Farelerden Vasküler Duvarda Yerleşik CD34⁺ Kök Hücrelerin İmmünomanyetik İzolasyonu

Bu çalışma, vasküler duvarda yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin (CD34⁺ VW-SC'ler) izolasyonu, kültürü ve fonksiyonel tayini için stabil ve verimli bir yöntem oluşturmuştur. Bu takip etmesi kolay ve zaman açısından etkin izolasyon yöntemi, kardiyovasküler hastalıklarda yer alan potansiyel mekanizmaları incelemek için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir.

Yerleşik CD34⁺ vasküler duvarda yerleşik kök ve progenitör hücreler (VW-SC'ler), vasküler yaralanma ve onarımı düzenlemedeki önemli rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Fonksiyonel murin CD34⁺ VW-SC'leri kültürlemek için kararlı ve verimli bir yöntem oluşturmak, bu hücrelerin çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında çoğalması, göçü ve farklılaşmasında rol oynayan mekanizmaların daha fazla araştırılması için gereklidir. Açıklanan yöntem, birincil kültürlenmiş yerleşik CD34⁺ VW-SC'leri saflaştırmak için manyetik boncuk taramasını ve akış sitometrisini birleştirir. Saflaştırılmış hücreler daha sonra immünofloresan boyama ve Ca^{2 +} görüntüleme yoluyla fonksiyonel olarak tanımlanır. Kısaca, murin aort ve mezenterik arterin adventitisinden elde edilen vasküler hücreler, doku bloğu bağlanması yoluyla elde edilir, ardından en az 1 × 10^7'lik bir hücre sayısına ulaşana kadar subkültürasyona tabi tutulur. Daha sonra, CD34⁺ VW-SC'ler manyetik boncuk sıralama ve akış sitometrisi kullanılarak saflaştırılır. CD34⁺ VW-SC'lerin tanımlanması, hücresel immünofloresan boyamayı içerirken, fonksiyonel çok potansiyellilik, yönlendirilmiş farklılaşma için hücrelerin spesifik bir kültür ortamına maruz bırakılmasıyla belirlenir. Ayrıca, fonksiyonel dahili Ca^{2 +} salınımı ve harici Ca^{2 +} girişi, ATP, kafein veya tapsigargin (TG) 'ye maruz kalan Fura-2 / yüklü hücrelerde ticari olarak temin edilebilen bir görüntüleme iş istasyonu kullanılarak değerlendirilir. Bu yöntem, vasküler duvarda yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin izole edilmesi, kültürlenmesi ve tanımlanması için stabil ve verimli bir teknik sunarak, VW-SC'lerin düzenleyici mekanizmaları ve hedefe yönelik ilaçların taranması üzerine in vitro çalışmalar için bir fırsat sağlar.

Vasküler duvar, vasküler gelişimde, homeostatik regülasyonda ve vasküler hastalıkların ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, arterlerde çeşitli kök hücre soylarının varlığını ortaya koymuştur. 2004 yılında, Profesör Qingbo Xu'nun grubu ilk olarak yetişkin vasküler duvarın çevresinde CD34, Sca-1, c-kit ve Flk-1¹ eksprese eden vasküler kök / progenitör hücrelerin varlığını bildirdi. Bu vasküler kök hücreler çok yönlü farklılaşma ve çoğalma potansiyeli gösterirler. Normal koşullar altında, nispeten hareketsiz kalırlar; Bununla birlikte, belirli faktörler tarafından aktive edildiklerinde, düz kas hücrelerine, endotel hücrelerine ve fibroblastlara farklılaşabilirler. Alternatif olarak, yaralı damarların ^2,3,4,5,6 onarımını veya yeniden şekillenmesini teşvik etmek için parakrin etkiler yoluyla perivasküler matris ve mikrodamar oluşumunu düzenleyebilirler. Son zamanlarda, vasküler duvardaki yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin, femoral arter kılavuz tel yaralanması sonrası endotel hücre rejenerasyonunda rol oynadığı bulunmuştur². Sonuç olarak, CD34⁺ VW-SC'lerin izolasyonu ve miktar tayini ve CD34⁺ kök hücrelerinin temel biyolojik özelliklerinin incelenmesi, CD34⁺ VW-SC'lerin regülasyonunda yer alan sinyal yollarının daha fazla incelenmesi için çok önemlidir.

Hücre kültürü özelliklerine veya hücrelerin fiziksel özelliklerine dayalı teknikler de dahil olmak üzere, yoğunluk gradyan santrifüjleme gibi hücre ayırma için çeşitli yöntemler şu anda mevcuttur, bu da birçok hedef olmayan hücre içeren ve nispeten düşük saflıkta^{sıralanmış} hücrelerle sonuçlanır 7,8,9,10,11,12 . Yaygın olarak kullanılan bir başka teknik, floresan / manyetik destekli hücre sıralamasıdır. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS), yüksek teknik gereksinimlere sahip karmaşık bir sistemdir ve nispeten pahalıdır, zaman alıcıdır ve potansiyel olarak sıralanmış hücrelerin^{aktivitesini etkiler 13,14}. Bununla birlikte, manyetik olarak etkinleştirilen hücre sınıflandırma (MACS), yüksek geri kazanım oranı ve hücre aktivitesi ve sonraki uygulamalar üzerinde daha az etki ile daha verimli ve kullanışlıdır⁸. Bu nedenle, bu protokolde, CD34⁺ VW-SC'leri saflaştırmak için MACS uyguladık ve hücreleri akış sitometrisi ile daha fazla tanımladık. Damar duvarı kök hücrelerinin incelenmesi için MACS tabanlı izolasyon yöntemlerinin oluşturulması paha biçilmez olacaktır. İlk olarak, deneysel genetik ve hücre biyolojik çalışmalarına izin verir. İkinci olarak, vasküler duvarda yerleşik kök hücrelerin etkin izolasyonu ve kültürü, kök hücre fonksiyonlarını düzenleyen sinyal faktörlerinin sistematik olarak değerlendirilmesine ve taranmasına olanak tanır. Üçüncüsü, kök hücrelerdeki önemli fenotiplerin tanımlanması, hücre durumunun değerlendirilmesinde önemli bir 'kalite kontrolü' sağlar. Bu nedenle, saflaştırma yöntemlerinin belirlenmesi, damarlardan elde edilen benzer kök hücrelere benzer uygulamalar için yararlı olabilir.

Bu rapor, akış sitometrisi, immünofloresan boyama ve Ca 2+ sinyal ölçümü ile gerçekleştirilen hücre tanımlama ve fonksiyonel değerlendirme dahil olmak üzere^CD34+ VW-SC'lerin kültürü için kararlı ve güvenilir bir yöntemin ayrıntılı bir gösterimini sağlar. Bu çalışma, CD34⁺ VW-SC'lerin işlevi ve fizyolojik ve patolojik koşullardaki düzenleyici mekanizmaları hakkında daha derinlemesine araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır.

Bu çalışma onaylandı ve hayvanlar, Çin'deki Laboratuvar Hayvanlarının Yönetimi ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ele alındı. Araştırma, Hayvan Etik Kurulu'nun onayı ile hayvan deneylerinin etik gerekliliklerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır (Onay No: SWMU2020664). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 18-20 g ağırlığında sekiz haftalık sağlıklı C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Southwest Tıp Üniversitesi (SWMU) Laboratuvar Hayvanları Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Aort ve mezenterik arterlerden adventiti doku blok kültürü

1. Yerleşik CD34⁺ VW-SC izolasyonu
   1. % 3 izofluran inhalasyonu ile iki fareyi uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Ayak parmağınızı kıstırarak yeterli anesteziyi onaylayın. Fareyi tıbbi bantla sırtüstü yatırın ve farenin kürkünü dezenfekte etmek için %70 etanol dezenfektanı püskürtün. Kalbi ve bağırsakları ortaya çıkarmak için steril oftalmik makas ve forseps kullanarak göğüs ve karın boşluklarını açın. İzole aort ve mezenterik arterleri diseke ettikten sonra, aort ve mezenterik yatağı silikon elastomer içeren ve fizyolojik bir tuz çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına sabitleyin. Başka bir sterilize makas ve forseps seti ile aort ve mezenterik arterlerin etrafındaki yağları hızla inceleyin.
   2. Diseke edilen dokuları %1 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B solüsyonu içeren 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın (bkz. İki kez duruladıktan sonra, arterleri stereo mikroskop altında bir doku kültürü başlığına aktarın.
   3. Arterleri uzunlamasına kesin ve aortun dış tabakasını ve mezenterik arterlerin ilk dalını soymak için ince forseps kullanın. Dış katmanları 0.1-0.2 mL kültür ortamı içeren 3.5 cm'lik bir Petri kabına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Dış katmanları küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 mm³).
   4. Doku parçalarını jelatin kaplı bir T25 şişesine aktarın ve şişenin tabanında eşit dağılım sağlayın. Hücre taramasını ve büyümesini kolaylaştırmak için doku parçaları arasında orta bir mesafe bırakın. Doku bloklarının şişenin tabanına yapışmasını sağlamak için şişeyi 3 saat boyunca bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO₂) dikey olarak yerleştirin.
   5. 3 saat sonra, doku bloklarını batırmak için 5 mL DMEM yüksek glikoz büyüme ortamı ekleyin. T25 şişesini yatay olarak yönlendirin. Doku blokları etrafındaki hücre göçünü 3 günlük aralıklarla mikroskopla izleyin.
      NOT: Ortam% 20 fetal sığır serumu,% 0.2 Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF), 0.2 mM β-Merkaptoetanol ve% 1 penisilin / streptomisin içermelidir (bkz. Fetal sığır serumu hücre proliferasyonunu desteklerken, LIF ve β-Merkaptoetanol hücre farklılaşmasını engeller ^7,8.
   6. T25 şişesindeki hücreler yaklaşık% 80 birleşime ulaştığında, bunları bir veya iki T75 şişesine geçirin ve kültürleyin. Uygun büyüme ve sağlığı sağlamak için hücreleri beş geçit boyunca alt kültürleyin.
2. Yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin manyetik olarak ayrılması
   1. Bir veya iki T75 şişesindeki hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri Tripsin ile ayırın ve 1 mL ayırma tamponunda (2 mM EDTA ve% 0.5 FBS) yeniden süspanse edin. Hücre sayısını (10⁷ / T75 şişesi) belirleyin ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 300 x g'da santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı tamamen atın ve hücre peletini toplam 10⁷ hücre başına 98 μL ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. 2 μL CD34 antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve ara sıra çalkalayarak karanlıkta 4°C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Hücreleri 2 mL ayırma tamponu ekleyerek yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın ve hücreleri 80 μL ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.
   5. Tampona 20 μL Anti-FITC MicroBeads (toplam 10⁷ hücre başına, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Tekrarlayan pipetleme ile iyice karıştırın ve aralıklı çalkalayarak karanlıkta 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
   6. Hücreleri 2 mL tampon ekleyerek iki kez yıkayın ve hücreleri yeniden canlandırmak için 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri 1 mL tamponda yeniden süspanse edin.
   7. Ayrılan bileşenleri toplamak için MS kolonunun altına bir toplama tüpünün (örn. 15 mL'lik bir santrifüj tüpü) yerleştirildiğinden emin olarak, bir MS sütununu uygun bir ayırıcının manyetik alanı içine yerleştirin. ( Bkz. Malzeme Tablosu). Kolonu 500 μL tampon ile durulayın ve tamamen bitene kadar bekleyin.
   8. Hücre süspansiyonunu kolona yükleyin ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı 15 mL'lik tüpe toplayın.
   9. Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Kolona 500 μL tampon yerleştirin, ardından pistonu kolona iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
   10. CD34 ⁺ hücrelerinin saflığını arttırmak için, ayrıştırılan fraksiyon ikinci bir MS sütunu kullanılarak zenginleştirilebilir. Ayırma işlemini yukarıda belirtildiği gibi tekrarlayın. Akış sitometrisi ile sıralanan hücrelerin saflığını değerlendirin.
       NOT: Tipik olarak, yaklaşık% 70 -% 80 negatif hücreler ve boyama ve santrifüj prosedürleri nedeniyle yaklaşık% 10 kayıpla% 10 -% 20 CD34 ⁺ hücreleri elde edilir.
   11. Vasküler duvar CD34 ⁺ kök hücrelerinin saflığını daha da doğrulamak için, sıralanan hücreleri akış sitometrisi ile tanımlayın. Bu çalışma% 90'dan fazla bir saflık göstermiştir.

2. İmmünofloresan ile hücre tanımlama

1. Lameller üzerindeki tohum hücreleri (çap 8 mm)% 0.04 jelatin ile önceden kaplanmıştır.
2. Hücreler yaklaşık% 60 -% 70 birleşime ulaştığında, PBS ile iki kez durulayın ve hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
3. Hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 (PBS'de) ile geçirgen hale getirin.
4. Hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın ve antikorların spesifik olmayan bağlanmasını 1 saat boyunca% 5 eşek serumu (PBS'de) ile bloke edin.
5. Her bir lameli kenarından forseps ile tutarak ve tüy bırakmayan bir mendil tabakasına boşaltarak engelleme tamponunu çıkarın.
6. Hücreleri 100 kez seyreltilmiş primer antikorlarda (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca %1 BSA'da (PBS'de) inkübe edin.
7. Solüsyonu boşaltın ve hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın. Hücreleri Alexa Fluor 488 etiketli ikincil antikor (% 1 BSA'da 1:200) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
8. DAPI stok çözeltisini PBS'de 0,5 μg/mL'ye seyrelterek ve hücreleri 5 dakika inkübe ederek DAPI karşı boyama gerçekleştirin.
9. PBS ile durulayın ve lamelleri antifade reaktifi ile kapatın. Lazer taramalı konfokal mikroskop altında görüntü yakalayın.

3. CD34⁺ VW-SC'lerin indüklenmiş farklılaşması ve karakterizasyonu

1. CD34⁺ kök hücreleri, lameller ve 6 oyuklu plakalar üzerinde sırasıyla uygun bir yoğunlukta (%40-%50 birleşme) tohumlayın.
2. Hücreleri 1 hafta boyunca endotel hücre kültürü ortamı EBM-2'de kültürleyerek CD34 ⁺ hücrelerinden endotel hücre yönelimli farklılaşmayı indükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Hücreleri fibroblast hücre kültürü ortamı FM-2'de 3 gün boyunca kültürleyerek CD34 ⁺ hücrelerinden fibroblast hücre yönelimli farklılaşmayı indükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
4. Farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreleri, 488 nm'lik lazer uyarımında ve 40x objektifte immünofloresan boyamaya (adım 2'de belirtildiği gibi) tabi tutun. Endotel hücre belirteçlerinin (CD31, VWF) ve fibroblast hücre belirteçlerinin (PDGFRα, Vimentin) ekspresyonunu tespit edin (bkz.
5. Hücreleri Tripsin ile ayırın ve hücre peletini santrifüjleme yoluyla elde edin (300 x g, 5 dakika, oda sıcaklığı). Hücreleri 100 μL ayırma tamponu ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu saflaştırılmış anti-fare CD16 / CD32 mAb (1 μg) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca önceden inkübe edin.
6. 2 μL PE Sıçan anti-Fare CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonal Antikor APC (2 μL, 1:50) ve CD140a (PDGFRa) Monoklonal Antikor FITC (2 μL, 1:50) ekleyin doğrudan Fare Fc Bloğu varlığında önceden inkübe edilmiş hücrelere ve ayrıca 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
7. Hücreleri yeniden canlandırmak için 2 mL tampon ekleyerek iki kez yıkayın ve 300 x g'da 5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri 300 μL tamponda yeniden süspanse edin. Lekeli hücrelere sahip akış tüplerini Akış sitometrisi için hazır bir buz kutusuna koyun.

4. Vasküler^CD34+ kök hücrelerde hücre içi Ca 2+ sinyalizasyonunun saptanması

1. Lameller üzerindeki tohum hücreleri, deneylerden 10 saat önce% 70'e varan bir yoğunlukta birleşir.
2. Lamelleri çıkarın ve herhangi bir vazelin ile özel bir haznenin dibine yapıştırın.
3. Lamelleri bir kez PBS ile yıkayın, Tyrode solüsyonunda (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, MgCl₂ 1.2 mM, glikoz 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2.4 mM) Fura-2 / (5 μM) ile değiştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
4. Fura-2 / de-esterifikasyonuna izin vermek için Tyrode solüsyonu ile 10 dakika muamele ederek boyayı çıkarın.
5. Odayı, bir monokromatör ve bir CCD kamera içeren geniş alanlı bir görüntüleme sistemi ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun sahnesine monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
6. Ana pencereyi açın, Yakalama Ayarları iletişim kutusuna ve kamera sayfasına gidin ve canlı görüntü gösterimi için canlı düğmesine basın.
7. Optimum görüntü parlaklığı elde etmek için floresan görüntü türünü seçin, 340 nm/380 nm döngü tekrarlama sürelerini, görüntü boyutunu ve kamera pozlama süresini 380 nm ve 340 nm olarak ayarlayın.
8. Tek anlık görüntüler alın ve hücreleri farklı renklerle daire içine almak için birkaç serbest çizgi çizin ve İlgi Alanlarını (ROI'ler) önceden tanımlayarak arka planı ROI 0 olarak belirtin.
9. Çalışma alanı görünümünde zaten katıştırılmış bir protokolü yeniden düzenleyin ve yeni bir çalışma alanı oluşturun.
10. Protokolü yürütün ve "Floresan 340 nm div Floresan 380 nm (Canlı Kinetik)" çevrimiçi kinetik grafiği gösterecektir.
11. Sayısal görünümde, gri tonlamalı değerlerin sütunlarını ve karşılık gelen zaman bilgilerini sunan bir elektronik tablo görünecektir. Panoyu kullanarak elektronik tablo verilerini dışa aktarın.
12. Arka plan floresansını (ROI 340) çıkardıktan sonra hücre içi Ca 380+ değişikliklerini gösteren F2 nm/^F0'yi hesaplayın.

CD34⁺ VW-SC'lerin izolasyonu ve saflaştırılması
CD34⁺ VW-SC'lerin yüksek saflığı, doku eki ve manyetik mikroboncuk sıralama ile fare aort ve mezenterik arterinin adventitisinden elde edilir. Damar duvarındaki CD34⁺ hücrelerinin yüzdesi genellikle %10-30'dur. Akış sitometrisi, manyetik boncuk ayıklama ile elde edilen CD34⁺ hücrelerinin saflığının %90'dan fazla olduğunu doğrular (Şekil 1A). Hücresel immünofloresan boyama, CD34⁺ VW-SC'lerin ağırlıklı olarak CD34, c-kit, Flk-1 ve Ki-67'yi eksprese ettiğini ve nispeten daha düşük bir Sca-1 ekspresyonu olduğunu gösterir (Şekil 1B).

CD34⁺ VW-SC'lerin Farklılaşması
CD34 ⁺ VW-SC'ler in vitro olarak endotel hücrelerine ve fibroblastlara farklılaşabilir. CD34 ⁺ kök hücrelerin, endotel hücre belirteçleri CD31 ve VWF'nin artan ekspresyonu ile endotel hücrelerine farklılaşması indüklenebilir. Ek olarak, diferansiye fibroblast hücreleri uzun iğ morfolojisi ve fibroblast belirteçleri PDGFRα ve Vimentin'in artmış ekspresyonunu gösterdi (Şekil 2A,B). Ayrıca, akış sitometrisi hücrelerin farklılaşma yeteneğini de doğruladı; diferansiyasyon sonrası CD34⁺CD31⁺ endotel hücrelerinin yüzdesi farklılaşmamış hücrelere göre 1.5 kat artmıştır (Şekil 2C) ve farklılaşma sonrası CD34⁺PDGFRa⁺ fibroblast hücrelerinin yüzdesi farklılaşmamış hücrelere göre 1.7 kat artmıştır (Şekil 2D).

CD34⁺ VW-SC'lerde Ca²⁺ sinyalizasyonunun karakterizasyonu
ATP'nin hücre dışı uygulaması (10 μM), G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR) aracılı sinyal yolu yoluyla hücre içi^Ca2+ seviyesini arttırdı ve tapsigargin (TG), sarkoplazmik retikulum (SR) Ca²⁺ ATPaz'ı (SERCA) hücre içi SR Ca²⁺ depolarını tüketmek için inhibe etti ve depoyla işletilen kalsiyum girişini (SOCE) tetikledi. Ayrıca, kafein, riyanodin reseptörleri (RyR'ler) aracılı Ca^{2 +} salınımını aktive ederek artan [Ca^{2 +}] i'yi uyardı (Şekil 3).

Şekil 1: Doku kültürü ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) ile hasat edilen CD34⁺ VW-SC'ler. (A) Saflaştırılmış CD34⁺ VW-SC'lerin akış sitometrik değerlendirmesi. (B) Kök hücre belirteçleri CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 ve hücre proliferasyon belirtecinin (Ki-67) ekspresyonunu gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CD34⁺ VW-SC'lerin çok yönlü farklılaşma yeteneğinin tespiti. (A) Farklılaşmadan önce CD34⁺ VW-SC'lerde endotelyal belirteçler CD31 ve VWF'nin ve fibroblast belirteçleri PDGFRα ve Vimentin'in ekspresyonunu gösteren temsili görüntüler. (B) Farklılaşmadan sonra CD34 ⁺ VW-SC'lerde endotel belirteçleri CD31 ve VWF'nin ve fibroblast belirteçleri PDGFRα ve Vimentin'in ekspresyonunu gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubukları: 50 μm. İç ölçek çubuğu 10 μm'dir. (C) Akış sitometrisi ile ölçülen farklılaşmadan önce ve sonra CD34 ⁺ CD31 ⁺ endotel hücrelerinin yüzdesi. (D) Akış sitometrisi ile ölçülen farklılaşmadan önce ve sonra CD34 ⁺ PDGFRa ⁺ fibroblast hücrelerinin yüzdesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CD34⁺ VW-SC'lerde hücre içi Ca²⁺ sinyali. (A) Temsili eğri, ATP'nin (10 μM) hücre içi Ca²⁺ sinyali üzerindeki etkisini gösterir. (B) Temsili eğri, SR deposundan TG (1 μM) ile indüklenen hücre içi^Ca2+ salınımını ve 2 mM Ca² + 'nın yeniden eklenmesinden sonra Ca^{2 +} tükenmesi ile tetiklenen müteakip hücre dışı Ca^{2 +} akışını gösterir. (C) Kafein (10 mM) ile aktive edilen hücre içi Ca^{2 +} sinyalini gösteren temsili eğri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, farelerin aort ve mezenterik arterlerinden fonksiyonel CD34⁺ VW-SC'lerin elde edilmesi için hızlı ve uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntemle elde edilen CD34⁺ VW-SC'ler, proliferatif aktivite ve çok yönlü farklılaşma özelliklerine sahiptir. Trifosfat inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP₃Rs), riyanodin reseptörleri (RyR'ler) ve mağaza tarafından işletilen kalsiyum kanalları, CD34⁺ VW-SC'lerde Ca²⁺ salınımına ve girişine aracılık eder. Bu tekniğin kurulması, kardiyovasküler hastalıklarda yapısal ve fonksiyonel yeniden şekillenmeye katılan CD34⁺ VW-SC'lerde yer alan mekanizmaların daha fazla araştırılması için temel oluşturacaktır.

Primer hücre izolasyonu için en yaygın yöntemler doku bloğu bağlanması ve enzimatik ayrışmayı içerir^15,16. Bu raporda, CD34⁺ VW-SC'lerin yüksek saflığını elde etmek için doku bloğu bağlantısı ve manyetik boncuk sınıflandırması birleştirilmiştir. Sıralanan damar duvarı CD34 ⁺ kök hücreleri CD34 için pozitiftir ve çok azı endotel hücre belirteci CD31'i eksprese eder, bu da önceki bir rapor² ile tutarlıdır. Ayrıca, farelerde yeni izole edilmiş femoral arter hücrelerinin tek hücreli dizilimini kullanan Jiang ve ^ark.2, CD34'ün düz kas hücresi popülasyonunda değil, esas olarak endotel ve mezenkimal hücre popülasyonlarında eksprese edildiğini buldu. İn vivo deneyler ayrıca CD34⁺ VW-SC'lerin yaralanma sonrası vasküler onarıma katılmak için endotel hücrelerine farklılaşabileceğini doğrulamaktadır. VW-SC'ler heterojen olduğundan, bu yöntemle sıralanan CD34⁺ VW-SC'ler, Flk-1, c-kit ve Sca-1 gibi diğer kök hücre pozitif belirteçleri ile birlikte farklı alt popülasyonlara sahiptir, bu nedenle morfolojileri farklı olabilir.

Kök hücreleri sıralamak için en yaygın kullanılan yöntemler akış sitometrisi ve immünomanyetik boncuk sıralamasıdır 17,18,19. FACS yöntemi, yüksek hücre saflığı ve geri kazanım oranı ile karakterize edilir, ancak FACS nispeten zaman alıcı ve pahalıdır. İmmünomanyetik boncuk ayırma, immünoloji, hücre biyolojisi ve manyetik mekanik teorilerini entegre eden oldukça spesifik bir hücre sıralama teknolojisidir. Bu yöntem basit ve hızlıdır ve 2 saat içinde tamamlanabilir. Farklı hücre sıralama yöntemleri hücre saflığını ve verimini etkiler²⁰. Önceki raporlara^{benzer şekilde}, bu deneyde kullanılan sıralama manyetik boncukları sadece 50 nm çapındadır, bu da hücreler üzerinde nispeten daha az mekanik basınç uygular ve hücre hasarına neden olmaz ve sıralanmış hücrelerin biyolojik aktivitesini etkilemez. Ek olarak, literatürde^{bildirilen ayırma} yönteminden farklı olarak, genellikle bir T75 şişesindeki hücre sayısının en az 1 × 10^7'ye ulaşabildiği ve hücre çoğalmasının aktif olduğu 5 nesil boyunca geçişten sonra hücreleri tasnif ediyoruz. Ayrıca, sıralanan hücreler 3-5 pasaj için kültürlendikten sonra, saflaştırma protokolünü tekrarlamak ve kültür ve pasajlar sırasında otomatik farklılaşmanın olup olmadığından emin olmak çok önemlidir.

VW-SC'lerin alt kültürü sırasında, FBS'nin VW-SC'lerin proliferasyonunu teşvik ettiği ve LIF'in hücre farklılaşmasını inhibe ettiği ve kök hücrelerin genişlemesini desteklediği% 0.2 LIF içeren DMEM yüksek glikoz ortamı kullanılır. Mevcut çalışma¹¹ ile uyumlu olarak, düşük yoğunluklu kültür, VW-SC'lerin saplılığının korunmasını desteklemektedir ve geçişlerle kendi kendine farklılaşma olasılığı artmaktadır. Ayrıca, kültür sırasında serum seçimi de çok önemlidir, çünkü bazı serumlar potansiyel olarak hücrenin kendi kendine farklılaşmasını indükleyecek ve biyolojik özellikleri etkileyecektir¹⁰.

Ca^{2 +}, hücre kasılması, göç, gen ekspresyonu, hücre büyümesi ve apoptoz⁹ dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonları kontrol eden önemli bir ikinci habercidir. Önceki raporlarda⁸, CD34⁺ VW-SC'lerin temel özelliklerini yalnızca kısaca tanımlarken, bu çalışmada, sırasıyla ATP, kafein ve TG tarafından tetiklenen iç kalsiyum depolarından Ca²⁺ salınımını ve hücre dışı Ca²⁺ akışını daha fazla tespit ettik. ATP, yalnızca hücreler içindeki ana enerji para birimi olarak kabul edilmekle kalmayıp aynı zamanda bir verici/sinyal molekülü olarak da işlev gören bir nükleotiddir. ATP, SR'den IP₃Rs aracılı Ca²⁺ salınımını aktive eder ve birden fazla aşağı akış hedefinin aktivitesini düzenler. Bu nedenle, ATP'ye hücresel yanıt, hücre^22'nin fonksiyonel durumunu yansıtabilir. Kafein, RyR'lerin aracılı hücre içi Ca^{2 +} salınımını incelemek için uzun süredir farmakolojik bir prob olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, hem ATP hem de kafein hücre içi Ca^{2 +} 'yı hızla arttırdı ve yüksek hücre içi Ca^{2 +} 1 dakika içinde yavaş yavaş taban çizgisine düştü. Ayrıca, SOCE, uyarılmayan ve kısmen uyarılabilir hücrelerin çoğunda bulunur. Bu çalışmada, TG, SR'de Ca^{2 +} tükenmesini indüklemek ve dış Ca^{2 +} akışına aracılık etmek için CD34 ⁺ VW-SC'lerdeki Ca 2⁺ -ATP enzimini baskılamaktadır²³. CD34⁺ VW-SC'lerde ATP, kafein ve TG'nin hücre içi Ca²⁺ üzerindeki etkisi, önceki çalışmalarda bildirilen diğer hücrelerle^{tutarlıdır 24,25}, bu çalışmada izole edilen CD34⁺ kök hücrelerin normal hücre içi Ca²⁺ salınımına ve dış Ca²⁺ akış sinyal özelliklerine sahip olduğunu düşündürmektedir.

Bu çalışmada, fare aort ve mezenterik arterlerinden elde edilen fonksiyonel CD34⁺ VW-SC'ler etkili bir şekilde kültürlenmiştir. VW-SC'lerin incelenmesi, vasküler yeniden şekillenme mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Daha fazla belirteç içeren protokollerin geliştirilmesi ve CD34⁺ VW-SC'lerin fonksiyonel çalışmaları, bu hücrelerin kardiyovasküler hastalıktaki rolünü daha da tanımlayacaktır. Hücre saflaştırma, organ gelişimi ve büyümesinin hücresel ve genetik temellerini araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder. MACS saflaştırması, hücre zenginleştirmesini rafine etmek için uygun bir yöntem olma avantajını sunar. RNA dizileme analizi gibi diğer tekniklerle birleştirildiğinde, hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda kök hücre çoğalması, göçü ve farklılaşmasının altında yatan yeni mekanizmaları ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir¹². Bu yaklaşım, biyolojik faktörlerin, hücre dışı matris bileşenlerinin ve kök hücrelerin temel işlevlerini destekleyen veya inhibe eden küçük moleküllerin sistematik olarak taranmasını kolaylaştırır. Bu tür çalışmaların yürütülmesi, işlev kaybı ve işlev kazanımı deneyleri yapmak için benzersiz fırsatlar sunar ve sonuçta kardiyovasküler hastalıkların genetik temelinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur. Bu yöntemde de bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, vasküler duvardaki CD34⁺ hücrelerinin fenotipik ve fonksiyonel heterojenliği nedeniyle, yerleşik vasküler CD34⁺ hücrelerinin spesifik subselüler tipini tanımlamak için daha fazla belirteçlere ihtiyaç duyacaktır.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070502, 31972909, 32171099), Sichuan Eyaleti Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (23NSFSC0576, 2022YFS0607) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir. Yazarlar, hücre kültürüne yardımcı olduğu için Zhejiang Üniversitesi'nden Qingbo Xu'ya teşekkür etmek istiyor ve yazarlar, Southwest Tıp Üniversitesi'ndeki akış sitometrisi platformunun bilimsel ve teknik yardımını kabul ediyor.