생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

이 연구는 혈관벽 상주 CD34⁺ 줄기세포(CD34⁺ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

상주 CD34⁺ 혈관벽 상주 줄기 세포(VW-SC)는 혈관 손상 및 복구를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 점점 더 인정받고 있습니다. 기능성 쥐 CD34⁺ VW-SC를 배양하기 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립하는 것은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 이러한 세포의 증식, 이동 및 분화와 관련된 메커니즘을 추가로 조사하는 데 필수적입니다. 설명된 방법은 마그네틱 비드 스크리닝과 유세포 분석을 결합하여 1차 배양 상주 CD34⁺ VW-SC를 정제합니다. 그런 다음 정제된 세포는 면역형광 염색 및 Ca²⁺ 이미징을 통해 기능적으로 식별됩니다. 간략하게, 쥐 대동맥 및 장간막 동맥의 외래에서 혈관 세포는 조직 블록 부착을 통해 얻은 다음 세포 수가 1 × 10⁷ 이상에 도달할 때까지 하위 배양이 이루어집니다. 그 후, CD34⁺ VW-SC는 마그네틱 비드 분류 및 유세포 분석을 사용하여 정제됩니다. CD34⁺ VW-SC의 식별에는 세포 면역형광 염색이 포함되며, 기능적 다능성은 지향적 분화를 위해 세포를 특정 배양 배지에 노출시켜 측정합니다. 또한, ATP, 카페인 또는 탑시가르진(TG)에 노출된 Fura-2/AM 부하 세포에서 상업적으로 이용 가능한 이미징 워크스테이션을 사용하여 기능적 내부 Ca²⁺ 방출 및 외부 Ca²⁺ 진입을 평가합니다. 이 방법은 혈관벽 상주 CD34⁺ 줄기 세포를 분리, 배양 및 식별하기 위한 안정적이고 효율적인 기술을 제공하여 VW-SC의 조절 메커니즘 및 표적 약물 스크리닝에 대한 시험관 내 연구를 위한 기회를 제공합니다.

혈관 벽은 혈관 발달, 항상성 조절 및 혈관 질환의 진행에 중추적인 역할을 합니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 동맥에 다양한 줄기 세포 계통이 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 2004년 Qingbo Xu 교수 그룹은 성인 혈관 벽 주변에 혈관 줄기/전구 세포가 존재한다고 처음으로 보고했으며, CD34, Sca-1, c-kit 및 Flk-1¹을 발현했습니다. 이러한 혈관 줄기 세포는 다방향 분화 및 증식 잠재력을 나타냅니다. 정상적인 조건에서는 상대적으로 조용한 상태를 유지합니다. 그러나 특정 요인에 의해 활성화되면 평활근 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포로 분화할 수 있습니다. 대안적으로, 그들은 파라크린 효과를 통해 혈관 주위 기질 및 미세혈관 형성을 조절하여 손상된 혈관의 수리 또는 개조를 촉진할 수 있습니다 2,3,4,5,6. 최근에는 대퇴동맥 가이드와이어 손상 후 혈관벽에 상주하는 CD34⁺ 줄기세포가 내피세포 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다². 결과적으로, CD34⁺ VW-SC의 분리 및 정량화와 CD34⁺ 줄기 세포의 기본 생물학적 특성 검사는 CD34⁺ VW-SC의 조절과 관련된 신호 경로를 추가로 연구하는 데 중요합니다.

현재 세포 배양 특성 또는 밀도 구배 원심분리와 같은 세포의 물리적 특성에 기반한 기술을 포함하여 세포 분리를 위한 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이로 인해 많은 비표적 세포를 포함하는 정렬된 세포와 상대적으로 낮은 순도 7,8,9,10,11,12를 얻을 수 있습니다 . 일반적으로 사용되는 또 다른 기술은 형광/자기 보조 세포 분류입니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 높은 기술적 요구 사항을 가진 복잡한 시스템이며, 상대적으로 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 잠재적으로 분류된 세포의 활성에 영향을 미칩니다^13,14. 그러나 MACS(magnetic-activated cell sorting)는 회수율과 세포 활성이 높고 다운스트림 응용 분야에 미치는 영향이 적어 더 효율적이고 편리합니다⁸. 따라서 이 프로토콜에서는 MACS를 적용하여 CD34⁺ VW-SC를 정제하고 유세포 분석을 통해 세포를 추가로 식별했습니다. 혈관벽 줄기 세포를 연구하기 위한 MACS 기반 분리 방법의 확립은 매우 중요할 것입니다. 첫째, 실험적 유전자 및 세포 생물학 연구를 허용합니다. 둘째, 혈관벽 상주 줄기세포의 효율적인 분리 및 배양은 줄기세포 기능을 조절하는 신호인자에 대한 체계적인 평가와 스크리닝을 가능하게 합니다. 셋째, 줄기세포에서 중요한 표현형을 식별하는 것은 세포 상태를 평가하는 데 중요한 '품질 관리'를 제공합니다. 따라서, 정제 방법을 식별하는 것은 혈관에서 유래한 유사한 줄기 세포에 대한 유사한 응용 분야에 유용할 수 있습니다.

이 보고서는 유세포 분석, 면역형광 염색 및 Ca²⁺ 신호 측정에 의해 수행되는 세포 식별 및 기능 평가를 포함하여 CD34⁺ VW-SC의 배양을 위한 안정적이고 신뢰할 수 있는 방법에 대한 자세한 시연을 제공합니다. 이 연구는 CD34⁺ VW-SC의 기능과 생리학적 및 병리학적 조건에서 조절 메커니즘에 대한 심층적인 연구를 위한 기초를 제공합니다.

이 연구는 승인되었으며, 동물은 중국의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 처리되었습니다. 이 연구는 동물윤리위원회(승인번호: SWMU2020664)의 승인을 받아 동물실험의 윤리적 요건을 철저히 준수하였습니다. 본 연구에는 18-20g 무게의 남녀 8주 된 건강한 C57BL/6 마우스가 활용되었습니다. 동물들은 사우스웨스트 의과대학(SWMU)의 실험동물센터에 수용되었다.

1. 대동맥 및 장간막 동맥에서 외래의 조직 블록 배양

1. 상주 CD34⁺ VW-SC 절연
   1. 3% 이소플루란 흡입으로 두 마리의 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 발가락 꼬집으로 적절한 마취를 확인합니다. 의료용 테이프로 쥐를 누운 위치에 놓고 70% 에탄올 소독제를 뿌려 쥐의 털을 소독합니다. 멸균 안과 가위와 집게를 사용하여 흉강과 복강을 열어 심장과 장을 노출시킵니다. 분리된 대동맥과 장간막 동맥을 절개한 후 대동맥과 장간막 침대를 실리콘 엘라스토머가 들어 있는 페트리 접시에 고정하고 생리학적 염 용액으로 채웁니다. 다른 멸균 된 가위와 겸자 세트를 사용하여 대동맥과 장간막 동맥 주변의 지방을 빠르게 절개하십시오.
   2. 절개된 조직을 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액이 포함된 6cm 페트리 접시에 옮깁니다( 재료 표 참조). 두 번 헹군 후 동맥을 실체 현미경으로 조직 배양 후드로 옮깁니다.
   3. 동맥을 세로로 자르고 가는 집게를 사용하여 대동맥의 바깥층과 장간막 동맥의 첫 번째 가지를 벗겨냅니다. 0.1-0.2mL의 배양 배지가 들어 있는 3.5cm 페트리 접시에 외부 층을 옮깁니다( 재료 표 참조). 바깥 층을 작은 조각으로 자릅니다 (약 1mm³).
   4. 티슈 조각을 젤라틴 코팅된 T25 플라스크에 옮겨 플라스크 바닥에 고르게 분포되도록 합니다. 세포 크롤링과 성장을 촉진하기 위해 조직 조각 사이에 적당한 거리를 유지하십시오. 플라스크를 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 수직으로 3시간 동안 놓아 조직 블록이 플라스크 바닥에 부착되도록 합니다.
   5. 3시간 후 5mL의 DMEM 고포도당 성장 배지를 추가하여 조직 블록을 침지시킵니다. T25 플라스크를 수평으로 향하게 합니다. 3일 간격으로 현미경을 통해 조직 블록 주변의 세포 이동을 모니터링합니다.
      참고: 배지에는 소 태아 혈청 20%, 백혈병 억제 인자(LIF) 0.2%, β-메르캅토에탄올 0.2mM 및 페니실린/스트렙토마이신 1%가 포함되어야 합니다(재료 표 참조). 소 태아 혈청은 세포 증식을 지원하는 반면, LIF와 β-메르캅토에탄올은 세포 분화를 방해합니다 ^7,8.
   6. T25 플라스크의 세포가 약 80% 합류에 도달하면 하나 또는 두 개의 T75 플라스크로 통과시켜 배양합니다. 적절한 성장과 건강을 보장하기 위해 5개의 통로에 걸쳐 세포를 하위 배양합니다.
2. 상주 CD34⁺ 줄기 세포의 자기 분리
   1. 하나 또는 두 개의 T75 플라스크에 있는 세포가 80% 합류도에 도달하면 세포를 트립신으로 해리하고 1mL의 선별 완충액(2mM EDTA 및 0.5% FBS)에 재현탁시킵니다. 셀 번호(10⁷/T75 플라스크)를 측정하고 셀 현탁액을 300 x g 에서 5분(실온에서) 동안 원심분리합니다.
   2. 상층액을 완전히 버리고 총 10,7개의 세포당 98μL의 선별 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 2 μL CD34 항체를 추가합니다(재료 표 참조). 잘 섞고 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 가끔 흔들어 배양합니다.
   3. 2mL의 선별 완충액과 300 x g 의 원심분리기를 추가하여 실온에서 10분 동안 세포를 세척합니다.
   4. 상층액을 신중하고 완전하게 제거하고 80μL의 선별 버퍼에 세포를 재현탁시킵니다.
   5. 20 μL Anti-FITC MicroBeads(총 10⁷ 개 세포당, 재료 표 참조)를 완충액에 추가합니다. 반복적인 피펫팅으로 잘 혼합하고 어두운 곳에서 간헐적으로 흔들면서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
   6. 2mL의 완충액과 300 x g 의 원심분리기를 5분 동안 추가하여 세포를 펠릿으로 2회 세척합니다. 상층액을 완전히 버리고 세포를 1mL의 완충액에 재현탁시킵니다.
   7. 적절한 분리기의 자기장 내에 하나의 MS 컬럼을 배치하여 수집 튜브(예: 15mL 원심분리기 튜브)가 MS 컬럼 아래에 배치되어 분리된 성분을 수집하도록 합니다. ( 재료 표 참조). 500μL 버퍼로 컬럼을 헹구고 완전히 통과될 때까지 기다립니다.
   8. 세포 현탁액을 컬럼에 로드하고 라벨링되지 않은 세포가 포함된 플로우스루를 15mL 튜브에 수집합니다.
   9. 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 원심분리기 튜브에 놓습니다. 500μL의 완충액을 컬럼에 주입한 다음 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 자기 라벨이 부착된 세포를 즉시 씻어냅니다.
   10. CD34⁺ 세포의 순도를 향상시키기 위해 용리된 분획은 두 번째 MS 컬럼을 사용하여 농축할 수 있습니다. 위에서 언급한 대로 분리 과정을 반복합니다. 유세포 분석을 통해 분류된 세포의 순도를 평가합니다.
       참고: 일반적으로 10%-20%의 CD34⁺ 세포가 얻어지며 약 70%-80%의 음성 세포와 염색 및 원심분리 절차로 인해 약 10%의 손실이 발생합니다.
   11. 혈관벽 CD34⁺ 줄기 세포의 순도를 추가로 확인하려면 유세포 분석으로 분류된 세포를 식별합니다. 본 연구는 90% 이상의 순도를 보여주었습니다.

2. 면역형광에 의한 세포 동정

1. 0.04% 젤라틴으로 사전 코팅된 커버슬립(직경 8mm)의 종자 세포.
2. 세포가 약 60%-70% 합류점에 도달하면 PBS로 두 번 헹구고 4% 파라포름알데히드로 세포를 10분 동안 고정합니다.
3. PBS로 세포를 3분(3회) 세척하고 실온에서 5분 동안 0.2% Triton X-100(PBS에서)으로 세포를 투과시킵니다.
4. PBS로 세포를 3분(3회) 세척하고 5% 당나귀 혈청(PBS에서)으로 항체의 비특이적 결합을 1시간 동안 차단합니다.
5. 집게로 각 커버슬립의 가장자리를 잡고 보푸라기가 없는 물티슈 시트에 물기를 빼내어 차단 완충액을 제거합니다.
6. 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA(PBS)에 100배 희석된 1차 항체(CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, 재료 표 참조)에 세포를 배양합니다.
7. 용액을 디캔팅하고 PBS로 세포를 3분(3회) 세척합니다. Alexa Fluor 488 라벨이 부착된 2차 항체(1% BSA에서 1:200)( 재료 표 참조)로 어두운 어두운 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
8. PBS에서 DAPI 원액을 0.5μg/mL로 희석하고 5분 동안 세포를 배양하여 DAPI 대조염색을 수행합니다.
9. PBS로 헹구고 페이드 방지 시약으로 커버슬립을 밀봉합니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

3. CD34⁺ VW-SC의 유도 분화 및 특성화

1. CD34⁺ 줄기 세포를 커버슬립과 6-웰 플레이트에 각각 적절한 밀도(40%-50% 합류)로 파종합니다.
2. 내피 세포 배양 배지 EBM-2(재료 표 참조)에서 1주일 동안 세포를 배양하여 CD34⁺ 세포에서 내피 세포 지향 분화를 유도합니다.
3. 섬유아세포 배양 배지 FM-2(재료 표 참조)에서 3일 동안 세포를 배양하여 CD34⁺ 세포에서 섬유아세포 지향 분화를 유도합니다.
4. 미분화 세포와 분화된 세포를 488nm의 레이저 여기와 40x 대물렌즈에서 면역형광 염색(2단계에서 언급)을 실시합니다. 내피 세포 마커(CD31, VWF) 및 섬유아세포 마커(PDGFRα, Vimentin)의 발현을 검출합니다( 재료 표 참조).
5. 세포를 트립신으로 해리시키고 원심분리(300 x g, 5분, 실온)를 통해 세포 펠릿을 얻습니다. 100 μL의 선별 버퍼로 셀을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 정제된 항마우스 CD16/CD32 mAb(1 μg)( 재료 표 참조)로 4°C에서 5분 동안 사전 배양합니다.
6. 2 μL의 PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody APC (2 μL, 1:50) 및 CD140a (PDGFRa) Monoclonal Antibody FITC (2 μL, 1:50)를 Mouse Fc Block이 있는 사전 배양 세포에 직접 첨가하고 4°C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.
7. 2mL의 완충액을 추가하고 300 x g 에서 5분(실온) 동안 원심분리기를 추가하여 세포를 펠렛화하여 세포를 2회 세척합니다. 상층액을 완전히 버리고 300μL의 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 염색된 세포가 있는 플로우 튜브를 유세포 분석을 위해 준비된 아이스박스에 넣습니다.

4. 혈관 CD34⁺ 줄기세포에서 세포내 Ca²⁺ 신호전달 검출

1. 최대 70% 밀도에서 실험하기 10시간 전에 커버슬립의 종자 세포.
2. 커버슬립을 꺼내 바셀린과 함께 맞춤형 챔버 바닥에 부착합니다.
3. PBS로 커버슬립을 한 번 세척하고 Tyrode 용액(NaCl 137mM, KCl 5.4mM, MgCl₂ 1.2mM, 포도당 10mM, HEPES 10mM, CaCl₂ 2.4mM)( 재료 표 참조)에서 Fura-2/AM(5μM)으로 교체하고 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
4. 푸라-2/AM 탈에스테르화를 위해 티로드의 용액으로 10분 동안 처리하여 염료를 제거합니다.
5. 모노크로메이터와 CCD 카메라가 포함된 광시야 이미징 시스템이 장착된 도립 형광 현미경의 스테이지에 챔버를 장착합니다( 재료 표 참조).
6. 메인 창을 열고 Grab Settings 대화 상자와 카메라 페이지로 이동한 다음 라이브 이미지 표시를 위해 라이브 버튼을 누릅니다.
7. 형광 이미지 유형을 선택하고 340nm/380nm 루프 반복 시간, 이미지 크기 및 카메라 노출 시간을 380nm 및 340nm로 설정하여 최적의 이미지 밝기를 얻을 수 있습니다.
8. 단일 스냅샷을 찍고 여러 개의 자유형 선을 그려 다양한 색상으로 셀에 원을 그리며 배경을 ROI 0으로 나타내는 ROI(Region of Interest)를 미리 정의합니다.
9. 작업 영역 보기에서 이미 포함된 프로토콜을 다시 편집하고 새 작업 영역을 만듭니다.
10. 프로토콜을 실행하면 "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)"에 온라인 kinetic graph가 표시됩니다.
11. 숫자 보기에서는 스프레드시트가 표시되어 회색조 값 열과 해당 시간 정보를 표시합니다. 클립보드를 사용하여 스프레드시트 데이터를 내보냅니다.
12. 배경 형광(ROI 0)을 뺀 후 세포 내 Ca²⁺ 변화를 나타내는 F340 nm/F380 nm를 계산합니다.

CD34⁺ VW-SC의 분리 및 정제
CD34⁺ VW-SC의 고순도는 조직 부착 및 자기 마이크로비드 분류를 통해 마우스 대동맥 및 장간막 동맥의 외래에서 얻어집니다. 혈관 벽에서 CD34⁺ 세포의 비율은 일반적으로 10%-30%입니다. 유세포 분석은 자기 비드 분류로 얻은 CD34⁺ 세포의 순도가 90% 이상임을 확인합니다(그림 1A). 세포 면역형광 염색은 CD34⁺ VW-SC가 주로 CD34, c-kit, Flk-1 및 Ki-67을 발현하며 Sca-1의 발현은 상대적으로 낮다는 것을 보여줍니다(그림 1B).

CD34⁺ VW-SC의 차별화
CD34⁺ VW-SC는 in vitro에서 내피세포와 섬유아세포로 분화할 수 있습니다. CD34⁺ 줄기세포는 내피세포 마커 CD31 및 VWF의 발현이 증가하여 내피세포로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 또한, 분화된 섬유아세포 세포는 긴 방추체 형태와 섬유아세포 마커 PDGFRα 및 Vimentin의 발현 증가를 보여주었습니다(그림 2A,B). 또한, 유세포 분석은 세포의 분화 능력도 확인했습니다. 분화 후 CD34⁺CD31⁺ 내피 세포의 비율은 미분화 세포에 비해 1.5배 증가했으며(그림 2C), 분화 후 CD34⁺PDGFRa⁺ 섬유아세포 세포의 비율은 미분화 세포에 비해 1.7배 증가했습니다(그림 2D).

CD34⁺ VW-SC에서 Ca²⁺ 신호의 특성 분석
ATP(10μM)의 세포외 투여는 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 매개 신호 경로를 통해 세포 내 Ca²⁺ 수준을 증가시켰고, 탁시가르진(TG)은 근형질 망상체(SR) Ca²⁺ ATPase(SERCA)를 억제하여 세포 내 SR Ca²⁺ 저장을 고갈시키고 저장 운영 칼슘 진입(SOCE)을 유발했습니다. 또한, 카페인은 리아노딘 수용체(RyRs) 매개 Ca²⁺ 방출을 활성화하여 증가된 [Ca²⁺]i를 자극했습니다(그림 3).

그림 1: 조직 배양 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 수확한 CD34⁺ VW-SC. (A) 정제된 CD34⁺ VW-SC의 유세포 분석성 평가. (B) 줄기세포 마커 CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 및 세포 증식 마커(Ki-67)의 발현을 보여주는 대표 이미지. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: CD34⁺ VW-SC의 다방향 분화 능력 검출. (A) 분화 전 CD34⁺ VW-SC에서 내피 마커 CD31 및 VWF, 섬유아세포 마커 PDGFRα 및 Vimentin의 발현을 보여주는 대표 이미지. (B) 분화 후 CD34⁺ VW-SC에서 내피 마커 CD31 및 VWF, 섬유아세포 마커 PDGFRα 및 Vimentin의 발현을 보여주는 대표 이미지. 스케일 바: 50 μm. 삽입 눈금 막대는 10μm입니다. (C) 유세포 분석으로 측정한 분화 전후의 CD34⁺CD31⁺ 내피 세포의 비율. (D) 유세포분석으로 측정한 분화 전후의 CD34⁺PDGFRa⁺ 섬유아세포 세포의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: CD34⁺ VW-SC의 세포 내 Ca²⁺ 신호. (A) 대표 곡선은 ATP(10μM)가 세포 내 Ca²⁺ 신호에 미치는 영향을 보여줍니다. (B) 대표 곡선은 SR 저장소에서 TG(1μM)에 의해 유도된 세포 내 Ca²⁺ 방출 및 2mM Ca2⁺의 재첨가 후 Ca²⁺ 고갈에 의해 유발된 후속 세포외 Ca²⁺ 유입을 보여줍니다. (C) 카페인(10mM) 활성화 세포 내 Ca²⁺ 신호 전달을 보여주는 대표 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 연구는 마우스의 대동맥 및 장간막 동맥에서 기능적 CD34⁺ VW-SC를 얻는 빠르고 편리한 방법을 제공합니다. 이 방법으로 얻어진 CD34⁺ VW-SC는 증식 활성과 다방향 분화 특성을 갖는다. 트리포스페이트 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체(IP₃Rs), 리아노딘 수용체(RyRs) 및 매장 작동 칼슘 채널은 CD34⁺ VW-SC에서 Ca²⁺ 방출 및 진입을 매개합니다. 이 기술의 확립은 심혈관 질환에서 구조적 및 기능적 리모델링에 참여하는 CD34⁺ VW-SC와 관련된 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 토대를 마련할 것입니다.

일차 세포 분리를 위한 가장 일반적인 방법에는 조직 블록 부착 및 효소 해리가 포함됩니다^15,16. 본 보고서에서는 조직 블록 부착과 마그네틱 비드 분류를 결합하여 CD34⁺ VW-SC의 고순도를 얻습니다. 분류된 혈관벽 CD34⁺ 줄기세포는 CD34에 대해 양성이며, 내피세포 마커 CD31을 발현하는 세포는 거의 없으며, 이는 이전 보고와 일치한다². 또한, Jiang et ^al.2은 생쥐에서 갓 분리한 대퇴 동맥 세포의 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 CD34가 평활근 세포 집단이 아닌 내피 및 중간엽 세포 집단에서 주로 발현된다는 것을 발견했습니다. 또한 생체 내 실험을 통해 CD34⁺ VW-SC가 내피 세포로 분화하여 손상 후 혈관 복구에 참여할 수 있음을 확인했습니다. VW-SC는 이질적이기 때문에 이 방법으로 분류된 CD34⁺ VW-SC는 Flk-1, c-kit 및 Sca-1과 같은 다른 줄기세포 양성 마커와 함께 서로 다른 하위 집단을 가지므로 형태가 다를 수 있습니다.

줄기 세포를 분류하는 데 가장 널리 사용되는 방법은 유세포 분석 및 면역자기 비드 분류 17,18,19입니다. FACS 방법은 세포 순도와 회수율이 높은 것이 특징이지만 FACS는 상대적으로 시간과 비용이 많이 듭니다. 면역자성 비드 분리는 면역학, 세포 생물학 및 자기 역학의 이론을 통합하는 매우 특이적인 세포 분류 기술입니다. 이 방법은 간단하고 빠르며 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 다른 세포 분류 방법은 세포 순도와 수율에 영향을 미칩니다²⁰. 이전 보고서²¹과 유사하게, 이 실험에 사용된 선별 마그네틱 비드는 직경이 50nm에 불과하여 세포에 상대적으로 기계적 압력을 가하지 않고 세포 손상을 일으키지 않으며 분류된 세포의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 문헌⁸에 보고된 분리 방법과는 달리, 일반적으로 T75 플라스크 내의 세포 수가 1 × 10⁷ 이상에 도달할 수 있고 세포 증식이 활성화될 때 5세대 동안 통과한 후 세포를 분류합니다. 또한, 분류된 세포를 3-5개의 passage에 대해 배양한 후에는 정제 프로토콜을 반복하고 배양 및 passages 중에 자동 분화가 존재하는지 확인하는 것이 중요합니다.

VW-SC의 하위 배양 중에는 FBS가 VW-SC의 증식을 촉진하고 LIF가 세포 분화를 억제하고 줄기 세포의 확장을 지원하는 0.2% LIF가 포함된 DMEM 고포도당 배지가 사용됩니다. 기존 연구¹¹과 일치하게, 저밀도 배양은 VW-SC의 줄기성 유지에 유리하며, 자가 분화의 가능성은 통로에 따라 증가한다. 더욱이, 일부 혈청은 잠재적으로 세포 자가 분화를 유도하고 생물학적 특성에 영향을 미치기 때문에 배양 중 혈청의 선택도 중요하다¹⁰.

Ca²⁺는 세포 수축, 이동, 유전자 발현, 세포 성장 및 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 기능을 조절하는 주요 두 번째 전달자입니다⁹. 이전 보고서⁸에서는 CD34⁺ VW-SC의 기본 특성을 간략하게만 설명했지만, 이 연구에서는 내부 칼슘 저장량에서 Ca²⁺ 방출과 ATP, 카페인 및 TG에 의해 유발되는 세포외 Ca²⁺ 유입을 추가로 감지했습니다. ATP는 세포 내의 주요 에너지 통화로 간주될 뿐만 아니라 전달자/신호 분자 역할도 하는 뉴클레오티드입니다. ATP는 SR에서 IP₃Rs 매개 Ca²⁺ 방출을 활성화하고 여러 다운스트림 대상의 활동을 조절합니다. 따라서, ATP에 대한 세포 반응은 세포(²²)의 기능적 상태를 반영할 수 있다. 카페인은 RyRs에 의한 세포 내 Ca²⁺ 방출을 연구하기 위한 약리학적 프로브로 오랫동안 사용되어 왔습니다. 이 연구에서 ATP와 카페인 모두 세포 내 Ca²⁺를 빠르게 증가시켰고, 상승된 세포 내 Ca²⁺는 1분 이내에 기준선까지 서서히 감소했습니다. 또한, SOCE는 대부분의 비흥분성 및 부분적으로 흥분성 세포에 존재합니다. 본 연구에서 TG는 CD34⁺ VW-SC의 Ca²⁺-ATP 효소를 억제하여 SR에서 Ca²⁺ 고갈을 유도하고 외부 Ca²⁺ 유입을 매개합니다²³. CD34⁺ VW-SC에서 ATP, 카페인 및 TG가 세포 내 Ca²⁺에 미치는 영향은 이전 연구에서 보고된 다른 세포와 일치하며^24,25, 이 연구에서 분리된 CD34⁺ 줄기 세포가 정상적인 세포 내 Ca²⁺ 방출 및 외부 Ca²⁺ 유입 신호 특성을 가지고 있음을 시사합니다.

이 연구에서는 마우스 대동맥 및 장간막 동맥의 기능성 CD34⁺ VW-SC를 효율적으로 배양합니다. VW-SC에 대한 연구는 혈관 리모델링 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. CD34⁺ VW-SC에 대한 더 많은 마커와 기능 연구를 통한 프로토콜 개발은 심혈관 질환에서 이러한 세포의 역할을 더욱 정의할 것입니다. 세포 정제는 장기 발달 및 성장의 세포 및 유전적 기초를 탐구하기 위한 강력한 도구 역할을 합니다. MACS 정제는 세포 농축을 정제하는 편리한 방법이라는 장점이 있습니다. RNA 염기서열 분석과 같은 다른 기술과 결합하면 생리학적 및 병리학적 맥락에서 줄기세포 증식, 이동 및 분화의 근간이 되는 새로운 메커니즘을 밝힐 수 있는 잠재력이 있습니다¹². 이 접근법은 생물학적 요인, 세포외 기질 구성 요소 및 줄기 세포의 기본 기능을 촉진하거나 억제하는 소분자의 체계적인 스크리닝을 용이하게 합니다. 이러한 연구를 수행하면 기능 상실 및 기능 이득 실험을 수행할 수 있는 고유한 기회가 열리며, 궁극적으로 심혈관 질환의 유전적 기초를 더 깊이 이해하는 데 기여합니다. 이 방법에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 예를 들어, 혈관 벽에 있는 CD34⁺ 세포의 표현형 및 기능적 이질성으로 인해 상주 혈관 CD34⁺ 세포의 특정 세포 내 유형을 식별하기 위해 더 많은 마커가 필요합니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 중국 국립자연과학재단(No. 82070502, 31972909, 32171099), 쓰촨성 쓰촨성 과학기술프로그램(23NSFSC0576, 2022YFS0607)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자들은 세포 배양에 도움을 준 Zhejiang University의 Qingbo Xu에게 감사의 뜻을 전하며, Southwest Medical University의 유세포 분석 플랫폼의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다.