This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li><li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+morphogenesis:+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo.">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis.">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li><li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502/ROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis.">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li><li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation:+LET-502/ROCK,+MRCK-1+and+PAK-1,+three+kinases+with+different+roles.">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li><li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase,+MEL-11+myosin+phosphatase,+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase.">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li><li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans.">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684 (2014).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods. , 587-606 (1988).</li><li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform,+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains.">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li><li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry.">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li><li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function.">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).</li><li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness.">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li><li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin/IGF-1+signal.">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular &amp; cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li><li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size.">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43 (2014).</li><li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li><li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

פרוטוקול זה מתאר מדדי רומן לאפיין מוקדם שלבים מאוחר של התארכות עוברית. בסעיף 1, השלב הקריטי הוא הימצאות אפשרית של חיידקים על כן השיגור. העוברים מוקפים הרמטית בין המשטח ואת coverslip במהלך רכישת תמונה. איטום המגלשה נדרש להימנע התייבשות של חיות במהלך הרכישה שנמשך יותר משעתיים. למיטב ידיעתנו, אף אחד האיטום לשמש לעלות רפידות agarose בין שקופיות coverslip הם אוויר-חדיר. כתוצאה מכך, כאשר כמות גדולה של חיידקים (או עוברי) נמצאת על המשטח, הם עשויים להיות משולל חמצן אחרי כמה שעות המובילות למוות בטרם העת. לאחר עובר פי שלושה - מתאים עובר כי הם פי 3 באורך לעומת עוברים שאינם מוארכים - רשם יחד עם עוברי עניין יהיה אינדיקטור טוב של תנאי חוסר חמצן פוטנציאל, שכן עובר אלה יפסיקו לנוע theiקליפות ביצים r בהיעדר חמצן. אין מדידות מורפולוגיים צריכים להיעשות על תנאי חוסר חמצן או על עוברים מתים. עוד צעד קריטי בעת שימוש זמן לשגות הדמיה היא הטמפרטורה שבה התפתחות העובר מתרחשת. מוטציות Thermosensitive משמשות כיום ב C. elegans. ההשפעה הביולוגית של משמרת הטמפרטורה עשויה להיות מיידית או מושהית תלוי מחצית החיים של החלבון ואת אופי המוטציה שלו נושאת. כתוצאה מכך, הטמפרטורה שבה עובר חשופה צריכה להיות קבועה לאורך זמן וצריכה להיות נשלטה על ידי אוורור הנכון של חדר מיקרוסקופ או תא חימום-קירור על במת מיקרוסקופ. סעיף 2 תלוי סנכרון זחלים באמצעות טיפול תת-כלורי אלקליין. בנסיבות מסוימות, טיפול זה עלול להוביל הקטלניות עובריות (EMB). Emb מעל 20% באוכלוסייה WT מרמז על רעילות גבוהות במהלך פינוק תת-כלוריment העשויים להשפיע morphogenesis שלילי. L1 מסונכרן מוצגות Emb גבוהה ברקע WT לא אמור לשמש לניתוח נוסף. הגבלה זו חלה גם על פרוטוקול 3. אנחנו לא ממליצים על השימוש בתרופות הרדמה כדי לשתק זחלים. Levamisol בפרט, שמגביל נמטודות באמצעות אינדוקציה של tetany שריר שנוטה להתכווץ הזחלים המטים ניסיון. אם זמן חשיפה הוא לא מהיר מספיק כתוצאת המגבלות של המיקרוסקופ, אנו ממליצים להקטין את תנועתיות של זחלים על ידי הגדלת הריכוז של agarose בפנקס והפחתת כמות הנוזל בין המשטח ואת coverslip. יש להקפיד עם זאת, לא כדי לייבש את הזחלים, מאז התייבשות תפחית גודלם. בסעיף 3, מדידת אורך הזחלים בשימוש השוואה של ספיקות בין דגימות נותחו. לשם כך, חלוקת חלקיקי שליטה צריכה להיות compaאָדוֹם. אם הפצות כיסוי במלואה, TOF (זמן של טיסה) ערכים שהתקבלו עבור דגימות מתאימות ניתן להשוות, אם לא, ערכים אלה צריכים להיות מנורמלים. נורמליזציה של המדגם-TOF מעל חלקיקים-TOF מלא (כמפורט 3.4.5.1) שמשה בהצלחה כמוצגת עבור פאק-1 (ok448) (איור 3 ג ו איור 5). אורך יחסית של פאק-1 (ok448) לעומת WT נמצא דומה לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים עם או בלי נורמליזציה (מידע לא מוצג). עם זאת, אנו ממליצים, המאשרים את התוצאות שהושגו עם נורמליזציה עם אלו המתקבלות בלעדיו, במיוחד כאשר משווים זחלים עם הבדלים קטנים. יצוין כי מדידת אורך הזחלים באמצעות-cytometry זרימה מספקת ביחס אורך למדגם שליטה, במקרה זה, WT הזחלים ולא אורך מוחלט מיקרומטר כמו לניתוח תמונה. משמעות הדבר הוא כי מדידות מניסויים עצמאיים לא יכולותלהיות משולב אלא חישוב יחס גודל מעל WT. המאגר המשמש דילול בגביע המדגם יהיה השפעה על קצב הזרימה. הבחנו כי למאגר הנדן בהתאם להמלצת היצרן מכיל דטרגנט כי מגדיל את כמות בועות שנוצרו במהלך רכישה. באמצעות חיץ M9, אשר אינו מכיל חומרי ניקוי, הפחית משמעותית את היווצרות של בועות אבל היה פחות יעיל הימנעות חיבור של הביצים tubules של סדרן, אשר משפיע על קצב הזרימה של דגימות. פקיקת ביצה מזוהית בקלות במהלך הרכישה על ידי ירידה ניכרת של TOF הנצפה של חלקיקים מלאים במשך כמה שניות ואחריו TOF- גבוהה גם במשך כמה שניות. פקיקת ביצה עשויה גם להוביל את החסימה של הערוץ ואת מעצרו המלא של זרימת החלקיקים (פחות מ -5 חפצים לשנייה). אם זה אמור להתרחש, לחץ על כפתור CLEAN עד קצב זרימה משוחזר. כל המדידות המתרחשים במהלך האירוע אלההים יש נכלל בניתוח הנתונים. חיץ נדן עשוי להיות מומלץ עבור ניסויים מעורבי זנים מאופיינים בשיעורים גבוהים של ביצים מתות. לחץ מדגם הנדן (נקבע על הצעד 3.2.3), עשוי לשנות (מעט) לאורך זמן צריך להיות מותאם באופן ידני לאורך הניסוי כדי להבטיח קצב זרימה מאוד מתמיד. הפחתה או הגדלת השיעור הנמוך תהיה נצפה כאשר מנתחים את התוצאות התוויית TOFs של חלקיקים שליטים על הזמן (איור 3 ג). הפחתת קצב הזרימה תגרום לעלייה של TOFs הממוצע של חלקיקים לאורך זמן, תוך גידול של קצב הזרימה יגרום ההפך. שינוי של קצב הזרימה לא ישפיע באופן שלילי את הרגישות של השיטה באיתור ההבדלים בגודל קטן בין אוכלוסיות של הזחלים. שיטות במטרה לזהות גני שליטת התארכות מחייב הקלטת מיקרוסקופיה הזמן לשגות הן בדרך כלל גבוהותly זמן רב ומייגע כאשר phenotyping מספר גנוטיפים. גישת הזרימה המבוססת-cytometer, תוך הדורשים ציוד אינו זמין לכל המעבדות, היא פחות זמן רב ועל כן יעיל יותר כאשר מספר זנים צריכים להתאפיין. שיטה זו היא גם יותר סטטיסטי חזקה לעומת מדידות באמצעות ניתוח תמונה (מוערך על ידי מבחן טי של תלמיד השוואה של התפלגויות מוטציה ו WT TOF; איור 5 א &#39;וב&#39;). שיטה זו עשויה להיות אז מתאימה במיוחד עבור זני המבטאים פגמי התארכות עם האקספרסיביות / חדירות נמוכות. מספר שיטות באמצעות-cytometry זרימה פותחו בעבר למדידת כושר של נמטודות 9-12. שיטות אלה להשתמש חיות לוותר בתוך 96-גם צלחות ואת מודול רפלקס של סדרן התולעת &quot;. מודול רפלקס מאפשר ניתוח ישיר של האוכלוסייה נמטודות לוותר בתוך 96-גם הצלחות. כתוצאה מכך, שיטות אלה מסוגלים characteRize מאה תנאים ליום ומהווה באופן חזק בם כדי למדוד את הכושר של אוכלוסייה הלא מסונכרן. עם זאת, הן לא מותאמות היטב כדי לזהות הבדלים קטנים בין L1 המסונכרן. מדידת הבדלים קטנים בין הזחלים L1 דורש למדוד על פני מספר רב של בעלי חיים, אשר אינה עולה בקנה אחד עם השימוש צלחות 96-היטב של מודול רפלקס שעשויים לאפיין 100 אובייקטים ביעילות לכל היותר לכל טוב. השיטה המתוארת כאן נועדה למטרה זו על חשבון התפוקה, אשר מצטמצמת משמעותית. היא מאפשרת אפיון של 3 עד 4 תנאים לשעה פעם המכשיר מכויל, וזה שיפור ניכר לעומת באמצעות ניתוח תמונה בפרוטוקול 2. מדידת יחס רוחב הראש והזנב היא השיטה הראשונה אשר פותחה כדי לאפיין תהליכי morphogenic המתרחשים באופן לא אחיד לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 7. מתילהחיל גנים הראו לשלוט התארכות מוקדם, שיטות אלה יבהירו את הפריסה המרחבית של מסלולי איתות שליטה morphogenesis בשלב זה. מדידת אורך הזחלים נעצרו או באמצעות ניתוח תמונה או cytometry זרימה בשילוב עם מדידת האורך עובר בסוף ההתארכות מוקדם תאפשר זיהוי של גני השליטה או מוקדם או מאוחר התארכות או שניהם עם רגישות ודיוק גבוהים. הליכים אלה עשויים אז לתרום משמעותיים להבנת עתיד של הרגולציה במרחב ובזמן של מסלולי איתות שליטת התארכות עוברית ב C. elegans. יתר על כן, גישות אלה ניתן להתאים גם ללמוד מסלולי איתות השליטה אורך הגוף כגון אינסולין TGF-beta מסלולים 13, 14 וכרוני חשיפה מזהמים סביבתיים 15, 16. ניתן לעשות מדידות אלה בשלבי זחל שונים או אצל מבוגרים מנצליםg שינויים קלים של פרוטוקולים 2 ו -3 הבדלים בגודל מדידה ב L1 הם יותר מאתגר עם סדרן התולעת מאשר עצמים גדולים כגון L3, זחלים או מבוגרי L4. פרוטוקול 3 אז ניתן להתאים בקלות לעשות מדידות אלה.

במשך כמעט 50 שנים elegans Caenorhabditis נמטודות ביססה את עצמה כמודל רב עוצמה כדי לחקור שאלות חשובות בפיתוח, נוירוביולוגיה, אבולוציה, אינטראקציות הפתוגן המארח, וכו &#39;1 עוצמת המודל הזה בחקר התפתחות טמון: מחזור החיים הקצר שלה של 3 ימים; הקלות שבה החיות האלה ניתן לשנות גנטיות; השקיפות שלה המאפשר התצפית של עקירת תא ומורפולוגיה בחיות חיים והתפתחותה כי הוא בעיקר רחמית נוספת. שלבי ההתפתחות של נמטודות לערב עובר וארבעה שלבי זחל (L1 כדי L4), ואחריו לבגרות. במהלך התפתחות עוברית, morphogenesis אפידרמיס משך תשומת לב רבה ביכולתה לאפשר הבנה טובה יותר של איך אפיתל תאי נודדים כקבוצה, איך הוא מחדש צומת שלהם ולשנות המורפולוגיה האישית שלהם, כמו גם המיקום היחסי שלהם בתוך האפיתל פונקציונלי.morphogenesis עוריות מחולק לארבעה שלבים: עיבור הגבה מורכב בארגון מחדש של תאי אפידרמיס הגבה, המכונה hypodermis; מתחם גחון, מורכב נדידת תאי hypodermal גחון כלפי קו אמצע הגחון ובכך עוטף את העובר בתוך monolayer תא אפיתל; מוקדם התארכות מאוחר הפיכה העובר בצורת השעועית לתוך זחלים דמויים תולעת. בעקבות morphogenesis, צוהר עובר וזחלי L1 להתחיל להאכיל באמצעות חיידקים זמינים בסביבה המיידית שלהם. ההתארכות עוברית היא אפוא שלב מאוחר של ההתפתחות העוברית. הוא מורכב ההארכה העובר לאורך ציריו אורך הפחתה של הקוטר הרוחבי שלה. זה כרוך שינוי דרמטי של צורת התאים hypodermal. ההתארכות מחולקת צעיר ושלב מאוחר. השלב מוקדם מתחיל בשלב פסיק ומסתיים כאשר השרירים-קיר הגוף מתחיל לחלות בשלב 1.75 של פי wהכשרת הישוב מסוג (WT) עוברים - המתאים עוברים כי הם 1.75 פי אורך לעומת עוברים שאינם מוארך. תהליכים המתרחשים morphogenic בשלב זה מונעים בעיקר על ידי התכווצות של חבילות אקטין פילמנטיות (FBS) ממוקם בקוטב הפסגה של תאי hypodermal שמניעים התארכות שלהם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 2. התכווצות של FBS היא שליטה על ידי זרחון של שרשרות אור שרירן ידי שלוש קינאזות LET-502 / ROCK, MRCK-1 ו- PAK-1 5. השלב המאוחר של ההתארכות, מתחיל כאשר שרירי גוף לקיר להיות פונקציונליים ולהתחיל קבלנות. היא כרוכה איתות mechanotransduction מהשרירים-קיר הגוף אל hypodermal הגב ועל הגחון תאים ומסתיימת כאשר חיות לבקוע 3. פגמי התארכות מאופיינים לרוב אחוז בעלי החיים מתים כמו עוברי (הקטלני עוברי; Emb) ואלה התפתחותם מעצר כזחלי L1 (פנוטיפ מעצר זחל; Lvא) ולהיות קצרים משמעותי מאשר WT. זיהוי של השלב של מעצר התפתחותי דורש תצפית מיקרוסקופית של עוברים מתים ועוצר זחלי 3-6. היא הוצגה לאחרונה כי מספר גנים, כגון רגולטור Cdc42 / Rac ו Pix-1 המפעיל ו פאק-1, לשלוט בתהליכי morphogenic במהלך שני מוקדמת ומאוחר התארכות 3,7. הראנו גם לאחרונה שתהליכים morphogenic שונים לאורך ציר אנטרו-האחורי של העוברים במהלך התארכות מוקדם 3 7. ממצאים אלה הניעו את הפיתוח של מדדי רומן מיקוד בשלבי התארכות מוקדם או מאוחר במיוחד ומדדים אחרים, המאפשרים אפיון של המורפולוגיה של עובר לאורך ציר אנטרו-האחורי שלהם במהלך ההתארכות מוקדם. שיטות חדשניות אלה מורכבות במדידת האורך של עובר בתחילה ובסוף של התארכות מוקדם וכן את הרוחב שלהם הןמודעות וזנבות. 7 שני פרוטוקולים פותחו גם למדוד את אורך הזחלים שבקעו זה עתה, מסונכרן ב L1 בשלב 7. קליפות הביצים של עובר להגן עליהם מפני טיפול תת-כלורי אלקליין בעוד זחלים, מבוגרים חיידקים נוכחיים בתקשורת התרבות, נמוגים ידי הטיפול. טיפול זה משמש אז כדי לטהר עובר מתוך אוכלוסייה הלא מסונכרן המכילה מרבית מבוגרים הניזונים גם 8. הגבלת מזון משמשת לסנכרן זחלים שבקעו זה עתה. מדידת אורך הזחלים אלה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות פגמי התארכות. מדידה זו עדיפה על פני מדידת זחלים נעצרו על צלחות התרבית כי זחלים בוקעים מן הלא-לגמרי עוברים מוארכים יכולים להתאושש כדי &quot;אורך נורמלי&quot; כאשר האכלה אך ישמרו בגודל המוקטן שלהם כאשר נעצרו בהיעדר מזון. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה של length של מתארך עובר כמו גם את רוחב הראש שלהם וזנב באמצעות זמן לשגות דסק&quot;ש מיקרוסקופיה וניתוח תמונה (פרוטוקול 1). כמו כן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי למדוד את אורך זחלים מסונכרנים באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2) ושפל-Cytometry (פרוטוקול 3).

<table><tbody><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (Calcium Chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution&amp;nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>High fluorescent control particles</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (potassium phosphate, monobasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (magnesium sulfate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;( sodium phosphate, dibasic)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>SDB0487</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo Drawing Gum 45&amp;nbsp;ml</td><td>p&amp;eacute;b&amp;eacute;o</td><td>PDG033000</td><td>any art/craft store</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics to characterize embryonic elongation of the nematode caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

הראש, זנב והראש / יחס רוחב זנב הם מדדים חזקים. הפרוטוקולים המתואר כאן שימשו בהצלחה כדי לאפיין את הפונקציה של הרגולטורים ומפעילים של Pix-1 GTPases Rho, פאק-1 ולתת-502 במהלך התארכות מוקדם 7. Pix-1 וקוד פאק-1 בהתאמה עבור גורם גואנין-החליפין (GEF) וכן מפעיל ספציפי עבור Rac / Cdc42 GTPases ולתת-502 קודים עבור מפעיל עבור RHO-1 7. במחקר זה, Pix-1 ו פאק-1 הוצגו לשלוט morphogenesis אפידרמיס במהלך התארכות מוקדם 7. במחקר זה נעשה שימוש למדידת ראש וזנב רוחב בתור מדדים להפגין בפעם הראשונה, כי תאי hypodermal ממוקמים EMB הקדמיryo אחרי תוכניות morphogenic שונות מאלו ממוקמים האחוריים שלה 7. כדי להקים את השחזור וחוסנם של מדדים אלה, רוחב הראש נמדד באופן עצמאי חמש פעמים ב -12 wild-type (WT) עובר בשלב 1.2 פי. שונויות בין חמש הקבוצות השונות של מדידה הושוו העריך אז באמצעות מבחן בראון-פורסייט (באמצעות חבילת סטטיסטי R) חושף כי אין הבדלים משמעותיים בין המדידות (F- מבחן ערכי p-&gt; 0.5; איור 4 א) טוען כי מדידות עבור קבוצה עוברים הם לשחזור. הערכת ההשפעות שחזור יצוו קשורות למדידות אלה נעשתה באמצעות מדידה של רוחב הראש עובר WT בשלב 1.2 פי מהדמית 4D-DIC נעשתה בשלושה ימים שונים (n = 12 עובר). מעבר לשלוש קבוצות מדידה אלה, השונים לא היה שונה משמעותיים ללא תופעות יצוו משמעותיות נמצאו להשפיע על ראש-wתוצאות המדידה idth (F-מבחן p -Value&gt; 0.5; איור 4). תוצאות דומות התקבלו למדידות רוחב זנב למדידות נעשו בשלבים שונים של התארכות מוקדם (מידע לא מוצג). נתונים אלה מבוססים רוחב ראש, זנב-רוחב וראש / יחס רוחב זנב כמו מדדים חזקים לאפיין פגמי התארכות מוקדם. מדידת ראש ורוחב זנב כמו גם אורך של העוברים מאפשר אפיון הגנים המעורבים בבקרת התארכות מוקדם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר. מדידת אורך של העוברים, כמו גם את רוחב הראש והזנב שלהם נעשה על עוברי WT ו מוטנטים נושאת null או חזק thermosensitive הפסד של אללים פונקציה בגנים השולטים התארכות מוקדם: PIX-1 (gk416);פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) 7. מדדנו את הראש / זנב (H / T) יחס רוחב של עוברים WT ו מוטציה בהתחלה (1.2 פי הבמה) ובסוף של התארכות מוקדם בטמפרטורות אוֹסְרָנִי (איור 4C שמאלה הפאנל הימני בהתאמה). בעוד בתחילת ההתארכות הראשונה לא היה כל שינויים ארגוניים או H מופחת / יחס T נצפה Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בהשוואת חיות WT (שלב 1.2 פי, איור 2C, פנל משמאל ,) בסוף התארכות מוקדם שלושה כל מוטנטים הראו יחס H / T גבוה באופן משמעותי מאשר עוברים WT (t -test p -values ​​&lt;0.006; 4C איור; פאנל מימין). זה הוכיח כי Pix-1, פאק-1 ולתת-502 עובר מוטציה להציג מורפולוגיה אנטרו-אחורי נורמלית בסוף ההתארכות מוקדם. ניתוח נוסף השוואת ראש רוחב זנב רוחב between בשלב 1.2 פי וסוף התארכות מוקדם, תוך שימוש באותה פרמטרי מידות חשף כי רוחב הראש פחות מצטמצם ב Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בעוד רוחב הזנב מפחית באופן משמעותי פחות מוטנטים let-502 רק 7. זה גילה שמאפשר-502 בקרות תהליכי morphogenic דומה לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר, ואילו Pix-1 ו פאק-1 תהליכי morphogenic מלאים המתרחשים בעיקר בחלק הקדמי של העובר 7. ההבדל אורך בין עוברים בסוף לעומת תחילת התארכות מוקדם (איור 4D) נמדדה גם. מצאנו התארכות מוקדם כי צומצם משמעותית ב Pix-1, פאק-1 ולתת-502 מוטציות בהשוואה WT מציע שינוי של המורפוגנזה הקדמי Pix-1 ו פאק-1 מוטנטים בלבד מספיקה כדי לצמצם את elongatio משמעותיתn של העובר. פרוטוקול 2 ו -3 שימשו להעריך את אורך הזחלים נעצר רקע WT ו מוטציה. אורכו של הזחלים הללו הוערך באמצעות שני ניתוח התמונה (פרוטוקול 2) 7 ו זרימת cytometry (פרוטוקול 3; נתונים שלא פורסמו). מדידות של אורך זחלים באמצעות תוצאות ניתוח תמונה במדידות מוחלטות של האורך &#39;החיות מיקרומטרים בתוך (איור 5 א) באופן חזק מאוד לשחזור. ניתוח זה חשף כי תצוגת זחלי מוטציה מסונכרנת מופחת אורך באופן משמעותי בהשוואת WT (איור 5 א) 7. מדידה של הזחלים הללו באמצעות פרוטוקול מבוסס-cytometry זרימה (פרוטוקול 3) נתן תוצאות דומות (איור 5). עם זאת, יש לציין כי מספר הרב של זחלים, הנמדד על פי הגישה השנייה גדילה משמעותית את החוסן הסטטיסטי של השוואת גנוטיפ (t -<html> מבחן p -values ​​&lt;10 -24). בהתבסס על ממצאים אלה, גישת הזרימה cytometry עשויה להיות בחירה טובה יותר על ניתוח תמונה כדי לאפיין חיות מוטנטים מוצגות פגמי התארכות עדינים מאוד. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig1.jpg" /> איור 1. הכנת כרית agarose. A, שקופיות מיקרוסקופ ממוקם בין שני מכוסה spacer-שקופיות על ידי שתי שכבות של נייר דבק. B, משטח agarose מכוסה מפולת בוץ נוספת בתמיכת שתי מגלשות spacer. C, צורה וגודל הסופי של כרית agarose לאחר חיתוך עם סכין גילוח כדי להתאים coverslip. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> g2.jpg &quot;/&gt; . איור 2. מדידה מוקדם ופגמי התארכות מאוחרים A - B, מדידת האורך של עובר פסיק במה (א) ו בסוף ההתארכות מוקדם (B). הקו האדום, המשמש למדידת עבר צויר באמצעות כלי השורה המפולח של ImageJ. C, ראש ורוחב זנב נמדד עובר בשלב 1.2 פי (משמאל) בסוף ההתארכות מוקדם (מימין). חצים מייצגים את הלוקליזציה של אזורים הנמדדים (שונים מ- Martin et al., 2014). סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר D, אורך של זחלים נמדד עבור L1-זחלים מסונכרנים. פנל ימני הוא תצוגה מוגדלת של התמונה שצולמה (משמאל). הקו האדום נמשך באמצעות כלי השורה המפולח של ImageJ. הוא משמש כדי למדוד את האורך של הזחל. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig3.jpg" /> מדידת איור 3. של האורך של זחלים מסונכרנים באמצעות זרימת cytometry. A, Gating וחלון מיון של COPAS Biosort מראה ירוק ופליטה אדומה של חלקיקים שליטים, בועות, חי למת חיות ביחס לזמן של הטיסה שלהם (TOF ). ב, TOF של חלקיקים שליטים בנקודות זמן שונות עבור ניסוי נציג. השיפוע של הפונקציה ליניארית של TOF לעומת הזמן הוא סביב 10 -5, המציין כי TOF של חלקיקי שליטה הוא קבוע לאורך זמן לאורך הניסוי. C, חלוקת TOFs חלקיקים המלא המבוטאים באחוזים של ערך המקסימאלי של הפצות. הפצות חלקיקי שליטה הלא מנורמלות המנורמלות מיוצגות עבור פאק-1 (ok448). הפצות אחרות הן לא מנורמלות. D, חלוקת TOFs לחייםחיות מבוטאות באחוזים של הערך המקסימאלי של ההפצות. TOFs אינו מנורמל על חלקיקים מלאים למעט פאק-1 (ok448) כפי שצוין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig4.jpg" /> איור 4. Pix-1, פאק-1 and Let-502 מוטאנטים הווה פגמים התארכות הקדומה. A - B, הערכה שחזור וחוסנם של ראש ממידות הרוחב א &#39;, חמש מדידות בלתי תלויות של רוחב הראש מהפריה WT בשלב 1.2 פי (n = 12 עוברים).. ממוצעים וסטיות תקן (ברי שגיאה) מסומנים. הבדלים משמעותיים (NS) ללא בין מדידות חושבו בעזרת מבחן בראון-פורסייט (לנוing R חבילה סטטיסטית) (F-מבחן p-value&gt; 0.5). B, מדידת רוחב ראש מהפרית WT בשלושה בימים שונים (n = 12 עובר). ממוצעים וסטיות תקן מסומנים וכן; לא נמצא הבדל משמעותי השונות ברחבי מדידות (ns; בראון-פורסייט F-מבחן ערכי p-&gt; 0.5) C, הפצות של יחס רוחב ראש / זנב בשלב 1.2 פי (פאנל משמאל), בסוף מוקדם. התארכות (פאנל מימין) ב WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) מוטציות ב 23 - 24 ° C. הערה על כך שאמהות עוברים לתת-502ts נעשה שימוש במחקר זה גדלו ב 25.5 מעלות צלזיוס. D, הפצה של התארכות ב WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) מוטנטים בין בשלב פסיק ואת תחילת התארכות מאוחר. תיבת-חלקות לייצג את דקות, מקסימום, 25 th, 50 ה (חציון) ו -75עשירונים ה של האוכלוסיות. * T -test p -Value &lt;0.05, ** t -test p -Value &lt;0.006 (שונה מ- Martin et al., 2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig5.jpg" /> איור 5. Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ו- L et-502 (sb118ts) פגמים אורך הווה הזחלים. A, אורך של הזחלים נמדד WT, Pix-1 (gk416), פאק-1 (ok448) ולתת-502 (sb118ts) חיות נמדד באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2). B, אורך הזחלים יחסית למדוד באמצעות-cytometer זרימה ( פרוטוקול 3). מספרים בסוגריים מתאימים את מספר בעלי החיים המשמש המדידות דואר. אמצעי אורכים ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM; ברי שגיאה) מיוצג. T של סטודנט -test ערכי p- מסומן (p). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53712/53712fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

6.0K Views.  Université du Québec à Montréal. Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo. 

Video: Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Genetics

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Developmental Biology

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Lifespan Analysis: Measuring C. elegans Longevity

Source: Cornwell, A. B., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57819/the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively">The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure&#160;Caenorhabditis elegans&#160;Lifespan</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2018).
This video describes a traditional, plate-based method of measuring the lifespan of C. elegans. The example protocol measures the lifespan of worms treated with RNAi.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video