Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Trombosit metabolizması, özellikle kanama ve trombotik bozukluklarda trombosit hiper ve hipoaktivitesinin rolü ile ilgili olduğu için ilgi çekicidir. Bazı metabolik tahliller için trombositlerin plazmadan izole edilmesi gereklidir; Burada sunulan, yıkanmış trombositlerden hücre içi metabolitlerin izole edilmesi için bir yöntemdir.

Trombositler, hemostaz ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde ayrılmaz bir rol oynayan kan hücreleridir. Trombosit hiper ve hipoaktivitesi metabolik bozukluklarda rol oynamakta ve hem tromboz hem de kanama riskini artırmaktadır. Trombosit aktivasyonu ve metabolizması, birincisini ölçmek için çok sayıda yöntemle, ancak ikincisi için nispeten az sayıda yöntemle sıkı bir şekilde bağlantılıdır. Diğer kan hücrelerinin ve plazma bileşenlerinin müdahalesi olmadan trombosit metabolizmasını incelemek için, trombositlerin kesilme hassasiyeti ve geri dönüşümsüz olarak aktive olma yeteneği nedeniyle önemsiz olmayan bir süreç olan trombositlerin izole edilmesi gerekir. Burada, trombosit agonistleri tarafından stimülasyona duyarlı hareketsiz trombositler üreten trombosit izolasyonu (yıkama) için bir protokol sunulmaktadır. Ardışık santrifüjleme adımları, trombositleri tam kandan izole etmek ve kontrollü, izozmotik bir tamponda yeniden süspanse etmek için trombosit inhibitörlerinin eklenmesiyle kullanılır. Bu yöntem, granül sekresyonu ve integrin aktivitesi belirteçleri ile ölçüldüğü gibi, düşük aktivasyon ile tam kandan trombositlerin %30-40 oranında geri kazanımını tekrarlanabilir bir şekilde üretir. Trombosit sayısı ve yakıt konsantrasyonu, kullanıcının çeşitli metabolik durumları araştırmasına izin vermek için hassas bir şekilde kontrol edilebilir.

Trombositler küçüktür (2-4 μm çapında), hemostazda önemli bir rol oynayan anükleat hücreleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş pıhtı oluşumu süreci¹. Vasküler bütünlük için hayati önem taşırken, trombositler de olumsuz sağlık olaylarında rol oynar. Trombositler, kan damarlarını tıkayan ve lokal olarak kan akışının azalmasına neden olan pıhtılar olan derin ven trombozu (DVT) ve arteriyel trombozda (AT) rol oynar veya pıhtı parçaları koparsa (embolize), akciğerlere, kalbe veya beyne kan akışını engelleyebilirler 2,3,4,5,6,7 . Trombosit hiperreaktivitesi, hipertansiyon, diyabet ve kanserin bir komorbiditesidir ve DVT ve AT insidansının artmasına neden olur ^8,9,10. Trombosit aktivasyonu ve metabolizması sıkı bir şekilde bağlantılıdır^11,12, bu da trombosit metabolizmasını terapötik bir strateji olarak hedeflemeye olan ilginin artmasına^{yol açar 13,14}. Aktivasyon sırasında meydana gelen tam metabolik yeniden kablolama hakkında tartışmalar vardır ve bu aktif bir çalışma alanıdır¹⁵. Hastalıkta trombosit disfonksiyonuna ve bunun metabolizma ile olan bağlarına olan bu artan ilgi, trombositleri izole etmek ve metabolizmalarını incelemek için tekrarlanabilir bir yönteme olan ihtiyacın altını çizmektedir.

İnsan trombositleri tipik olarak damar delinmesi ile elde edilir ve daha sonra tam kandan izole edilir.  Yıkanan trombositler, ardışık yıkama ve santrifüj adımları¹⁶ ile tam kandan ayrılır. Bu başlangıçta Mustard'ın¹⁷. grubu tarafından yapıldı ve Cazenave'nin¹⁸. grubu tarafından biraz değiştirildi. Diğer bir alternatif, paketlenmiş bir agaroz jel boncuk^{sütunu 19} kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile trombositten zengin plazmadan (PRP) elde edilebilen jel filtreli trombositlerdir. Hem insan hem de kemirgen kanı için birçok yıkama protokolü mevcuttur ve çeşitli tahliller için optimize edilmiştir 20,21,22,23, ancak trombosit metabolizmasını ölçmek için optimize edilmemiştir.

Trombosit metabolizmasını incelemek için teknikler arasında Seahorse XF analizörü 11,24,25,26,27, hücre dışı akı ölçümleri 11,13,24, metabolomik^14,28 ve izotop destekli metabolik akı analizi (¹³C-MFA) aracılığıyla biyoenerjetik ölçümler yer ^alır29. Metabolomik çalışmalarda amaç tipik olarak iki farklı durum arasındaki değişmiş yolları belirlemektir (örneğin, dinlenme ve aktive edilmiş trombositler¹⁴). Metabolomik çalışmalar, sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) kullanımını içerir. Bu çalışmalar hücre içi veya hücre dışı metabolitler için yapılabilir ve sıklıkla yol analizi veya temel bileşen analizi (PCA) ile ^{birleştirilir14,28}. İzotop destekli metabolik akı analizi (¹³C-MFA), hücrelere izleyici olarak bilinen etiketli bir substratın beslenmesini ve bu izleyicinin LC-MS ile bir reaksiyon ağı boyunca nasıl yayıldığının ölçülmesini içerir. Bu teknik, reaksiyon seviyesi çözünürlüğü^29,30 olan metabolik yollardan akıların hesaplanmasına izin verir. Tam kan ve trombositten zengin plazmada (PRP), yakıt konsantrasyonu (glikoz, glutamin, asetat vb.) donörden donöre değişkenliğe tabidir ve plazmada bulunan albümin ve seks hormonu bağlayıcı globulin, hormonların, ilaçların ve diğer biyolojik olarak ilgili moleküllerin aktif konsantrasyonunu değiştirebilir³¹. Yıkanmış trombositler, ¹³C-MFA³² ile uyumlu, bilinen yakıt konsantrasyonları da dahil olmak üzere kullanıcı tanımlı bir ortamda trombositleri askıya almak için bir yöntem sunar.

Burada açıklanan, metabolik tahlillerde kullanılabilecek trombositler üretmek için trombosit yıkama yöntemidir. Protokol, düşük kırmızı kan hücresi ve beyaz kan hücresi kontaminasyonu ile hareketsiz trombositler üretir.  Trombosit aktivasyon durumu, trombosit aktivasyon belirteçlerinin akış sitometrisi ile izlendi. Bu protokol, tam kandaki trombosit sayısına göre tekrarlanabilir şekilde en az %30-40 trombosit geri kazanımı sağlar. Bu teknikle elde edilen yıkanmış trombositler metabolik analiz tekniklerine uygundur ve hücre içi metabolit ekstraksiyon yöntemi kullanıcının seçtiği analize göre uyarlanabilir (LC-MS, GC-MS, fotometrik test, vb.).

Çalışma, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü'nden Kurumsal İnceleme Kurulu onayı aldı. Tüm çalışma katılımcılarından yazılı onay alındı. Katılımcılar, önceki 48 saat boyunca alkol veya önceki on gün boyunca steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) tüketmediklerini bildirdiler. Bu proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından R61HL141794 numaralı ödülle desteklenmektedir.

1. Kan alma

1. Kan alımı için ayarlayın. Kan alımının eğitimli bir flebotomist tarafından yapılması önerilir.
2. 19 G'lik bir iğne kullanarak iç kolda damar delme işlemi yapın.
3. İlk ~2 mL'yi katkısız bir vakutainer'a toplayın ve atın. Bu, trombositleri aktive edebilecek hasarlı endotel hücrelerinden kimyasal sinyal moleküllerini çıkarmak içindir. İlk 2 mL toplandıktan sonra, trombositler üzerindeki kayma stresini azaltmak için turnikeyi çıkarın.
4. Kanın geri kalanını 14:3 oranında (kan: ACD-A) antiokoagülan sitrat dekstroz (ACD-A) vakutainerlerine toplayın. Kan ve antikoagülanı karıştırmak için kan alımından sonra her bir vakutaineri nazikçe ters çevirin.

2. Trombosit Yıkama

Şekil 1: Trombosit yıkamada yer alan ardışık santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Hava kabarcığı oluşumunu önleyin. Özellikle santrifüjlemeden önce, kabarcıklar oluştuğunda çıkarmak için transfer pipetleri kullanın. Kan / trombosit tüpleri her açıldığında / kapatıldığında, CO₂ seviyesini artırmak için kapağı kapatmadan önce tüpün içine nefes verilmesi önerilir.

1. Sıcaklık etkilerini azaltmak için santrifüjü 37 °C'ye önceden ısıtın. Protokoldeki her santrifüj adımı arasında, santrifüjü 37 °C'de tutun.
2. Su banyosunu 37 °C'ye ısıtın. Modifiye edilmiş Tyrode'un glikozlu tamponunu su banyosuna yerleştirin.
   NOT: değiştirilmiş Tyrode'un tampon tarifi Ek Dosya 1'de bulunabilir.
3. Tüm vakutainerlerden toplanan tam kanı 50 mL polipropilen konik tüplerde birleştirin. 45° açıyla kesilmiş eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak, hücre sayımı yapmak için uygun numune hacmini alın (bkz.
4. Dar delikli bir transfer pipeti ile dikkatlice aspire edilerek oluşan kabarcıkları çıkarın.
5. Kanı 37 °C'de 25 dakika su banyosunda dinlendirin Bu, geri dönüşümlü olarak aktive edilmiş bir durumdaki trombositlerin (vücuttan çıkarılması, tüpten tüpe aktarılması vb.) dinlenme durumuna geri dönmesini sağlar.
6. Santrifüjleme sırasında aktivasyonu önlemek için, tam kana 500 nM prostaglandin I₂ (PGI2) ve 0.02 U / mL apiraz ekleyin ve bir kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.  Dar delikli bir transfer pipeti kullanılarak oluşan kabarcıkları çıkarın.
   NOT: Uygun PGI₂ ve apyraz tarifi için talimatlar Ek Dosya 1'de bulunabilir.
7. Trombositten zengin plazma (PRP) (42 mL tam kan için 250 x g'da 15 dakika) elde etmek için tam kanı frensiz (37 °C) santrifüjleyin.
8. PRP'yi (buffy coat ve kırmızı kan tabakasının üzerindeki üst sarı tabaka) geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir konik tüpe nazikçe toplayın.
9. Aktarırken temiz bir konik tüpü eğin ve PRP'yi tüpün yanından nazikçe geçirin. Hava kabarcıklarından kaçının.
10. Buffy coat (PRP ile kırmızı kan arasındaki beyaz kan hücresi tabakası) rahatsız etmemek için yaklaşık 3 mm PRP'yi geride bırakın. Rahatsız edilirse, bu, transfer pipetinde ani bir beyaz girdap gibi görünecektir.
11. Bir sonraki yıkama adımı için yeniden süspansiyon hacmini belirlemek için hücre sayımı yapın (Bkz. Trombosit Sayma).
12. 37 °C'de 10 dakika dinlendirin.
13. Eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak akış sitometrisi için numune alın (bkz.
14. PRP'ye 500 nM PGI₂ ve 0.02 U/mL apyraz ekleyin ve bir kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.
15. 37 °C'de 1000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin (hızlanma:0, fren: 0). Fren kullanmayın. Pelet kompakt değildir ve ani fren yeniden karıştırmaya neden olabilir.
16. Santrifüjleme sırasında, yeniden süspansiyon hacmini belirleyin. %75 iyileşme olduğunu varsayalım. Hücre yoğunluğunu yaklaşık 3x10⁵ hücre/μL yapın.
17. Yığın hacmi için plastik geniş delikli bir transfer pipeti ve peletin yakınındaki sıvının geri kalanı için 1 mL'lik bir pipet (kesilmemiş uç) kullanarak süpernatanı aspire edin. Tüpün altındaki pelete dokunmaktan kaçının.
18. Modifiye Tyrode'un tamponuna 500 nM PGI₂ ve 0.02 U/mL apiraz ekleyin. Konik borunun yan tarafından damlatarak 16. adımdan itibaren hesaplanan tampon miktarını yavaşça ekleyin.
19. Eğimli kesim ucu ve 1 mL pipet ucu kullanarak, birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti nazikçe yeniden süspanse edin.
    1. Hacmi 300 μL'ye ayarlayın, sıvı hattının üzerindeyken pistonu sonuna kadar bastırın, ardından pipeti sıvının altına yerleştirin ve ilk durana kadar gelin. Bu, bilim adamının yanlışlıkla trombositleri aktive edebilecek hava kabarcıkları oluşturmadan peleti yeniden askıya almasına izin verecektir.
    2. Bazen, peletin dibinde görünür kırmızı kan hücrelerinden oluşan bir halka vardır. Bunu yeniden askıya almaktan kaçının.
20. Pelet yeniden süspanse edildikten sonra, yeniden süspanse edilmiş peleti yeni bir konik tüpe aktarmak için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın ve geride herhangi bir kırmızı hücre veya gözle görülür şekilde kümelenmiş hücreler bırakın.
21. 11-20 arasındaki adımları tekrarlayın. Modifiye Tyrode'un tamponuna yeni bir alikottan 500 nM PGI₂ ve 0.02 U/mL eklediğinizden emin olun (18. adımdan itibaren modifiye edilmiş Tyrode'un tamponunu tekrar kullanmayın, PGI₂ çok kararsızdır).
22. Hücre sayımı için bir örnek alın. Modifiye edilmiş Tyrode tamponu ile trombosit konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın.
23. Akış sitometrisi için bir örnek almak için eğimli kesimli bir pipet ucu kullanın.
24. İnhibitörlerin yıpranması için zaman tanımak ve geri dönüşümlü olarak aktive edilmiş trombositlerin dinlenme durumuna dönmesine izin vermek için trombositlerin 37 ° C'de 1 saat dinlenmesine izin verin.
25. Geniş delikli bir pipetle yavaşça karıştırın. Akış sitometrisi için örnekler alın.
26. Yıkanmış, dinlendirilmiş trombositler artık metabolik analiz için kullanılmaya hazırdır.

3. Trombositlerin sayımı

1. Trombositler, otomatik bir kan hücresi sayacı (üreticinin talimatlarına uyun) veya bir hemositometre³³ kullanılarak sayılabilir.

4. Akış Sitometrisi

1. Hazırlık
   1. Antikor karışımlarının ayarlanması ve trombosit aktivasyonunu ölçmek için akış sitometresinin hazırlanması için ayrıntılı protokoller ve en iyi uygulamaların gözden geçirilmesi başka bir yerde bulunabilir^34,35.
2. Örnekleme
   1. Akış sitometrisi için bir numune alırken, eğimli kesilmiş bir pipet ucu kullanarak trombosit süspansiyonunu toplayın. Bunu yavaşça antikorlu mikrosantrifüj tüpüne ekleyin, ardından karıştırmak için hafifçe vurun. 30 saniye inkübe edilmesine izin verin.
   2. Eğimli kesilmiş pipet ucunu kullanarak, trombosit süspansiyonu / antikor karışımını 96 oyuklu plaka üzerindeki uygun kuyuya aktarın.
   3. Hücreleri sabitlemek için hemen kuyuya sabitleyici ekleyin.
   4. Fiksasyondan sonraki 8 saat içinde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
3. Agonist duyarlılık testleri
   1. Yıkadıktan sonra, biri dinlenme kontrolü ve diğeri trombin aktive edici kontrol için olmak üzere 2 adet 15 mL'lik konik tüpü bir kenara koyun.
   2. Eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak her bir konik tüpe 100 μL trombosit süspansiyonunu nazikçe pipetleyin. 37 °C'de 1 saat dinlendirin.
   3. Bir saatlik dinlenmeden sonra, bir tüpe 0.1 U / mL trombin ekleyin (trombin hazırlama talimatları Ek Dosya 1'de bulunabilir) ve diğerine araç. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
   4. Agoniste trombosit duyarlılığını belirlemek için her tüpün bir akış sitometrisi örneğini alın.

5. Kantitatif Metabolik Akı Analizi için Numune Alma

1. Söndürme
   NOT: Metabolizmayı söndürmek, doğru metabolik akışları ölçmek için gerekli bir adımdır. Hücrelerin hızla soğutulması ve sıcaklıklarının 4 ° C'de veya altında tutulması, metabolizmayı, örneklenen hücrelerin toplu hücrelerin metabolizmasını doğru bir şekilde yansıtması için esasen durdurulduğu varsayılabilecek kadar yavaşlatır. Kullanılabilecek çeşitli yöntemler vardır, ancak hızlı soğutma ihtiyacını dengelemek ve sızıntıyı en aza indirmek için soğuk (-4 °C) normal tuzlu su³⁶ kullanın. Tuz sonraki analize müdahale edecekse, başka bir sıvı kullanılabilir (metanol/su, etanol vb.)³⁷.
   1. Normal tuzlu su alikotlarını hazırlayın ve dondurun. Her bir salin alikotunu istenen numunenin hacminin 6 katı kadar yapın.
      NOT: normal tuzlu su tarifi Ek Dosya 1'de bulunabilir.
   2. Mikrosantrifüjü 0 °C'ye kadar önceden soğutun.
   3. Trombosit süspansiyonunu kısmen donmuş normal salin içinde (< -4 ° C) 1: 6 oranında toplayın (örneğin, mikrosantrifüj tüplerinde 750 μL salin içine 150 μL trombosit süspansiyonu toplayın).
      NOT: Trombosit / salin solüsyonunu 15 dakikadan fazla buz üzerinde bırakmayın.
   4. 16.000 x g'da, 0 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı harici metabolit analizi için ve peleti hücre içi metabolit ekstraksiyonu ve ölçümü için saklayın. Her ikisini de analize hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
   6. Bu işlemi istenen zaman aralığında ve numune zaman noktası sayısında tekrarlayın.
2. Hücre İçi Metabolit Ekstraksiyonu
   1. Söndürülmüş pelete -20 °C'de 0,5 mL önceden soğutulmuş 7:3 metanol su ekleyin. 1 dakika boyunca kuvvetlice girdap.
   2. Sıvı nitrojen içinde dondurun, 0 °C'de çözdürün, ardından 2 döngü daha tekrarlayın.
   3. Süspansiyonları 16.000 x g'da -4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
   5. 3. adımdaki peleti kullanın ve ekstraksiyon protokolünü (1-3. adımlar) 50:50 metanol:su ile tekrarlayın. Toplanan ikinci özü birinciye ekleyin. Gece boyunca kurutun.
   6. Kurutulmuş ekstraktı 150 μL LC-MS dereceli suda (veya amaçlanan analiz için uygun başka bir çözücüde) tekrar süspanse edin. 4 °C'de 15 dakika karıştırın. Hücre kalıntılarını gidermek için kısaca girdap yapın ve 0.22 μm mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 16.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   7. Santrifüjden çıkarın, filtreye 50 μL daha optimum su pipetleyin ve filtreyi durulamak için tekrar santrifüjleyin (5 dakika, 16.000 x g ve 4 °C). Analiz için toplayın.

Şekil 2'deki temsili sonuçlar, 3 erkek ve 3 kadın olmak üzere 6 farklı kan bağışçısını temsil etmektedir. Tam kana göre trombosit verimi Şekil 2A'da gösterilmiştir. Son trombosit iyileşmesi ortalama %52 ± %3 idi (standart sapma, n=6). Beyaz kan hücresi kontaminasyonuna kıyasla son trombosit sayısı, otomatik bir hematoloji analizörü kullanılarak ölçüldü. Beyaz kan hücresi sayıları toplam hücrelerin %0.1'inden azdı (Şekil 2B). Yıkama işlemi ve bir saatlik dinlenme boyunca, trombositler düşük P-selektin maruziyetini korudu, ancak trombin tedavisine güçlü bir şekilde yanıt verdi (Şekil 2C). Bağlı fibrinojen, ilk 1000 x g dönüşten sonra yükselir, ancak ikinci 1000 x g dönüşten sonra %5'in altına geri döner. P-selektin maruziyeti gibi, bağlı fibrinojen, bir saatlik dinlenmeden sonra trombin tedavisini takiben büyük ölçüde artar (Şekil 2D). Boyut, tekiller ve CD42a pozitifliği için temsili geçitleme Şekil 3A-C'de gösterilmiştir. Bu ardışık kapıları geçen olaylar, P-selektin maruziyetini ve bağlı fibrinojeni aramak için kullanılır. P-selektin pozitif ve fibrinojen pozitif trombositler için temsili geçit Şekil 3D-E'de gösterilmiştir. Şekil 3D, araç kontrolü ile tedavi edilen bir trombosit örneğini göstermektedir ve Şekil 3E, 0.1 U / mL trombin eklendikten 15 dakika sonra bir trombosit örneğini göstermektedir.

Yıkanmış trombositler, Şekil 4'te gösterilen kantitatif bir alım ve boşaltım deneyi yapmak için kullanıldı. Trombositler yıkandı ve son yıkanan süspansiyonlara 5 mmol/L glukoz ve 20 mmol/L asetat ilave edildi. Bir saatlik dinlenmeden sonra yıkanmış trombosit süspansiyonlarına 0.1 U/mL trombin veya araç eklendi. Örnekler toplandı ve trombin ilavesinden sonra her 15 dakikada bir 30 dakika süreyle söndürüldü. Süpernatanlar, otomatik fotometrik tahliller kullanılarak hücre dışı laktat, glikoz ve asetat konsantrasyonundaki değişiklikleri ölçmek için kullanıldı. Akı, metabolit konsantrasyonunun zaman içindeki regresyon eğimi alınarak hesaplandı. Şekil 4 , üç temsili donör için hesaplanan metabolit akılarını göstermektedir. Tüm donörler için laktat akışları pozitifti, bu da laktatın üretildiğini gösteriyordu ve glikoz ve asetat akışları negatifti, bu da tüketildiklerini gösteriyordu. Kıvrım değişiminde farklılıklar olsa da, trombin tedavisi, her donör için dinlenmeye kıyasla akıların büyüklüğünde bir artışa yol açmıştır.

Şekil 2: (A) Yıkama işleminin her adımında tam kana göre geri kazanılan trombositlerin yüzdesi. n = 6, hata çubukları standart sapmayı temsil eder. (B) Yıkama işleminin sonunda trombosit ve lökosit hücresi sayısı. (C) Akış sitometrisi ile ölçülen P-Selektin ekspresyonu için pozitif trombositlerin yüzdesi. n = 6, hata çubukları standart sapmayı temsil eder. (D) Akış sitometrisi ile ölçülen fibrinojen için pozitif trombositlerin yüzdesi. n = 6, hata çubukları standart sapmayı temsil eder. . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Trombosit akış sitometrisi için temsili geçit. Trombositler (A) öne saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) ile boyut için kapılanır, (B) daha sonra FSC genişliği ve FSC yüksekliği olan tek hücreler için kapılanır ve (C) CD42a pozitifliği için kapılanır. Bu ardışık kapıları geçen olaylar, aktivasyon işaretlerini aramak için kullanılır. (D) Bir dinlenme kontrol trombosit numunesi için P-selektin ve fibrinojen ekspresyonu. Burada ölçülen aktivasyon belirteçleri P-Selectin, PECy5 ve FITC-Fibrinojen'dir. (E) 0.1 U / mL trombin ile tedavi edilmiş trombosit örneği için P-selektin ve fibrinojen ekspresyonu. Burada ölçülen aktivasyon belirteçleri P-Selectin PECy5 ve FITC-Fibrinojen'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: (A) Dinlenme ve trombin aktive olmuş bir durum için üç farklı donör için laktat atılım oranları. (B) Dinlenme ve trombin aktive olmuş bir durum için üç farklı donör için glikoz alım oranları. (C) Dinlenme ve trombin aktive olmuş bir durum için üç farklı donör için asetat alım oranları.  Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Tampon ve reaktif hazırlama tarifleri ve talimatları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Trombositler, kayma gerilimi ve agonistlerin varlığı dahil olmak üzere çevrelerine karşı çok hassastır^38,39. Bu, trombositlerin işlenmesini ve izole edilmesini zorlaştırır, inhibitörlerin ve geniş delikli pipetlerin kullanımını çok önemli hale getirir⁴⁰. PGI_2'nin uygun şekilde saklanması ve hazırlanması hayati önem taşır, çünkü PGI_2'nin temel PBS'de hazırlanmaması, PGI₂^41'in hızlı bir şekilde bozulmasına neden olacaktır. Kayma kaynaklı aktivasyon riskini en aza indirmek için geniş delikli pipetler, eğimli kesimli pipet uçları ve 19 gauge flebotomi iğnesi kullanın.

Kaçınılmaz olarak, yıkama işleminin her adımında trombositlerin bir kısmı kaybolacaktır (Şekil 2A). Tüm trombositler plazma tabakasına ulaşmaz ve plazmayı buffy coat tabakasına çok yakın toplamak beyaz kan hücresi kontaminasyonu riski taşır. Ek olarak, bir trombosit popülasyonu, yeniden süspansiyon üzerine topaklanır ve dibe çöker, bu da her yeniden süspansiyondan sonra yeniden askıya alınan peletin temiz bir tüpe aktarılmasının önemini vurgulamaktadır. Şekil 2D'de, ilk 1000 x g dönüşten sonra fibrinojen bağlanmasında bir artış olduğuna ve daha sonra ikinci 1000 x g dönüşten sonra aşağı indiğine dikkat edin. Flow sitometri örnekleri her durumda 10 dakikalık bir dinlenme süresinden sonra toplandı. Bu popülasyonun bir kısmının hareketsiz doğasını geri kazanması mümkündür, ancak bu popülasyon ilk 10 dakikalık dinlenmeden sonra mevcut olduğundan, bu aktive edilmiş popülasyonun bir kısmı yeniden süspansiyon üzerine topaklanabilir ve tüpün dibine düşebilir.

Akış sitometrisinin kullanılması kesinlikle gerekli olmasa da, trombositlerin hareketsiz olup olmadığını ve yıkama işleminin sonunda agonistlere yanıt verip veremediğini izlemek faydalıdır. Ek olarak, özellikle trombositlerin büyük bir kısmı yıkama sırasında görsel olarak topaklanmış görünüyorsa, her adımda akış sitometrisi yapmak sorunun nerede ortaya çıktığını belirlemeye yardımcı olabilir. Nadir olmakla birlikte, dinlenme döneminde spontan trombosit aktivasyonu nedeniyle 20 donör deneyinden yaklaşık 1'i dışlanmalıdır. Trombosit aktivasyon belirteçlerinin akış sitometrisi analizi, trombositleri içeren deneylerden önce agoniste karşı sessizliği ve duyarlılığı doğrulamak için değerli bir araçtır.

Akış sitometrisi kullanarak agoniste trombosit tepkisini ölçmek için, bazı çalışmalar^{trombositlerin} 42,43,44'ü sabitlemeden önce oda sıcaklığında 10-30 dakika agonist ve antikor kokteyli içinde inkübe etmesine izin verir. Bir saatlik dinlenmeden sonra, dinlenme kontrol trombositlerini sabitlemeden önce oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon, aktivasyonun fazla tahmin edilmesine neden olur. Bu aktivasyon, trombositler 37 ° C'de 20 dakika inkübe edildiğinde meydana gelmez, bu da bu belirgin aktivasyonun, inhibitörlerin yıpranması ve ani sıcaklık değişiminin trombositleri aktive etmesi nedeniyle meydana geldiğini düşündürür. Yıkama işlemi sırasında sabitlemek için 20 dakika beklemek de bu yapay aktivasyonu indüklemez, bu da bir saatlik dinlenme sırasında inhibitörlerin etkisinin zayıflamasına bağlı olabilir. Trombositlerin gerçek aktivasyon durumunu yakalamak için, inkübasyonun 37 °C'de yapılması veya antikorlarla sadece kısa (30 saniye) bir inkübasyondan sonra sabitlenmesi önerilir.

Yıkanmış trombositler, diğer kan hücrelerinin ve plazma bileşenlerinin müdahalesi olmadan trombositleri incelemek için bir yol sunar. Metabolik çalışmalar da dahil olmak üzere hücre dışı ortamın manipüle edilmesi gereken çalışmalar için idealdirler. Son trombosit süspansiyonunun yoğunluğu ayarlanabilir ve insanlar arasındaki trombosit sayısındaki değişkenliği en aza indirmek için kontrol edilebilir. Metabolik çalışmalar için, trombosit karbon substratlarının özel konsantrasyonları kontrol edilebilir. Şekil 4'te gösterilen temsili sonuçlar, glikoz ve asetatın karbon substratları olarak eklendiği ve laktatın üretildiği bir alım ve boşaltım deneyinden elde edilmiştir. Şekil 4'te donörler arasında biyolojik değişkenlik varken, trombin tedavisi ile laktat üretimi artarken, glukoz ve asetat tüketimi artmaktadır. Bu literatürle uyumludur; Trombositlerin aktivasyon üzerine aerobik glikoliz ve oksidatif fosforilasyon oranlarını arttırdığı bilinmektedir 13,14,15,45.  Bu teknik, farklı besin koşulları altında veya son trombosit süspansiyonundaki farklı iyonlarla trombositleri incelemek için uygulanabilir.

Yıkanmış trombosit çalışmaları değerli olsa da, yapay ortamın çevreyi in vivo olarak özetlemediğini akılda tutmak önemlidir. Bu nedenle, yıkanmış trombositler sadece araştırmacıların sadece trombosit fonksiyonu ile ilgilendiği durumlarda kullanılmalıdır. Tüm in vitro çalışmalarda olduğu gibi, sonuçlar dikkatli bir şekilde yorumlanmalıdır. Son yıkamadan sonra trombositlerin 2 mM kalsiyum konsantrasyonu ile modifiye Tyrode tamponunda yeniden süspanse edilmesi önerilir. P-selektin ve fibrinojen bağlanma ekspresyonu, yıkama işleminden sadece 1,5 saat sonrasına kadar (bir saatlik dinlenme dahil 2,5 saat) ölçülmüştür, bu nedenle bilim adamının yıkanmış trombosit süspansiyonunu bu zaman penceresi içinde kullanması veya başka bir şekilde trombositlerin doğruluğunu doğrulaması önerilir. Bu çalışma, agregasyon gibi diğer klasik trombosit işlevselliği ölçümlerini ölçmemiştir.

Protokolümüzle hazırlanan yıkanmış trombositler hareketsizdir, P-selektin ve fibrinojenin akış sitometrik ölçümleri ile doğrulanır. Hücre dışı ortamdaki metabolik substratlar, hormonlar ve trombosit agonistleri hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve bilim adamının seçtikleri bir sistemde trombosit metabolizmasını incelemesine olanak tanır.

Yazarların bildirecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar, Dr. Pierre Mangin'in laboratuvarından Dr. Emily Janus-Bell ve Clarisse Mouriaux'ya ve Dr. Jorge DiPaola'nın laboratuvarından Katrina Bark'a rehberlikleri ve tavsiyeleri için teşekkür eder.