi ve sonunda larva olarak yumurtadan çıktı.
Embriyoların mikroskop altında hazırlanması ve doğrudan gözlemlenmesi veya geç embriyonik belirteçlere karşı antikorlarla immünoboyama, WT'ye kıyasla mutantta yüksek oranda genç embriyonun varlığını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, hücre döngüsü gecikmesinin doğrudan kanıtı ve kesin nicelleştirilmesi, yalnızca bir 4D mikroskopi deneyi ile zarif ve kolay bir şekilde gösterilebilir. Hücre farklılaşması veya apoptoz gibi embriyonik gelişimin diğer önemli özellikleri (Şekil 5), tek bir deneyde gelişimin birçok yönünün ayrıntılı bir analizini sunan 4D mikroskopi kullanılarak dinamik bir şekilde görselleştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Şekil 1: C. elegans nematodları laboratuvar koşullarında yetişmektedir. Nematodlar E. coli tohumlu NGM plakalarında yetiştirilir, karton kutularda saklanır ve 15 °C, 20 °C veya 25 °<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">C'de</a> inkübe edilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Şekil 2: 4D mikroskopi kayıt yazılımının ekran görüntüsü. İki farklı mikroskop kontrol yazılımı programı örneği (A ve B). Bu programlar, 4D mikroskopi kaydı sırasında mikroskop ve görüntü yakalamayı kontrol etmek için iş akışları oluşturur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Resim 3: Agar pedinin hazırlanması ve montajı ile ilgili C. elegans embriyosunun seri fotoğrafları gösterilmektedir. A . Hazırlanmış agar tüpleri. B-C. Agar pedinin hazırlanması. D. Kısmen suyla dolu kaydırın. E. Slaytın petrol jölesi ile kapatılması. F. Son hazırlık. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Şekil 4: Hücre soy izleyici yazılımının seri ekran görüntüleri. Program, bir hücre döngüsü gecikme mutantının (solda) ve bir WT (sağda) C. elegans embriyosunun embriyonik hücre soyunun yeniden yapılandırılmasına izin verir. A. Gelişimin erken bir adımı. B-C. Her iki embriyonun gelişimi zamanla ilerler. D. WT embriyosu düzgün gelişir ve uzamaya başlarken, mutant tutuklanır. Her durumda program video penceresini ve soy penceresini görüntüler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Şekil 5: Bir C. elegans WT embriyosundaki apoptotik hücrelerin mercimek refraktil şekli. Morfolojik özelliklerle tanımlanan hücre kaderi, 4D mikroskopi ile değerlendirilebilir. Resim, fasulye aşamasında bir C. elegans embriyosunu göstermektedir. Canlı hücreler, granüler bir sitoplazma ile çevrili pürüzsüz şekilli çekirdekler gösterir. Buna karşılık, apoptotik hücreler (sarı oklar) yoğunlaşır ve mercimek benzeri, refraktil bir şekil alır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Görüntüleme.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...