בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34⁺ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34⁺ (CD34⁺ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.

תאי גזע ותאי אב תושבי CD34⁺ שוכנים בדופן כלי הדם (VW-SCs) מוכרים יותר ויותר בזכות תפקידם המכריע בוויסות פגיעה ותיקון כלי דם. הקמת שיטה יציבה ויעילה לתרבית תפקודית של תאים מסוג CD34⁺ VW-SCs חיונית להמשך חקירת המנגנונים המעורבים בהתפשטות, נדידה והתמיינות של תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. השיטה המתוארת משלבת סינון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה לטיהור תושבות ראשוניות CD34⁺ פולקסווגן SC. התאים המטוהרים מזוהים לאחר מכן באופן פונקציונלי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיית Ca²⁺ . בקצרה, תאים וסקולריים מן adventitia של אבי העורקים murine ועורק mesenteric מתקבלים באמצעות חיבור בלוק רקמות, ואחריו subculturing עד להגיע לספירת תאים של לפחות 1 × 10⁷. לאחר מכן, CD34⁺ VW-SCs מטוהרים באמצעות מיון חרוזים מגנטיים וציטומטריית זרימה. זיהוי של CD34⁺ VW-SCs כרוך בצביעת אימונופלואורסצנטיות תאית, בעוד שריבוי עוצמה תפקודית נקבעת על ידי חשיפת תאים למדיום תרבית ספציפי לצורך התמיינות מכוונת. יתר על כן, שחרור Ca²⁺ פנימי פונקציונלי וכניסת Ca²⁺ חיצונית מוערכים באמצעות תחנת עבודה הדמיה זמינה מסחרית בתאים עמוסי Fura-2/AM שנחשפו ל- ATP, קפאין או תפסיגרגין (TG). שיטה זו מציעה טכניקה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וזיהוי תאי גזע CD34⁺ השוכנים בדופן כלי הדם, ומספקת הזדמנות למחקרי מבחנה על מנגנוני הבקרה של VW-SCs וסינון תרופות ממוקדות.

דופן כלי הדם ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות כלי הדם, בוויסות ההומיאוסטטי ובהתקדמות מחלות כלי הדם. בשנים האחרונות, מחקרים רבים חשפו את נוכחותן של שושלות תאי גזע שונות בעורקים. בשנת 2004, קבוצתו של פרופסור צ'ינגבו שו דיווחה לראשונה על קיומם של תאי גזע / אב וסקולריים בפריפריה של דופן כלי הדם הבוגרים, המבטאים CD34, Sca-1, c-kit ו- Flk-1¹. תאי גזע וסקולריים אלה מפגינים התמיינות רב-כיוונית ופוטנציאל התפשטות. בתנאים רגילים, הם נשארים שקטים יחסית; עם זאת, כאשר הם מופעלים על ידי גורמים ספציפיים, הם יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, תאי אנדותל ופיברובלסטים. לחלופין, הם יכולים לווסת את המטריצה perivascular ואת היווצרות microvessel באמצעות אפקטים paracrine כדי לקדם תיקון או שיפוץ של כלי דם פצועים 2,3,4,5,6. לאחרונה, תאי גזע CD34⁺ בדופן כלי הדם נמצאו כממלאים תפקיד בהתחדשות תאי אנדותל לאחר פגיעה בעורק הירך². כתוצאה מכך, הבידוד והכימות של CD34⁺ VW-SCs ובחינת המאפיינים הביולוגיים הבסיסיים של תאי גזע CD34⁺ חיוניים להמשך לימוד מסלולי האותות המעורבים בוויסות של CD34⁺ VW-SCs.

קיימות כיום שיטות שונות להפרדת תאים, כולל טכניקות המבוססות על מאפייני תרבית תאים או תכונות פיזיקליות של תאים כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות, המביאה לתאים ממוינים המכילים תאים רבים שאינם מטרה וטוהר נמוך יחסית 7,8,9,10,11,12 . טכניקה נפוצה נוספת היא מיון תאים פלואורסצנטי/מגנטי. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא מערכת מורכבת עם דרישות טכניות גבוהות, והיא יקרה יחסית, גוזלת זמן רב ועלולה להשפיע על פעילות התאים הממוינים ^13,14. עם זאת, מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) יעיל ונוח יותר, עם קצב התאוששות גבוה ופעילות תאים גבוהה ופחות השפעה על יישומים במורד הזרם⁸. לכן, בפרוטוקול זה, יישמנו MACS כדי לטהר CD34⁺ VW-SCs וזיהינו עוד יותר את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. הקמת שיטות בידוד מבוססות MACS לחקר תאי גזע של דופן כלי הדם תהיה רבת ערך. ראשית, הוא מאפשר ניסויים גנטיים וביולוגיים של התא. שנית, בידוד יעיל ותרבית של תאי גזע השוכנים בדופן כלי הדם מאפשרים הערכה שיטתית וסינון של גורמי איתות המווסתים את תפקודי תאי הגזע. שלישית, זיהוי פנוטיפים חיוניים בתאי גזע מספק "בקרת איכות" חשובה בהערכת מצב התא. לפיכך, זיהוי שיטות לטיהור יכול להיות שימושי עבור יישומים דומים לתאי גזע מקבילים שמקורם בכלי דם.

דוח זה מספק הדגמה מפורטת של שיטה יציבה ואמינה לתרבית של CD34⁺ VW-SCs, כולל זיהוי תאים והערכה תפקודית המבוצעת על ידי ציטומטריית זרימה, צביעה אימונופלואורסצנטית ומדידת איתות Ca²⁺ . מחקר זה מספק בסיס למחקר מעמיק נוסף על תפקודם של CD34⁺ VW-SCs ומנגנוני הבקרה שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU2020664). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בריאים בני שמונה שבועות משני המינים, במשקל שבין 18-20 גרם. בעלי החיים שוכנו במרכז חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט (SWMU).

1. תרבית בלוק רקמות של adventitia מאבי העורקים ועורקים mesenteric

1. בידוד תושב CD34⁺ פולקסווגן SC
   1. מרדימים שני עכברים עם שאיפת איזופלורן 3% (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). יש לוודא הרדמה מספקת על ידי צביטת בוהן. מקמו את העכבר בשכיבה בעזרת סרט רפואי וריססו חומר חיטוי אתנול 70% לחיטוי פרוות העכבר. פתח את חללי החזה והבטן באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים כדי לחשוף את הלב והמעיים. לאחר ניתוח אבי העורקים והעורקים המזנטריים המבודדים, נעצו את אבי העורקים והמצע המזנטרי בצלחת פטרי המכילה אלסטומר סיליקון וממולאת בתמיסת מלח פיזיולוגית. עם קבוצה נוספת של מספריים מעוקרים ומלקחיים, לנתח במהירות את השומן סביב אבי העורקים עורקים mesenteric.
   2. מעבירים את הרקמות המנותחות לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה תמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B (ראו טבלת חומרים). לאחר שטיפה פעמיים, מעבירים את העורקים למכסה מנוע של תרבית רקמה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   3. חתכו את העורקים לאורכם והשתמשו במלקחיים עדינים כדי לקלף את השכבה החיצונית של אבי העורקים ואת הענף הראשון של העורקים המזנטריים. מעבירים את השכבות החיצוניות לצלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ המכילה 0.1-0.2 מ"ל מדיום תרבית (ראו טבלת חומרים). חותכים את השכבות החיצוניות לחתיכות זעירות (כ-1 מ"מ³).
   4. מעבירים את חתיכות הרקמה לצלוחית T25 מצופה ג'לטין, ומבטיחים פיזור אחיד בתחתית הצלוחית. שמור על מרחק מתון בין חלקי הרקמה כדי להקל על זחילת התאים וצמיחה. מניחים את הבקבוק במאונך באינקובטור (37°C, 5% CO₂) למשך 3 שעות כדי לאפשר לגושי הרקמה להיצמד לתחתית הצלוחית.
   5. לאחר 3 שעות, להוסיף 5 מ"ל של DMEM גבוה גלוקוז צמיחה בינוני כדי לטבול את בלוקים רקמות. כיוון את בקבוק T25 אופקית. עקוב אחר נדידת תאים סביב גושי רקמות באמצעות מיקרוסקופ במרווחים של 3 ימים.
      הערה: המדיום צריך להכיל 20% נסיוב בקר עוברי, 0.2% גורם מעכב לוקמיה (LIF), 0.2 mM β-Mercaptoethanol, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלה של חומרים). סרום בקר עוברי תומך בהתרבות תאים, בעוד LIF ו-β-Mercaptoethanol מעכבים התמיינות תאים ^7,8.
   6. כאשר התאים בבקבוק T25 מגיעים לכ-80% מפגש, יש לעבור ולתרבת אותם לצלוחית T75 אחת או שתיים. תרבית משנה של התאים על פני חמישה מעברים כדי להבטיח גדילה תקינה ובריאות.
2. הפרדה מגנטית של תאי גזע תושבי CD34⁺
   1. כאשר התאים בצלוחיות T75 אחת או שתיים מגיעות למפגש של 80%, נתק את התאים עם טריפסין, והשהה אותם מחדש ב -1 מ"ל של חיץ מיון (2 mM EDTA ו- 0.5% FBS). קבע את מספר התא (10⁷/T75 צלוחיות) וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם למשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר).
   2. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את גלולת התא ב-98 מיקרוליטר של חיץ מיון לכל 10⁷ תאים בסך הכל. הוסף נוגדן CD34 2 μL (ראה טבלת חומרים). יש לערבב היטב ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך עם רעידות מדי פעם.
   3. לשטוף תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ מיון וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הסר את supernatant בזהירות ולחלוטין, ו resuspend את התאים ב 80 μL של חיץ מיון.
   5. הוסף 20 μL Anti-FITC MicroBeads (לכל 10⁷ תאים סה"כ, ראה טבלת חומרים) לתוך המאגר. יש לערבב היטב על ידי פיפטינג חוזר ונשנה ולדגור במשך 15 דקות בחום של 4°C בחושך עם ניעור לסירוגין.
   6. שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות כדי לדחות תאים. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ.
   7. מקם עמודת MS אחת בתוך השדה המגנטי של מפריד מתאים, וודא שצינור איסוף (למשל, צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל) ממוקם מתחת לעמודת MS כדי לאסוף את הרכיבים המופרדים. (ראה טבלת חומרים). שטפו את העמוד עם חיץ של 500 μL והמתינו עד שהוא יעבור לחלוטין.
   8. טען את תרחיף התא לתוך העמודה ואסוף את הזרימה המכילה תאים לא מסומנים לתוך צינור 15 מ"ל.
   9. הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הכנס 500 μL של מאגר לתוך העמודה, ולאחר מכן שטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפת הבוכנה לתוך העמודה.
   10. כדי לשפר את הטוהר של תאי CD34⁺ , החלק המדולל יכול לעבור העשרה באמצעות עמודת MS שנייה. חזור על תהליך ההפרדה כאמור לעיל. להעריך את טוהר התאים הממוינים באמצעות ציטומטריית זרימה.
       הערה: בדרך כלל, 10%-20% CD34⁺ תאים מתקבלים, עם סביב 70%-80% תאים שליליים, וכ 10% אובדן עקב צביעה וצנטריפוגות הליכים.
   11. כדי לאשר עוד יותר את הטוהר של תאי גזע CD34⁺ דופן כלי הדם, לזהות את התאים ממוינים על ידי ציטומטריית זרימה. המחקר הנוכחי הראה טוהר של יותר מ-90%.

2. זיהוי תאים על ידי immunofluorescence

1. תאי זרעים על גבי כיסויים (קוטר 8 מ"מ) מצופים מראש ב-0.04% ג'לטין.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 60%-70%, שטפו פעמיים עם PBS וקיבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות.
3. שטפו תאים עם PBS במשך 3 דקות (3 פעמים), וחדרו את התאים עם 0.2% Triton X-100 (ב-PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. יש לשטוף תאים עם PBS למשך 3 דקות (3 פעמים), ולחסום את הקישור הלא ספציפי של הנוגדנים עם סרום חמור 5% (ב-PBS) למשך שעה אחת.
5. הסר את המאגר החוסם על ידי החזקת כל מכסה על קצהו עם מלקחיים וניקוז אותו על יריעה של ניגוב ללא מוך.
6. לדגור על התאים בנוגדנים ראשוניים מדוללים פי 100 (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, ראו טבלת חומרים) ב-1% BSA (ב-PBS) למשך הלילה ב-4°C.
7. דקרו את התמיסה ושטפו את התאים עם PBS במשך 3 דקות (3 פעמים). יש לדגור על התאים עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 (1:200 ב-1% BSA) (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.
8. בצע צביעה נגדית של DAPI על ידי דילול תמיסת מלאי DAPI ל- 0.5 מיקרוגרם/מ"ל ב- PBS ותאי דגירה למשך 5 דקות.
9. יש לשטוף עם PBS ולאטום את הכיסויים עם מגיב נגד דהייה. צלם תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

3. בידול מושרה ואפיון של CD34⁺ פולקסווגן SC

1. זרע CD34⁺ תאי גזע בצפיפות מתאימה (40%-50% מפגש) על כיסויים וצלחות 6 בארות, בהתאמה.
2. השראת התמיינות מונחית תאי אנדותל מתאי CD34⁺ על ידי תרבית תאים בתרבית תאי אנדותל בינונית EBM-2 (ראה טבלת חומרים) למשך שבוע אחד.
3. השראת התמיינות מונחית תאי פיברובלסט מתאי CD34⁺ על ידי תרבית תאים בתרבית תאים פיברובלסטים בינונית FM-2 (ראה טבלת חומרים) למשך 3 ימים.
4. יש להכפיף את התאים הבלתי ממוינים והממוינים לצביעת אימונופלואורסצנטיות (כפי שהוזכר בשלב 2) בעירור לייזר של 488 ננומטר ומטרה של פי 40. זיהוי ביטוי של סמני תאי אנדותל (CD31, VWF) וסמנים של תאי פיברובלסט (PDGFRα, Vimentin) (ראה טבלת חומרים).
5. נתק את התאים עם טריפסין ולקבל את גלולת התא על ידי צנטריפוגה (300 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר). תאים מושהה מחדש עם 100 μL של מאגר מיון. יש לדגור מראש על תרחיף התא עם CD16/CD32 mAb מטוהר נגד עכבר (1 מיקרוגרם) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות.
6. הוסף 2 μL של PE Rat נגד עכבר CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) נוגדן חד-שבטי APC (2 μL, 1:50) ו- CD140a (PDGFRa) נוגדן חד-שבטי FITC (2 μL, 1:50) ישירות לתאים מודגרים מראש בנוכחות Mouse Fc Block ודגרה נוספת ב- 4 ° C למשך 15 דקות.
7. שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות (טמפרטורת החדר) כדי לדחות את התאים. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את התאים ב-300 מיקרוליטר של חיץ. הכניסו צינורות זרימה עם תאים מוכתמים לקופסת קרח מוכנה לציטומטריית זרימה.

4. זיהוי איתות תוך תאי Ca²⁺ בתאי גזע CD34+ וסקולריים

1. תאי זרעים על כיסויים 10 שעות לפני ניסויים בצפיפות של עד 70% מפגש.
2. הוציאו את הכיסויים והדביקו אותם לתחתית תא מותאם אישית עם כל ג'לי נפט.
3. שטפו את הכיסויים פעם אחת עם PBS, החליפו בפורה-2/AM (5 מיקרומטר) בתמיסה של Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, MgCl₂ 1.2 mM, גלוקוז 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2.4 mM) (ראה טבלת חומרים), ודגרו על תאים למשך 30 דקות בחושך.
4. הסר את הצבע על ידי טיפול עם הפתרון של Tyrode במשך 10 דקות כדי לאפשר fura-2/AM de-esterification.
5. הרכיבו את התא על במה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במערכת הדמיה רחבת שדה המכילה מונוכרומטור ומצלמת CCD (ראו טבלת חומרים).
6. פתח את החלון הראשי, עבור אל תיבת הדו-שיח תפוס הגדרות ודף מצלמה ולחץ על הלחצן החי לתצוגת תמונה חיה .
7. בחר את סוג התמונה הפלואורסצנטית, הגדר את זמני החזרה על לולאה של 340 ננומטר/380 ננומטר, גודל התמונה וזמן החשיפה של המצלמה ל- 380 ננומטר ו- 340 ננומטר כדי להשיג בהירות תמונה מיטבית.
8. צלם תמונות בודדות וצייר מספר קווים חופשיים כדי להקיף את התאים בצבעים שונים ולהגדיר מראש אזור עניין (ROIs), תוך ציון הרקע כ- ROI 0.
9. ערוך מחדש פרוטוקול שכבר מוטבע בתצוגת סביבת העבודה וצור סביבת עבודה חדשה.
10. הפעל את הפרוטוקול, וה- "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" יציג את הגרף הקינטי המקוון.
11. בתצוגה המספרית, גיליון אלקטרוני יהיה גלוי, המציג עמודות של ערכים בקנה מידה אפור ומידע זמן מתאים. יצא את נתוני הגיליון האלקטרוני באמצעות הלוח.
12. חשב F340 nm/F380 nm המציין שינויים תוך-תאיים Ca²⁺ לאחר הפחתת פלואורסצנטיות הרקע (ROI 0).

בידוד וטיהור של CD34⁺ VW-SCs
טוהר גבוה של CD34⁺ VW-SCs מתקבל מן adventitia של העכבר אבי העורקים עורק mesenteric על ידי חיבור רקמות ומיון microbead מגנטי. אחוז תאי CD34⁺ בדופן כלי הדם הוא בדרך כלל 10%-30%. ציטומטריית זרימה מאשרת שהטוהר של תאי CD34⁺ המתקבל על-ידי מיון חרוזים מגנטי הוא יותר מ-90% (איור 1A). צביעת אימונופלואורסנציה תאית מראה כי CD34⁺ VW-SCs מבטאים בעיקר CD34, c-kit, Flk-1 ו- Ki-67, עם ביטוי נמוך יחסית של Sca-1 (איור 1B).

בידול של CD34⁺ VW-SCs
CD34⁺ VW-SCs מסוגלים להתמיין לתאי אנדותל ופיברובלסטים במבחנה. CD34⁺ תאי גזע יכולים להיות מושרים להתמיין לתאי אנדותל עם ביטוי מוגבר של סמנים תאי אנדותל CD31 ו- VWF. נוסף על כך, תאי הפיברובלסטים המתמיינים הראו מורפולוגיה של ציר ארוך וביטוי מוגבר של סמני פיברובלסטים PDGFRα ווימנטין (איור 2A,B). יתר על כן, ציטומטריית זרימה גם אישרה את יכולת ההתמיינות של התאים; אחוז תאי האנדותל CD34⁺CD31⁺ לאחר התמיינות גדל פי 1.5 בהשוואה לתאים הלא ממוינים (איור 2C), ואחוז תאי הפיברובלסטים CD34⁺PDGFRa⁺ לאחר התמיינות גדל פי 1.7 בהשוואה לתאים הלא ממוינים (איור 2D).

אפיון איתות Ca+^{Ca 2} בדיסקווגן CD34⁺ פולקסווגן-SC
מתן חוץ-תאי של ATP (10 מיקרומטר) הגביר את רמת Ca²⁺ התוך-תאית דרך מסלול האות בתיווך קולטני G-protein-coupled receptors (GPCR), ו-thapsigargin (TG) עיכב רשתית סרקופלזמית (SR) Ca²⁺ ATPase (SERCA) כדי לרוקן את מאגרי SR Ca²⁺ התוך-תאיים וגרם לכניסת סידן המופעלת על ידי חנות (SOCE). יתר על כן, קפאין עורר את השחרור המוגבר [Ca²⁺]i על-ידי הפעלת שחרור Ca²⁺ בתיווך קולטני ריאנודין (RyRs) (איור 3).

איור 1: VW-SCs CD34⁺ שנקטפו על-ידי תרבית רקמות ומיון תאים מופעלים מגנטית (MACS). (A) הערכה ציטומטרית של CD34⁺ פולקסווגן מטוהרים. (B) תמונות מייצגות המציגות את הביטוי של סמני תאי גזע CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 וסמן התפשטות תאים (Ki-67). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זיהוי יכולת התמיינות רב-כיוונית של CD34⁺ VW-SCs. (A) תמונות מייצגות המציגות את הביטוי של סמני אנדותל CD31 ו-VWF, וסמני פיברובלסט PDGFRα ווימנטין ב-CD34⁺ VW-SCs לפני התמיינות. (B) תמונות מייצגות המציגות את הביטוי של סמני אנדותל CD31 ו-VWF, וסמני פיברובלסט PDGFRα ווימנטין ב-CD34⁺ VW-SCs לאחר בידול. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. סרגל קנה המידה המוכנס הוא 10 מיקרומטר. (C) אחוז תאי אנדותל CD34^+CD31+ לפני ואחרי התמיינות נמדד על ידי ציטומטריית זרימה. (D) אחוז תאי הפיברובלסטים CD34⁺PDGFRa⁺ לפני ואחרי התמיינות שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אות Ca²⁺ תוך-תאי ב-CD34⁺ VW-SCs. (A) עקומה מייצגת מראה את ההשפעה של ATP (10 מיקרומטר) על איתות Ca²⁺ תוך-תאי. (B) עקומה מייצגת מראה שחרור תוך-תאי של Ca²⁺ המושרה על ידי TG (1 μM) ממאגר SR ואת זרם Ca²⁺ החוץ תאי שנגרם לאחר מכן על ידי דלדול Ca²⁺ לאחר הוספה מחדש של 2 mM Ca²⁺. (C) עקומה מייצגת המציגה איתות Ca²⁺ תוך-תאי המופעל על ידי קפאין (10 mM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מחקר זה מספק שיטה מהירה ונוחה להשגת CD34⁺ פולקסווגן SCs פונקציונליים מאבי העורקים והעורקים המזנטריים של עכברים. CD34⁺ פולקסווגן SC המתקבלים בשיטה זו הם בעלי פעילות שגשוג ותכונות בידול רב-כיווניות. קולטני טריפוספט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP₃Rs), קולטני ריאנודין (RyRs) ותעלות סידן המופעלות בחנות מתווכים שחרור וכניסה של Ca²⁺ ב- CD34⁺ פולקסווגן-SC. הקמת טכניקה זו תניח את הבסיס לחקירה נוספת של המנגנונים המעורבים CD34⁺ פולקסווגן SCs המשתתפים שיפוץ מבני ופונקציונלי במחלות לב וכלי דם.

השיטות הנפוצות ביותר לבידוד תאים ראשוני כוללות חיבור בלוק רקמות ודיסוציאציה אנזימטית^15,16. בדו"ח הנוכחי, חיבור בלוק רקמות ומיון חרוזים מגנטיים משולבים כדי להשיג טוהר גבוה של CD34⁺ פולקסווגן SCs. תאי הגזע של דופן כלי הדם הממוינים CD34⁺ חיוביים ל- CD34, ומעטים מבטאים את סמן תאי האנדותל CD31, העולה בקנה אחד עם דו"ח קודם². כמו כן, Jiang et ^al.2, באמצעות ריצוף חד-תאי של תאי עורק הירך שבודדו לאחרונה בעכברים, מצאו כי CD34 התבטא בעיקר באוכלוסיית תאי האנדותל והמזנכימליה ולא באוכלוסיית תאי השריר החלקל. ניסויים in vivo גם מאשרים כי CD34⁺ VW-SCs יכולים להתמיין לתאי אנדותל כדי להשתתף בתיקון כלי דם לאחר פציעה. מכיוון שפולקסווגן SCs הם הטרוגניים, ל- CD34⁺ VW-SCs הממוינים בשיטה זו, יחד עם סמנים חיוביים אחרים של תאי גזע כגון Flk-1, c-kit ו- Sca-1, יש תת-אוכלוסיות שונות, כך שהמורפולוגיה שלהם עשויה להיות שונה.

השיטות הנפוצות ביותר למיון תאי גזע הן ציטומטריית זרימה ומיון חרוזים אימונומגנטי 17,18,19. שיטת FACS מאופיינת בטוהר תאים גבוה ובשיעור התאוששות, אך FACS גוזלת זמן ויקרה יחסית. הפרדת חרוזים אימונומגנטית היא טכנולוגיית מיון תאים ספציפית ביותר המשלבת את התאוריות של אימונולוגיה, ביולוגיה של התא ומכניקה מגנטית. שיטה זו פשוטה ומהירה וניתן להשלים אותה תוך שעתיים. שיטות מיון תאים שונות משפיעות על טוהר התא ומניבות²⁰. בדומה לדיווחים קודמים²¹, קוטר החרוזים המגנטיים למיון שנעשה בהם שימוש בניסוי זה הוא 50 ננומטר בלבד, מה שמפעיל לחץ מכני קטן יחסית על התאים ואינו גורם נזק לתאים ומשפיע על הפעילות הביולוגית של תאים ממוינים. בנוסף, בניגוד לשיטת ההפרדה המדווחת בספרות⁸, אנו בדרך כלל ממיינים תאים לאחר שעברו במשך 5 דורות, כאשר מספר התאים בבקבוק T75 יכול להגיע לפחות 1 × 10⁷, והתפשטות התאים פעילה. יתר על כן, לאחר שתאים ממוינים מתורבתים במשך 3-5 מעברים, חיוני לחזור על פרוטוקול הטיהור ולוודא אם קיימת התמיינות אוטומטית במהלך התרבית והמעברים.

במהלך תת-התרבות של פולקסווגן-SCs, נעשה שימוש במדיום גלוקוז גבוה DMEM עם 0.2% LIF, שבו FBS מקדם את התפשטות פולקסווגן SCs, ו- LIF מעכב התמיינות תאים ותומך בהרחבת תאי גזע. בהסכמה עם המחקר הקיים¹¹, תרבות צפיפות נמוכה מעדיפה שמירה על גזע של פולקסווגן-SCs, ואת האפשרות של דיפרנציאציה עצמית עולה עם מעברים. יתר על כן, בחירת הסרום במהלך התרבית היא גם קריטית מכיוון שחלק מהסרום עלול לגרום להתמיינות עצמית של התאים וישפיע על המאפיינים הביולוגיים¹⁰.

Ca²⁺ הוא שליח שני מרכזי השולט בתפקודים תאיים שונים, כולל התכווצות תאים, נדידה, ביטוי גנים, גדילת תאים ואפופטוזיס⁹. דוחות קודמים⁸ תיארו רק בקצרה את המאפיינים הבסיסיים של CD34⁺ VW-SCs, ואילו במחקר זה, זיהינו עוד יותר את שחרור Ca²⁺ ממאגרי סידן פנימיים ואת זרם Ca²⁺ החוץ תאי המופעל על ידי ATP, קפאין ו- TG, בהתאמה. ATP הוא נוקלאוטיד שלא רק נחשב למטבע האנרגיה העיקרי בתוך התא, אלא גם פועל כמולקולת משדר/איתות. ATP מפעיל שחרור מתווך של IP₃Rs Ca²⁺ מה-SR ומווסת את הפעילות של מטרות מרובות במורד הזרם. לכן, התגובה התאית ל-ATP עשויה לשקף את המצב התפקודי של התא²². קפאין משמש מזה זמן רב כבדיקה פרמקולוגית לחקר שחרור Ca²⁺ תוך-תאי בתיווך RyRs. במחקר זה, גם ATP וגם קפאין הגדילו במהירות את Ca²⁺ התוך-תאי, והרמה התוך-תאית Ca²⁺ ירדה לאט לקו הבסיס תוך דקה אחת. יתר על כן, SOCE קיים ברוב התאים שאינם מעוררים ומעוררים חלקית. במחקר הנוכחי, TG מדכא את האנזים Ca²⁺-ATP ב- CD34⁺ VW-SCs כדי לגרום לדלדול Ca²⁺ ב- SR ולתווך זרם Ca²⁺ חיצוני²³. ההשפעה של ATP, קפאין ו-TG על Ca²⁺ תוך-תאי ב-CD34⁺ VW-SCs עולה בקנה אחד עם תאים אחרים שדווחו במחקרים קודמים^24,25, מה שמצביע על כך שלתאי הגזע CD34⁺ שבודדו במחקר זה יש שחרור תוך-תאי תקין של Ca²⁺ ותכונות איתות זרימה חיצוניות של Ca²⁺.

במחקר זה, CD34⁺ פולקסווגן SC פונקציונלי מאבי העורקים של עכבר ועורקים mesenteric הם בתרבית יעילה. המחקר של פולקסווגן SCs עשוי לספק תובנות משמעותיות לגבי המנגנונים של עיצוב מחדש של כלי הדם. פיתוח פרוטוקולים עם סמנים נוספים ומחקרים פונקציונליים של CD34⁺ VW-SCs יגדיר עוד יותר את תפקידם של תאים אלה במחלות לב וכלי דם. טיהור תאים משמש ככלי רב עוצמה להתעמקות ביסודות התאיים והגנטיים של התפתחות וצמיחת איברים. טיהור MACS מציג את היתרון של היותו שיטה נוחה לזיקוק העשרת תאים. בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון ניתוח ריצוף RNA, יש לו פוטנציאל לחשוף מנגנונים חדשים העומדים בבסיס התפשטות תאי גזע, נדידה והתמיינות בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד¹². גישה זו מאפשרת סינון שיטתי של גורמים ביולוגיים, רכיבי מטריצה חוץ-תאיים ומולקולות קטנות המקדמות או מעכבות את התפקודים הבסיסיים של תאי גזע. ביצוע מחקרים כאלה פותח הזדמנויות ייחודיות לביצוע ניסויים של אובדן תפקוד ורווח של תפקוד, ובסופו של דבר תורם להבנה עמוקה יותר של הבסיס הגנטי של מחלות לב וכלי דם. יש גם כמה מגבלות בתוך שיטה זו. לדוגמה, בשל ההטרוגניות הפנוטיפית והתפקודית של תאי CD34⁺ בדופן כלי הדם, הוא יזדקק לסמנים נוספים כדי לזהות את הסוג התת-תאי הספציפי של תאי CD34⁺ וסקולריים תושבים.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82070502, 31972909, 32171099), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן של מחוז סצ'ואן (23NSFSC0576, 2022YFS0607). המחברים רוצים להודות לצ'ינגבו שו מאוניברסיטת ג'ג'יאנג על העזרה בתרבית התא, והמחברים מודים על הסיוע המדעי והטכני של פלטפורמת ציטומטריית הזרימה באוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט.