İç kurumsal fonlar ve Michigan Üniversitesi Biyolojik Bilimler Alimler Programı, bu çalışmaları destekledi.

Solucan Hazırlık <ol><li> 22 görüntüleme önce uygun plakaları 18-24 saat L4 larva solucanlar aktarın. Bu size bol kaynağı için erken embriyo yumurta taşıyan yetişkinler var sağlayacaktır. </li><li> Vazelin ve Agaroz tüpleri hazırlayın. Biz mikrodalga beher vazelin erime ve tüp başına 4-5 ml kısım içine dağıtım birkaç 15 mL şahin tüpler hazırlar. Benzer şekilde% 2-3 oranında (w / v) Agaroz (M9 veya Yumurta Buffer) Tampon ve şahin tüpler içine kısım 4-5 ml eritebilir. Buharlaşmasını en aza indirmek için aşırı kaynatmak için dikkatli olun. Görüntüleme gününde, 65-70 ° C ısıya blokta 1 tüp vazelin eritebilir ve mikrodalga 1 tüp agaroz eritebilir, yine Üzerine kaynar en aza indirmek için dikkatli olun. Tüpler, erimiş durumda vazelin ve Agaroz tutmak için ısı bloğu içinde saklayın. </li><li> Agaroz pad olun. Her kılavuzu slayt üst ve alt yapıştırılır tek bir katmanı tarafından ortak laboratuvar bant kaplı slaytlar 2 kılavuz slaytlar arasındaki yeni bir mikroskobu slayt yerleştirin. Yeni bir slayt 2-3 damla erimiş Agaroz yere kopmuş sonunda Pasteur, pipet kullanın. Kapak, özgün slayt 2. slayt dik kapsar ve ince bir kare takımını oluşturmak için Agaroz yaymak için yardımcı olduğu. 2. slayt kılavuz kızaklar üzerinde bant üzerinde dinlendirilmeli. Agaroz konsantrasyonu kalın pedler için% 5 artış olabilir. </li><li> 18 mm x 18 mm lamel M9 veya Yumurta Tampon 9-12μL damla, bir diseksiyon kapsamı ve bir platin tel kullanarak transferi 2 yetişkin solucanlar &quot;almak&quot;. </li><li> (27G1 / 2 iğne kullanımını) bir iğne veya embriyoları serbest neşter ile açık solucanlar kesin. Solucanın ortasında kesmek için deneyin. </li><li> Embriyoların içeren 18x18 mm lamel üzerine Agaroz pad (agar yüzü aşağı) indirin. Trim agar bir jilet ile kapak kayma kenarına uzanan. </li><li> Seal lamel dört kenarları eritilmiş vazelin uygulamak için bir fırça veya ince tahta sopa kullanarak lamel. </li></ol> (Yani düzgün bir şekilde yumurta kabuğu biçiminde olmazsa) embriyolar basınca duyarlı olup olmadığını asılı olan agar bağlar Alternatif 23 düşer. Görüntüleme da gübreleme, mayoz bölünme gibi erken olayları takip etmek in utero yapılabilir. Worms Levamizol 24 ile anestezi olmalıdır. Gelişimin belirli bir aşamasında embriyo sayısını artırmak amacıyla, çeşitli solucanları bir zaman ve yavaşça pipet ucu ince veya bir kirpik fırçası ile birlikte yerleştirilmiş embriyolar ya da ağız pipetleme disseke olabilir. 4D Nomarski DIC (Diferansiyel Girişim Kontrast) Filmler <ol start="8"><li> Olympus BX61 mikroskop açın. Kamera, diğer cihazlar tarafından yayılan EM dalgalar hassas çünkü son cıva ampul (GFP veya floresan için gerekirse) ilk açıktır. Her şeyi bir kez Micro-Yöneticisi&#39;ni başlatın. DIC veya floresan görüntüleme için uygun bir konfigürasyon dosyası seçin. En önemli fark, DIC dosya floresan deklanşör kontrolü içermez. Her dosya, aynı zamanda uygun filtre küp ve kamera kazanç ayarı seçer. </li><li> 10x objektif ile mikroskop embriyolar bul. Görüntüleme alanı içinde birden fazla embriyolar elde etmek için genç embriyoların gruplar için solucan organları yakın bakın. En iyi görüntü için solucan içinde embriyolar kaçının. </li><li> Amacı görüntüleme (1.4 NA 0.9) daha yüksek bir büyütme (40x 100x için) ve çözünürlük yazılım anahtarını kullanma. </li><li> Nomarski DIC Optik ayarlayın (aşağıdaki web sitelerini yararlı DIC optik açıklama ve terminoloji içeren <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Olympus BX61 tarihinde önemli bileşenleri şunlardır: <ol><li> Polarize - kondenser altında kaydırıcıyı </li><li> Kondenser Wollaston Prizma taret kondenser, sahne hemen altında. </li><li> Amaç Wollaston Prizma - filtre küpler altında kaydırıcıyı </li><li> 2. Polarize (Analyzer) - DIC pozisyonda filtre küp </li></ol></li><li> DIC Filtre Küp ışık yolu (yazılım başlangıç ​​yapmalısınız) Analyzer (2. polarize) konumuna geçin. </li><li> Iki polarize düzgün hizalanmış (çapraz) emin olun. Işık yolu her iki Wollaston prizmalar zaman görüş alanı koyu renkli olmalıdır. Gerekirse, bu doğru kadar kondenser altındaki polarize döndürün. </li><li> Işık yolu ise objektif (üst) Wollaston Prizma yerleştirin. </li><li> Kullandığınız amacı ile eşleşen Wollaston prizma seçmek için kondansatör taret döndürün. </li><li> Bu taret altında objektif NA maç sürgüsünü ayarlayın. </li><li> Köhler optimum aydınlatma için kondenser odaklanın. </li><li> Üst Wollaston Pri ayarlayın.sm kaydırıcıyı düğmeyi döndürerek en iyi kontrast elde etmek için. </li><li> Diğer ayarlar yazılım başlangıç ​​tarafından kontrol kamera kazanç (0) ve 8-bit, 16-bit TIFF dosyaları olarak dosyaları kaydetmek geçmek içerir. </li></ol></li><li> Güzel bir imaj vermek için ışık seviyesini ayarlayın. (Genellikle 4.7 Volt) (yazılım üzerinden kontrol). Parlak piksel doygunluk seviyelerini aşağıda ki örnek aydınlatmak için tercih ediyor. Embriyo sarısı granül açıkça göze çarpıyor 3-boyutlu bir görünüme sahip bir görüntü İyi DIC optik sonuçları. Örnek aydınlatan ışık, bir açıdan örnek bir tarafında (ya da örnek özellikleri) aydınlık ve karşı tarafında gölgeler ve koyu görünür böylece parlaklık görünüyor sanki Alternatif olarak tarif edilebilir. </li><li> Faiz (ROI) Bölge seçin resme istediğiniz embriyolar, pencere azaltmak için yatırım getirisi düğmesini tıklatın. </li><li> Çok boyutlu bir satın alma penceresini açın. Z-yığınlarının (dilim) ve Zaman Puanlar seçin. </li><li> Embriyonun alt (odak bazı sarısı granül ile son odak düzlemi) bulmak için mikroskop odak düğmesini kullanın. Seç alt tıklayın. Embriyonun üst belirlemek ve ayarlamak için tekrarlayın. Biz genellikle 1 mikron adım boyutu ~ 20 odak uçakları ile sonuna kadar. Embriyoların ve hücrelerin nispeten kalın, çünkü genelde her zaman bir noktada birden fazla odak düzlemleri toplamak. Buna ek olarak, hücrelerin farklı yönlerde bölünmeye başlar, özellikle orijinal odak düzlemi içinde veya dışında hareket embriyonun çevresindeki diğer hücreleri yerinden yapabilirsiniz. Mikroskop bir odak motor yoksa el ilgilendiğiniz hücre veya süreci takip odağı ayarlayabilirsiniz. </li><li> Zaman noktaları ve zaman aralığı Giriş sayısı gerekiyordu. Biz genellikle 15 saniye arayla kullanmak ve maksimum 500 puan ayarlayabilirsiniz. Biz daha fazla zaman noktaları ile istenildiği zaman satın alma ihtiyaç ve duracağız daha başlar. Eğer birden fazla odak düzlemleri görüntüleme yapıyorsanız, tüm odak düzlemleri zaman noktaları arasındaki aralığı elde etmek için yeterince zaman olduğu emin olun. </li><li> Verileri kaydetmek için bir konum seçin veya oluşturun. Yazılım, sadece son görüntüyü göstermek için ayarlanmış olduğundan emin olun. Dosyanın bir ad verin ve Acquire tıklatın. Düzgün çalıştığından emin olmak için ilk birkaç zaman noktaları için otomatik görüntü elde etme izleyin. </li><li> Satın durdurmak için istediğiniz zaman durdurmak, 10x objektif geçmek ve bir sonraki slayt hazırlamak. </li><li> Bittiğinde görüntüleme ışık yolu DIC bileşenleri kaldırmak. Amacı gerekli özelliğine temizleyin petrol. Kamera ile başlayarak kapalı her şeyi açın. </li></ol> GFP Filmler <ol start="20"><li> Mikroskop başlatın ve yukarıdaki gibi embriyolar bulmak. Floresan deklanşöre yazılım kontrolü içerir yapılandırma dosyasını kullanın. </li><li> Üst DIC prizma (kaydırıcı), ışık yolu olmadığından emin olun. </li><li> Anahtar FITC / GFP Filtre Cube (başlangıçta otomatik olarak ayarlanır) </li><li> 16-bit TIFF (Bu yapılandırma dosyası ile başlangıçta otomatik olarak ayarlanır) Kamera kazanç ve görüntü dosyası 255 olarak değiştirin. </li><li> Beyaz ışık kapatın. </li><li> Önizleme görüntüsü için tıklayın Canlı Görüntüleme. Işığa maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın. Alternatif olarak, tek bir görüntü toplamak Snap to Resim kullanın. </li><li> Merkür ampul gücü / nötral yoğunluk filtreleri, iyi bir görüntü elde etmek için poz süresini ayarlayın. Genel olarak, en az ışık floresan sinyalleri hücre ve photobleaching fotohasar azaltmak için istediğiniz verileri almak için örnek ulaşan kullanmanız gerekir. </li><li> Zaman aralığı, zaman noktalarının sayısı ve odak düzlemleri sayısını ayarlayın. Biz genellikle 5-10 saniyelik aralıklarla ve 1-3 odak düzlemli kullanın. </li><li> ROI seçin ve görüntü elde etmek için Adımlar 13-19 daha önce açıklandığı gibi parametrelerini ayarlamak. </li></ol> Analiz Filmler <ol start="29"><li> Veri girdiğiniz ad ile klasör ve tiff dosyaları 4D yığını her görüntü için bir dizi, bir metin dosyası ve maruz kalma seviyeleri ve zaman aralıkları gibi bir xml dosyası içeren meta verilerini içeren kaydedilir. </li><li> Tiff görüntüleri iki yöntem ile ImageJ açılabilir. (Yöntem) ilk olarak basit ve aynı zamanda her dosyanın meta verilerini okuyacaktır. (Yöntem b) ikinci ImageJ için ayrılan bellek miktarını daha büyük dosyaları açmak için sanal bellek kullanımı mümkün, ancak meta içermez. <ol class="lalpha"><li> Micro-Manager Plugin kullanarak <ol><li> Micro-Manager üzerine inşa ve kullanımları ImageJ (önceden yüklenmiş olabilir başka bir sürümden farklı olacak, ImageJ yeni bir sürümünü yükler) ve veri açmak için bir eklenti içerir. Alternatif olarak, ImageJ başka bir versiyonu için plugins klasörüne Micro-Manager-1.3/plugins klasörün içeriğini kopyalayabilirsiniz. </li><li> Plugins menüsüne git Mikro-Manager seçin ve ardından Açık Mikro-Yöneticisi Dosya. </li><li> Ve ok tıklayın görmek istediğiniz verileri içeren klasörü seçin. </li><li> Z ve T boyutları ile oynayın. </li></ol></li><li> Loci plugin ile film BioFormats İthalatçı açmak için. <ol><li> Tiff dosyalarını içeren klasörü Transferi, xml ve txt dosyaları ve veri kümesi adını maç için iki dosyayı yeniden adlandırmak. </li><li> ImageJ içinde, Veri Browser ya da Bio-Formatları İthalatçı ya da daha sonra Eklentiler menü aşağı çekme, Loci seçin. </li><li> Tiff yığınları ile klasörü bulun. Ilk tiff dosya üzerine tıklayın, sonra açın. </li><li> Hyperstack ile yığını. Dataset organizasyon çerçevesinde: Benzer isimler, Takas boyutları ile Grup Dosyaları seçin ve tüm serileri açın. Bellek yönetimi altında:: sanal bir yığın (özellikle büyük veri setleri için) kullanın. Ok deyin </li><li> Eklentisi veri seti boyutları (# zaman noktaları ve odak düzlemleri) belirlemek ve bir dizi &lt;&gt; parantez aralığında gösterecektir. Ok tıklayın veya zaman noktaları ve / veya açmak için odak düzlemleri sayısını değiştirebilirsiniz. </li><li> Boyut, her seri karşılık geldiğini onaylayın. </li><li> Z ve T boyutları ile oynayın. </li></ol></li></ol></li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Nomarski DIC film Şekil 1 Stills erken C. sırasında normal hücresel olayları gösteren elegans embriyo gelişimi: pronükleer göç (0-5:45), asimetrik ilk bölümü (6:45-14:45) ve asenkron ikinci lige (14:45-27:00). Veri 60x 1.35 NA lens ile toplanmıştır. 1 mikron aralıklarla 20 odak düzlemleri 40 μs maruz kalma ile her 15 saniyede toplanmıştır. Bu posterior, sağ ve ventral aşağı böylece Resimler döndürülemez. Ölçek Bar 10 mikron temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 metafaz (C) anafaz iğ midzone görünen öncesine kadar erken anafaz kromozom üzerinde mevcut kromozom yolcu kompleks bir GFP etiketli subunit (HAVA-2) dinamik hareketler gösteren bir floresan film Stills sitokinez tamamlar (F C). Veri 60x 1.35 NA lens ile toplanmıştır. Tek bir odak düzlemli 50 μsec maruz kalma ile her 10 saniyede toplanmıştır. Böylece bu posterior sağ Resimler döndürülemez. Ölçek Bar 10 mikron temsil eder. Wild-Tipi Embriyo Movie 1 Nomarski Film. Şekil 1 tekabül eden bir film. Posterior, sağ ve ventral alt sol alt. Ayarlanır özgün veriler tek bir odak düzlemli gösterir. Image her 15 saniyede toplanmış ve oyun saniyede 14 kare hızla geri ayarlanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">video izlemek için buraya tıklayın</a> Movie 2 GFP ifade Wild-Type embriyo Floresan Film: AIR-2. Şekil 2 tekabül eden bir film. Posterior sağ üst etmektir. Film tek bir odak düzlemli olarak toplanmıştır. Image her 10 saniyede toplanmış ve oyun saniyede 14 kare hızla geri ayarlanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">video izlemek için buraya tıklayın</a>

<ol>
	<li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication.">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li><li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Heuvel, S. v. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+regulation.">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo.">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li><li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+C.+elegans.">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+[see+comments].">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li><li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants.">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li><li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NemaGENETAG+initiative:+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans.">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans.">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li><li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III.">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li><li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li><li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase.">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li><li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans.">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li><li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses.">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li></ol>

Zaman atlamalı canlı görüntüleme için önemli bir husus, hücre ve organizmanın bütünlüğü ve canlılığını korumak için. DIC mikroskopi örnek aydınlatma kaynağı ultraviyole ışık ve aşırı ısıtma maruz kalmayacağı bir yarar sağlar. DIC mikroskopi hücre gibi sitokinez olarak göç ve hücre şekil değişiklikleri de algılamak ve mitotik iğsi ve nükleer membran gibi bazı hücre içi yapıları tanımlamak için uygundur. Muhabir proteinlerin floresan görüntüleme ek hücre içi bölmeleri belirlenmesi ve spesifik proteinlerin görselleştirme izin DIC mikroskopi tamamlar. Fototoksisite ve floresan görüntüleme sırasında embriyo zarar tehlikeleri azaltmak için, genellikle düşük UV ışık şiddeti ve aydınlatma süresi ofset dijital kamera kazancı artırmak. Soluk floresan transgenik gazetecilere arka plan çekilen görüntülerin kalitesini artırmak için, deconvolution algoritmalar azaltmak için odak-ışık veya deblurring algoritmaları yeniden atamak için. Konfokal veya multiphoton sistemleri gibi gelişmiş mikroskoplar bazen gerekli olsa da, çok sayıda floresan gazetecilere bu epifluorescent mikroskop kurulum kullanarak, yüksek kaliteli görüntüler alındı ​​görüntülü olabilir bulduk. Micro-Yöneticisi (http://www.micro-manager.org), ücretsiz olmasının yanı sıra, doğrudan tiff formatında dosyalar yerine, birçok ticari yazılım paketleri özel dosya formatlarını kaydeder. Bu önemli ölçüde ImageJ, Photoshop ve diğer resim düzenleme yazılımı görüntü dosyalarını okumak için gerekli olan dosya dönüştürme adım ortadan kaldırarak veri analizleri kolaylaştırır.

Hamamatsu Orca-ER kamera ile Olympus BX61 mikroskop. 10x Planı Florit (NA 0.3) ve 60x PlanAchromat (NA 1.35) amacı lensler Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agaroz - moleküler biyoloji / jel elektroforezi notu Fisher SuperFrost / Plus Mikroskop Slaytlar (Katalog # 12-550-15) Laboratuvar bant (Fisher Katalog # 15-901 Serisi) 18 mm x 18 mm # 1.5 lameller M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Yumurta Tampon (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM Hepes, pH 7.3) 25. Vazelin Fırça / çubuk Tıraş bıçağı Isı blok Diseksiyon mikroskobu Worms 22 Platin tel 22 almak 27G1 / 2 Hassas Glide İğne (Beckton Dickinson) ya da küçük bir bıçak ile bir neşter

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Kromozom montaj, ayrımcılık ve sitokinez gibi hücresel süreçleri, doğal olarak dinamik. Floresan etiketli muhabiri proteinler ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak canlı hücreler Time-lapse görüntüleme, inceleme için, aksi takdirde, sabit örnekleri 1,2 analiz anlaşılmaktadır bu dinamik olayların zamansal ilerleme sağlar. Ayrıca, hücresel süreçlerin gelişim düzenlemelere çalışma gelişimi sırasında sağlam bir organizma üzerinde zaman atlamalı deneylerini gerektirmektedir. Caenorhabiditis elegans embriyo, böylece 4,5 ve gelişimi 6-9 hücre biyolojisi sorular çalışmak için ideal bir deney modeli, ışık-şeffaf ve hızlı bir şekilde bilinen bir hücre ile 3 soyundan, değişmez bir gelişim programı C. elegans ileri genetik (rastgele mutagenez 10,11) ve belirli genlerin hedef ters genetik (RNAi-aracılı girişim dayalı ve hedeflenen mutagenez 12-15) genetik manipülasyon iyileştirilebilir. Buna ek olarak, transgenik hayvanlar kolayca, floresan tagged proteinleri veya gazetecilere 16,17 ifade etmek için oluşturulmuş olabilir . Bu özellikler, in vivo 18-21 temel hücresel ve gelişimsel süreçleri düzenleyen genetik yollar kolay tanıyabilmek için birleştirir . Bu protokolde C. canlı görüntüleme yöntemleri mevcut DIC optik veya GFP floresans bir bileşik epifluorescent mikroskop kullanarak elegans embriyolar. Biz genellikle sabit örnek görüntüleme için kullanılan hazır mikroskoplar, görüntüleme işlemi otomatikleştirmek için açık kaynak kodlu yazılım kullanarak zaman atlamalı analizi için de uygulanabilir olan kolaylığı göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software at JoVE.com

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo hücre biyolojisi ve geliştirme eğitimi için güçlü bir sistem. Biz canlı görüntüleme için bir protokol mevcut<em&gt; C. elegans</em&gt; Hazır epifluorescent mikroskoplar ve açık kaynak kodlu yazılım kullanarak DIC optik ya da floresan kullanan embriyolar.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.8K Görüntüleme.  University of Michigan.  C. elegans Embriyo hücre biyolojisi ve geliştirme eğitimi için güçlü bir sistem. Biz canlı görüntüleme için bir protokol mevcut C. elegans Hazır epifluorescent mikroskoplar ve açık kaynak kodlu yazılım kullanarak DIC optik ya da floresan kullanan embriyolar.

Video: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Kurul, Tuning ve Protein Görüntüleme için bir Apertureless Yakın Alan Kızılötesi Mikroskop Kullanımı

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.