This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは、胚性の伸びの初期および後期段階を特徴づけるために新たなメトリックを説明しました。 セクション1では、重要なステップは、パッド上の細菌の潜在的な存在です。胚は気密パッドと画像取得時のカバーガラスの間に封入されています。スライドを密閉する2時間以上持続取得中に動物の乾燥を避けるために必要とされます。我々の知る限りでは、スライドとカバーガラスの間にアガロースパッドを取り付けるために使用されるシーラーのいずれも通気性はありません。細菌（または胚）大量のパッド上に存在する場合その結果、それらは、それらの早期の死をもたらす、数時間後に酸素を奪われてもよいです。非伸長胚に比べて長さが3倍である胚に対応 - - 3倍の胚有するもの胚はtheiに移動を停止しますので、興味のある胚と一緒に記録することは、潜在的な低酸素状態の良い指標になります酸素の非存在下で卵殻をrは。形態学的測定は、低酸素状態にか死ん胚で行われるべきではありません。 タイムラプスイメージングを使用する別の重要なステップは、胚の発達が生じる温度です。感熱性の変異体は、現在、Cで使用されていますエレガンス 。温度変化の生物学的効果は、即時であるか、またはタンパク質の半減期とは、搬送突然変異の性質に応じて遅延してもよいです。したがって、胚が曝露される温度は、経時的に一定であるべきであり、顕微鏡ステージ上の顕微鏡検査室または加熱冷却室の適切な換気によって制御されるべきです。 第2節では、アルカリ性の次亜塩素酸処理を使用して、幼虫の同期に依存しています。特定の状況下では、この治療法は、胚性致死（EMB）につながる可能性があります。 重量人口の20％以上のEMBは、次亜塩素酸治療中に上昇した毒性を示唆していますマイナスの形態形成に影響を与える可能性がありメント。 重量背景に高いEMBを表示シンクロナイズドL1は、さらなる分析のために使用すべきではありません。この制限は、プロトコル3に適用されます。 私たちは、幼虫を固定化するために麻酔薬の使用をお勧めしません。特にレバミゾールは、実験的なバイアスを導入幼虫を縮小する傾向にある筋肉のテタニーの誘導を介して線虫を固定します。露光時間は、顕微鏡の制限の結果として、十分に迅速でない場合、我々は、パッド中のアガロース濃度を増加させ、パッドとカバーガラスとの間の液体の量を減少させることによって幼虫の運動性を減少させることをお勧めします。ケアは、乾燥が自分のサイズを小さくするので、幼虫を乾燥するためにはない、しかし、注意しなければなりません。 セクション3では、幼虫の長さの測定は、分析試料間の流量の比較を使用します。そうするために、制御粒子の分布は、コンパする必要があります赤。完全にオーバーレイ分布は、対応するサンプルに対して得られたTOF（飛行時間）の値を比較することができる場合ではない場合、これらの値を正規化する必要があります。 PAK-1（ok448）（ 図3C及び図5B）のために示すように、制御粒子-TOF（3.4.5.1に詳述されるように）オーバーサンプル-TOFの正規化が成功裡に使用されてきました。 重量対PAK-1（ok448）の相対的な長さを有するか、正規化せずに、少なくとも3つの独立した実験において同様であることが見出された（データは示さず）。しかし、私たちは、小さなサイズの違いで幼虫を比較する場合は特に、それなしで得られたものと正規化を用いて得られた結果を確認し、お勧めします。なお、この場合には、画像解析用として幼虫はなく、マイクロメートルでの絶対的な長さをWT、フローサイトメトリーを用いて、幼虫の長さの測定は、対照試料と長さを相対的に提供することに留意すべきです。これは、独立した実験からの測定ができないことを意味します重量の上にサイズ比を計算しない限り組み合わせること。 サンプルカップに希釈するために使用される緩衝液は、流速に影響を与えます。我々は、製造業者が推奨するシースバッファーが取得時に発生する泡の量を増大させる界面活性剤を含有することを観察しました。界面活性剤を含まない、M9緩衝液を使用して、有意に気泡の形成を減少させたが、試料の流速に影響するソーターの細管に卵の詰まりを回避するにはあまり効率的でした。卵詰まりを簡単に数秒間も上昇TOF-続いて、数秒のための制御粒子の観察可能なTOFの著しい減少により取得中に検出されます。卵の目詰まりは、チャネルの閉塞および粒子の流れ（毎秒未満、5オブジェクト）の完全な逮捕につながる可能性があります。これが発生した場合、流量が回復するまで、CLEANボタンをクリックします。これらのイベント中に発生した任意の測定sがデータ分析から除外されるべきです。シースバッファが死んだ卵率の高さによって特徴づけられる株を含む実験のために推奨されることがあります。 （ステップ3.2.3に設定）試料とシース圧力は、経時的に（わずかに）変わることがあり、非常に一定の流量を確保するために、実験を通して手動で調整されるべきです。結果を分析し、（ 図3C）は、時間の経過制御粒子のTOFSをプロットすると、低速度の低下または上昇が観察可能になります。流量の増加が逆になりながら、流量の減少は、経時的な粒子の平均TOFSの増加をもたらします。流量の変化は、負の幼虫の集団間の小さいサイズの違いを検出する方法の感度に影響を与えます。 伸びを制御する遺伝子を同定することを目的とタイムラプス顕微鏡記録を必要とする方法が一般的に高いですいくつかの遺伝子型を表現型検査時LY時間がかかり、面倒。フローサイトメーターベースのアプローチ、すべての研究室が利用できない機器を必要としながら、いくつかの株を特徴付けする必要が少ない時間がかかり、結果的に、より効率的です。 （変異体および重量 TOF分布を比較する学生のt検定によって評価; 図5AおよびB）。この方法は、画像解析を用いた測定に比べても、より統計学的に堅牢です。この方法は、次に低い表現性/浸透度で伸長欠陥を発現する株のために非常に適切であり得ます。 フローサイトメトリーを使用していくつかの方法は、線虫9-12の適合性を測定するために過去に開発されてきました。これらの方法は、96ウェルプレートに分注し動物やワームソーター」のリフレックスモジュールを使用しています。リフレックスモジュールは、96ウェルプレート内に分配線虫の人口の直接分析を可能にします。したがって、これらの方法は、characteすることができ一日あたりの条件の何百ものリゼと非同期人口の適応度を測定するで堅牢な方法を構成しています。それらは、しかしながら、よく同期さL1との間の小さいサイズの違いを識別するために適していません。 L1幼虫の間のわずかな差の測定は、96ウェルプレートのかつ効率的にウェルあたり最大で100個のオブジェクトを特徴付けることができる反射モジュールの使用と互換性がない多数の動物、全体の測定が必要です。ここに記載される方法が大幅に低減されたスループットを犠牲にして、この目的のために設計されています。これは、プロトコル2の画像解析を用いにわたって著しく改善され、機器が校正され、1時間に1回3〜4の条件の特徴付けを可能にします。 ヘッドとテール幅比の測定は、胚7の前後軸に沿って不均一に発生する形態形成のプロセスを特徴付けるために開発された最初の方法です。いつ初期の伸びを制御することが示された遺伝子に適用し、これらの方法は、その段階で形態形成を制御するシグナル伝達経路の空間的分布を明らかにする。画像解析または初期伸長の終了時に、胚の長さの測定値と組み合わせて、フローサイトメトリーのいずれかを使用して逮捕幼虫の長さの測定は、高い感度と精度の初期または後期伸長または両方を制御する遺伝子の同定を可能にします。これらの手順は、次にCで胚伸びを制御するシグナル伝達経路の空間的および時間的規制の将来の理解に大きく寄与することができますエレガンス 。さらに、これらのアプローチはまた、インスリンおよびTGF-βのような身体の長さを制御するシグナル伝達経路を研究するために適合させることができ、環境汚染物質15、13〜16、14および慢性暴露の経路。これらの測定は、異なる幼虫段階でまたはusin成人で行うことができL1におけるプロトコル2,3測定サイズの違いのグラム軽微な変更は、L3、L4幼虫や成虫などのより大きな物体よりもワームソーターと、より挑戦的です。プロトコル3は簡単にこれらの測定を行うように構成することができます。

その短いライフサイクル：ほぼ50年間、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）が開発、神経生物学、進化、宿主-病原体相互作用などで重要な問題を研究するための強力なモデルとしての地位を確立して1開発の研究では、このモデルの強さはです3日;これらの動物は、遺伝的に改変することができる容易さ。ほとんどが子宮外で生きている動物とその開発における細胞の変位と形態の観察を可能にするその透明。線虫の発達段階は、成人期に続いて、胚形成および4幼虫期（L4へL1）を伴います。胚発生時には、表皮の形態形成は、細胞が、彼らは彼らの接合部を再編成し、それらの個々の形態だけでなく、機能性上皮内での相対的位置を変更する方法を、グループとして移動する方法上皮のより良い理解を可能にする能力についてかなりの注目を集めました。表皮の形態形成は4段階に分かれています。背側表皮細胞の再編成からなる背インターカレーションは、皮下組織と呼ばれます。このように、上皮細胞単層における胚を包む腹側正中線に向かって腹側皮下細胞の遊走になる腹側筐体;初期および後期の伸び虫様幼虫に豆の形胚を変換します。以下の形態形成、胚のハッチとL1幼虫は、その直接の環境で利用可能な細菌を使用して供給し始めます。 胚性の伸びは、したがって、胚発生の後期です。これは、その長手方向軸に沿って胚の伸長と横直径の減少から成ります。これは、皮下細胞の形状の劇的な変更を伴います。伸びが初期および後期段階に分割されています。体壁の筋肉がワットで1.75倍の段階で、収縮開始時に初期の段階ではコンマ段階で開始し、終了しますILD型（wt）胚-非伸長胚と比較して、長さの1.75倍である胚に対応します。その段階で生じる形態形成のプロセスは、主に胚2の前後軸に沿ってその伸びを駆動皮下細胞の先端極に位置するフィラメント状アクチン束（FBS）の収縮によって駆動されます。政府短期の収縮は3キナーゼLET-502 / ROCK、MRCK-1とPAK-1 5によるミオシン軽鎖のリン酸化による制御です。体壁の筋肉が機能するようになると契約を起動したときに、伸びの後期相は、開始されます。これは、背側と腹側の皮下細胞に体壁の筋肉からメカノシグナリングを含み、動物が3を孵化たときに終了します。 伸び欠陥は、一般的に胚のように死んで動物の割合（胚致死性; EMB）を特徴とし、L1幼虫（幼虫逮捕表現型として、その発症を阻止するもの、左心室a）および重量よりも大幅に短くなる。発育停止の段階の同定は、死んだ胚の顕微鏡観察を必要とし、幼虫3-6を逮捕しました 。 最近、このようないくつかのCdc42 / RacのレギュレータとエフェクターPIX-1などの遺伝子、及びPAK-1は、両方の初期および後期伸び3,7の間に形態形成のプロセスを制御することが示されました。また、最近、形態形成のプロセスは早期に伸び、3〜7の間の胚の前後軸に沿って異なることを示しました。これらの知見は、特に初期の伸びの間にそれらの前後軸に沿った胚の形態の特徴付けを可能にする初期または後期の伸長段階およびその他のメトリックをターゲットに新たな評価指標の開発の動機。 これらの新規な方法は、それらの幅ならびに開始時および初期の伸長の終了時に、胚の長さを測定することからなる、彼広告や尾。7 2つのプロトコルはまた、L1ステージ7で同期、新たに孵化した幼虫の長さを測定するために開発されました。 幼虫、成虫および培養培地中に存在する細菌を処理することによって溶解させながら、胚の卵殻は、アルカリ性の次亜塩素酸処理に対してそれらを保護します。この処理は、次に、よく供給成人8の大部分を含む非同期集団から胚を精製するために使用されます。食事制限は、新たに孵化した幼虫を同期させるために使用されます。これらの幼虫の長さを測定し、次いで伸長欠陥を検出するために使用されます。孵化幼虫は、非完全に伸長した胚は、給紙時に「通常の長さ」に回復することができますが、食品の非存在下での逮捕時に彼らの小型化を維持するため、この測定は、培養プレート上で逮捕幼虫の測定よりも好ましいです。 ここでは、ルの測定を可能にする詳細なプロトコルを提示しますタイムラプスDIC顕微鏡と画像解析（プロトコル1）を使用して、胚だけでなく、自分の頭と尾の幅を長くするngth。我々はまた、画像解析（プロトコル2）およびフローサイトメトリー（プロトコル3）を使用して同期幼虫の長さを測定するための詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium Chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution&amp;nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>High fluorescent control particles</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, monobasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (magnesium sulfate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;( sodium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>SDB0487</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Drawing Gum 45&amp;nbsp;ml</td><td>p&amp;eacute;b&amp;eacute;o</td><td>PDG033000</td><td>any art/craft store</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics to characterize embryonic elongation of the nematode caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

頭部、Tail-およびヘッド/テール幅比は、堅牢なメトリックです。 ここで説明するプロトコルは成功し、RhoのGTPアーゼPIX-1のレギュレーターおよびエフェクターの機能を特徴づけるPAK-1とlet-502を早期に伸び7時にす ​​るために使用されている。グアニン交換因子のそれぞれがpix-1とPAK-1コード（GEF）とのRac / Cdc42のGTPアーゼのための特異的なエフェクターとlet-502 RHO-1 7用エフェクターのためのコードを。本研究では、PIX-1、PAK-1は、初期の伸び7中の表皮形態形成を制御することが示されました。メトリックとして本研究で用いたヘッドとテール幅測定は、初めての前方EMBに位置している皮下細胞を実証しますryoが、その後部7に位置するものとは異なる形態形成プログラムに従ってください。再現性及びこれらの指標の堅牢性を確立するために、ヘッド幅が1.2倍の段階で12野生型（wt）胚に独立して5回測定しました。測定5つの異なるグループ間の差異は、その後、（F-テストのp値は0.5&gt;; 図4A）の測定値の間で有意差を明らかにしていない（R統計パッケージを使用）ブラウン・フォーサイスのテストを用いて評価して比較したグループにその測定値を示唆しています胚の再現性があります。これらの測定値に関連付けられた再現性とバッチ効果の評価は、3つの異なる日（N = 12胚）で行わ4D-DICイメージングから1.2倍の段階で重量胚のヘッド幅を測定して行われました。これらの3つの測定グループ全体で、分散は有意差はなかったと有意なバッチの効果は、ヘッドワットに影響を与えることが見出されませんでしたIDTH測定結果（F検定p -値&gt; 0.5; 図4B）。 同様の結果は、テール幅測定のために、早期の伸びの異なる段階で行う測定のために得られた（データは示さず）。これらのデータは、初期の伸び欠陥を特徴づけるための堅牢な評価指標として、ヘッド幅、テール幅とヘッド/テール幅比を設立しました。 ヘッドとテール幅だけでなく、胚の長さを測定することは、胚の前後軸に沿って早期伸びを制御する遺伝子の解析を可能にします。 胚の長さ、ならびにそれらの頭と尾の幅の測定は、運搬重量と変異胚で行われた初期の伸びを制御する遺伝子のための機能対立遺伝子喪失の強いnullまたは感熱：PIX-1（gk416を）。PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）7。私たちは、ヘッド/テール（H / T）先頭の重量及び変異胚の幅の比（1.2倍段階）を測定し、非許容温度での初期の伸びの終わりに（ 図4Cは、左と右のパネルそれぞれ）。初期の伸びの初めに何change-はありませんでしたまたは減少し、H / T比は、PIX-1で観察された、PAK-1とlet-502変異体を重量動物（1.2倍段階、 図2C、左のパネルと比較した場合、一方で図4C;右パネル））、初期の伸びの終了時にす ​​べての3つの変異体は、 重量の胚よりも有意に高いH / T比（T検定のp -値&lt;0.006を示しました。これがpix-1、PAK-1とlet-502変異胚は、初期の伸びの終了時に異常前後の形態を示すことを実証しました。さらなる分析はbetweeヘッド幅とテール幅を比較しますnは1.2倍段階と早期延伸の終端、同じ測定パラメータを使用すると、ヘッド幅は、PIX-1で以下の減少であることを明らかにしたPAK-1とlet-502変異体をテール幅はLET-502変異体において有意に低い低減しつつ、 7のみ。 PIX-1とPAK-1制御形態形成のプロセスは、胚7の前部で主に発生している間これは、胚の前後軸に沿って同様にそのましょう-502コントロール形態形成過程を明らかにしました。初期の伸び（ 図4D）の先頭対終わりに胚の長さの差も測定しました。我々は、初期の伸びは著しく、PIX-1に減少したことがわかったPAK-1とlet-502変異体を単独でPIX-1で前方形態形成の変化を示唆している重量とPAK-1変異体と比較すると大幅にelongatioを減少させるのに十分です胚のn個。 プロトコル2および3は、WTおよび突然変異体バックグラウンドで逮捕幼虫の長さを評価しました。 （;未発表データプロトコル3）これらの幼虫の長さは、両方の画像解析（プロトコル2）7とフローサイトメトリーを用いて評価しました。堅牢で再現性の高い方法（ 図5A）にマイクロメートルで動物の長さの絶対的な測定値の画像解析結果を用いて、幼虫の長さの測定。この分析は、wt（ 図5A）と比較した場合、同期化変異体幼虫の表示が大幅に長さを減少させたことが明らかになった7。フローサイトメトリーベースのプロトコル（プロトコル3）を使用して、これらの幼虫の測定は、同等の結果（ 図5B）を得ました。しかし、後者のアプローチを使用して測定した幼虫の多くが大幅に遺伝子型の比較（Tの統計的ロバスト性を増加させることに留意すべきです-<html>検定p -値&lt;10 -24）。これらの知見に基づいて、フローサイトメトリーのアプローチは、非常に微妙な伸長欠陥を表示する変異動物を特徴づけるための画像解析上のより良い選択であり得ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig1.jpg" /> アガロースパッドの調製図。マスキングテープの二つの層で覆われた2スペーサスライドとの間に配置され、顕微鏡スライド。B、アガロースパッドは二つのスペーサースライドによってサポート別のスライドで覆われている。Cで切断した後、アガロースパッドの最終的な形状と大きさカバースリップに合わせてかみそりの刃。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> g2.jpg &quot;/&gt; 。図2.初期および後期伸び欠陥の測定 A - B、コンマ段階（A）での胚の長さの早期伸び（B）の終了時に測定。胚を測定するために使用される赤い線は、ImageJの。C、ヘッドとテール幅のセグメント化されたラインツールを使用して描画された1.2倍の段階で胚で測定された（左）と初期の伸び率（右）の終わりにされています。矢印は、測定領域（Martinらから変更。、2014）の局在を表します。スケールバー：20μmのD、幼虫の長さが同期L1-幼虫のために測定されます。右側のパネルは、撮影した画像（左）の拡大図です。赤い線は、ImageJののセグメント化されたラインツールを使用して描画しました。幼虫の長さを測定するために使用されます。スケールバー：100μmで<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> フローサイトメトリー。A、ゲーティングと緑と対照粒子の赤色発光を示すCOPAS Biosortのソートウィンドウを使用して同期幼虫の長さの図3.測定は 、（死者とその飛行時間型に関して生きている動物、TOFバブル）。B、代表的実験のために、異なる時点で制御粒子TOF。対時間TOFの線形関数の傾きは、対照粒子のTOF実験を通じて経時的に一定であることを示し、約10 -5である。C、制御粒子TOFSの分布は、分布の最大値のパーセンテージとして表しました。非正規化し、正規化制御粒子分布は、PAK-1（ok448）のために表されています。他のディストリビューションは、正規化されていない。D、生活のためTOFSの分布動物は分布の最大値のパーセンテージとして表しました。 TOFSが示されているようにPAK-1（ok448）を除く制御粒子上に正規化されていない。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig4.jpg" /> 図4. PIX-1、PAK-1 と しましょう-502 変異体を現在の初期の伸び欠陥。 - B、再現性及びヘッド幅測定のロバスト性評価A、1.2倍段（N = 12胚）で重量の胚のためのヘッド幅の5つの独立した測定値。平均と標準偏差（エラーバー）が示されています。測定値の間に有意でない（ナノ秒）の違いは、ブラウン・フォーサイステスト（私たちを使用して計算しました。ING R統計パッケージ）（F検定p値 &gt; 0.5）。B、三つの異なる日（N = 12胚での重量の胚のためのヘッド幅測定）。平均と標準偏差も同様に示されています。測定全体の分散に有意差はなかった（nsのは、ブラウン・フォーサイスF検定のp値 &gt; 0.5）C、ヘッド/テール幅比の分布早期の終了時に1.2倍の段階（左パネル）、で。 重量での伸び率（右パネル）、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）変異体23で- 24°C。間のこの研究のために使用させて-502ts胚の母親は25.5°C。D、 重量で伸び、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）の分布で増殖させたことに注意してくださいとlet-502（sb118ts）変異体コンマステージと後期の伸びの開始。ボックスプロットは最小値、最大値、25 番目 、50 番目 （中央値）と75を表します集団の番目のパーセンタイル。 * トン検定のp -値&lt;0.05、** トン検定のp -値&lt;0.006（Martinらから変更。、2014）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig5.jpg" /> 図5. PIX-1（gk416）、朴-1（ok448） とL ら-502（sb118ts） 幼虫現在の長さの欠陥。 重量で測定された幼虫の、長さ、PIX-1（gk416）、PAK-1（ok448）とlet-502（sb118ts）動物は、画像解析（プロトコル2）。B、フローサイトメーターを用いて測定した相対的な幼虫の長さを（使用して測定しますプロトコール3）。括弧内の数字は目のために使用される動物の数に対応します電子計測。長さと平均の標準誤差の手段（SEM;エラーバー）が表されています。 p値検定スチューデントのtは 。（p）が示され<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

6.0K ビュー.  Université du Québec à Montréal. Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo. 

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C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegansの追跡と行動計測

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

神経科学

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

カエノラブディティス・エレガンスにおける胚の生存率とひなサイズの測定

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

遺伝学

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

発生生物学

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いた カエノラブディティス・エレガンス 胚発生の解明

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

生物学

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Lifespan Analysis: Measuring C. elegans Longevity

Source: Cornwell, A. B., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57819/the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively">The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure&#160;Caenorhabditis elegans&#160;Lifespan</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2018).
This video describes a traditional, plate-based method of measuring the lifespan of C. elegans. The example protocol measures the lifespan of worms treated with RNAi.

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、

要約

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この動画の章

C. elegansの追跡と行動計測

カエノラブディティス・エレガンスにおける胚の生存率とひなサイズの測定

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いたカエノラブディティス・エレガンス胚発生の解明

イメージング C.エレガンス胚

基本的な

の発達過程を追跡し、定量化

寿命分析:C.エレガンスの寿命の測定

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、

要約

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C. elegansの追跡と行動計測

カエノラブディティス・エレガンスにおける胚の生存率とひなサイズの測定

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いた カエノラブディティス・エレガンス 胚発生の解明

イメージング C.エレガンス胚

基本的な

の発達過程を追跡し、定量化

寿命分析:C.エレガンスの寿命の測定

4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いたカエノラブディティス・エレガンス胚発生の解明