Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen aus Mäusen

Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen (CD34⁺ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Residente CD34⁺ -Stamm- und Vorläuferzellen (VW-SCs) werden zunehmend für ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung von Gefäßverletzungen und -reparaturen anerkannt. Die Etablierung einer stabilen und effizienten Methode zur Kultivierung funktioneller muriner CD34⁺ VW-SCs ist unerlässlich, um die Mechanismen, die an der Proliferation, Migration und Differenzierung dieser Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen beteiligt sind, weiter zu untersuchen. Das beschriebene Verfahren kombiniert magnetisches Bead-Screening und Durchflusszytometrie zur Aufreinigung von primär kultivierten residenten CD34⁺ VW-SCs. Die gereinigten Zellen werden dann durch Immunfluoreszenzfärbung und Ca2⁺ -Bildgebung funktionell identifiziert. Kurz gesagt, werden Gefäßzellen aus der Adventitia der murinen Aorta und der Mesenterialarterie durch Anheften von Gewebeblöcken gewonnen, gefolgt von einer Subkultivierung bis zum Erreichen einer Zellzahl von mindestens 1 × 10⁷. Anschließend werden CD34⁺ VW-SCs mittels magnetischer Kügelchensortierung und Durchflusszytometrie aufgereinigt. Die Identifizierung von CD34⁺ VW-SCs beinhaltet die zelluläre Immunfluoreszenzfärbung, während die funktionelle Multipotenz bestimmt wird, indem die Zellen einem spezifischen Kulturmedium zur orientierten Differenzierung ausgesetzt werden. Darüber hinaus wird die funktionelle interne Ca2⁺ -Freisetzung und der externe Ca2⁺ -Eintrag mit einer kommerziell erhältlichen Bildgebungsworkstation in Fura-2/AM-geladenen Zellen bewertet, die ATP, Koffein oder Thapsigargin (TG) ausgesetzt sind. Diese Methode bietet eine stabile und effiziente Technik zur Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen und bietet die Möglichkeit für In-vitro-Studien zu den Regulationsmechanismen von VW-SCs und das Screening von zielgerichteten Medikamenten.

Die Gefäßwand spielt eine zentrale Rolle bei der Gefäßentwicklung, der homöostatischen Regulation und dem Fortschreiten von Gefäßerkrankungen. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien das Vorhandensein verschiedener Stammzelllinien in den Arterien aufgedeckt. Im Jahr 2004 berichtete die Gruppe von Professor Qingbo Xu erstmals über die Existenz von vaskulären Stamm-/Vorläuferzellen in der Peripherie der adulten Gefäßwand, die CD34, Sca-1, c-kit und Flk-1¹ exprimieren. Diese vaskulären Stammzellen weisen ein multidirektionales Differenzierungs- und Proliferationspotenzial auf. Unter normalen Bedingungen bleiben sie relativ ruhig; Wenn sie jedoch durch bestimmte Faktoren aktiviert werden, können sie sich in glatte Muskelzellen, Endothelzellen und Fibroblasten differenzieren. Alternativ können sie die perivaskuläre Matrix und die Bildung von Mikrogefäßen durch parakrine Effekte regulieren, um die Reparatur oder den Umbau verletzter Gefäße zu fördern 2,3,4,5,6. Kürzlich wurde festgestellt, dass residente CD34⁺-Stammzellen in der Gefäßwand eine Rolle bei der Regeneration von Endothelzellen nach einer Verletzung des Führungsdrahts der Oberschenkelarterie spielen². Folglich sind die Isolierung und Quantifizierung von CD34⁺ VW-SCs und die Untersuchung der grundlegenden biologischen Eigenschaften von CD34⁺ Stammzellen von entscheidender Bedeutung für die weitere Untersuchung der Signalwege, die an der Regulation von CD34⁺ VW-SCs beteiligt sind.

Derzeit stehen verschiedene Methoden zur Zelltrennung zur Verfügung, darunter Techniken, die auf Zellkultureigenschaften oder physikalischen Eigenschaften von Zellen basieren, wie z. B. die Dichtegradientenzentrifugation, die zu sortierten Zellen führt, die viele Nichtzielzellen und eine relativ geringe Reinheit enthalten 7,8,9,10,11,12 . Eine weitere häufig verwendete Technik ist die Fluoreszenz-/magnetisch unterstützte Zellsortierung. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein komplexes System mit hohen technischen Anforderungen, das relativ teuer und zeitaufwändig ist und möglicherweise die Aktivität der sortierten Zellen beeinträchtigt^13,14. Die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist jedoch effizienter und bequemer, mit einer hohen Rückgewinnungsrate und Zellaktivität und geringeren Auswirkungen auf nachgelagerte Anwendungen⁸. Daher haben wir in diesem Protokoll MACS zur Aufreinigung von CD34⁺ VW-SCs angewendet und die Zellen durch Durchflusszytometrie weiter identifiziert. Die Etablierung von MACS-basierten Isolationsmethoden zur Untersuchung von Gefäßwandstammzellen wäre von unschätzbarem Wert. Zum einen ermöglicht sie experimentelle genetische und zellbiologische Studien. Zweitens ermöglicht die effiziente Isolierung und Kultivierung von Stammzellen aus der Gefäßwand eine systematische Bewertung und ein Screening von Signalfaktoren, die die Stammzellfunktionen regulieren. Drittens stellt die Identifizierung kritischer Phänotypen in Stammzellen eine wichtige "Qualitätskontrolle" bei der Beurteilung des Zellstatus dar. Daher könnte die Identifizierung von Methoden zur Reinigung für ähnliche Anwendungen bei analogen Stammzellen, die aus Gefäßen gewonnen werden, nützlich sein.

Dieser Bericht bietet eine detaillierte Demonstration einer stabilen und zuverlässigen Methode für die Kultivierung von CD34⁺ VW-SCs, einschließlich Zellidentifizierung und funktioneller Bewertung, die durch Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und Ca2⁺ -Signalmessung durchgeführt wird. Diese Studie bildet die Grundlage für weitere vertiefte Forschungen zur Funktion von CD34⁺ VW-SCs und ihren Regulationsmechanismen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Diese Studie wurde genehmigt und die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Management und die Verwendung von Labortieren in China behandelt. Die Forschung hielt sich strikt an die ethischen Anforderungen von Tierversuchen, mit Genehmigung der Tierethikkommission (Zulassungsnummer: SWMU2020664). Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte gesunde C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g verwendet. Die Tiere wurden im Laboratory Animal Center der Southwest Medical University (SWMU) untergebracht.

1. Gewebeblockkultur von Adventitia aus Aorta und Mesenterialarterien

1. Isolation der Residenten CD34⁺ VW-SCs
   1. Anästhesieren Sie zwei Mäuse mit 3% Isofluran-Inhalation (nach institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Zehenkneifen. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage mit medizinischem Klebeband und sprühen Sie 70%iges Ethanol-Desinfektionsmittel, um das Fell der Maus zu desinfizieren. Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle mit einer sterilen Augenschere und -zange, um Herz und Darm freizulegen. Nach dem Präparieren der isolierten Aorta und der Mesenterialarterien werden die Aorta und das Mesenterialbett in eine Petrischale gesteckt, die Silikonelastomer enthält und mit einer physiologischen Salzlösung gefüllt ist. Mit einer weiteren sterilisierten Schere und Pinzette sezieren Sie schnell das Fett um die Aorta und die Mesenterialarterien.
   2. Übertragen Sie das präparierte Gewebe in eine 6 cm große Petrischale, die 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Lösung enthält (siehe Materialtabelle). Nach zweimaligem Spülen die Arterien in eine Gewebekulturhaube unter einem Stereomikroskop überführen.
   3. Schneiden Sie die Arterien in Längsrichtung auf und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette die äußere Schicht der Aorta und den ersten Ast der Mesenterialarterien ab. Übertragen Sie die äußeren Schichten in eine 3,5 cm große Petrischale, die 0,1-0,2 mL Kulturmedium enthält (siehe Materialtabelle). Schneiden Sie die äußeren Schichten in winzige Stücke (ca. 1 mm³).
   4. Übertragen Sie die Gewebestücke in einen mit Gelatine beschichteten T25-Kolben, um eine gleichmäßige Verteilung auf dem Boden des Kolbens zu gewährleisten. Halten Sie einen moderaten Abstand zwischen den Gewebestücken ein, um das Kriechen und Wachstum der Zellen zu erleichtern. Der Kolben wird 3 Stunden lang senkrecht in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) gestellt, damit die Gewebeblöcke am Boden des Kolbens haften können.
   5. Fügen Sie nach 3 Stunden 5 ml DMEM-Wachstumsmedium mit hohem Glukosegehalt hinzu, um die Gewebeblöcke einzutauchen. Richten Sie den T25-Kolben horizontal aus. Überwachen Sie die Zellmigration um Gewebeblöcke herum durch ein Mikroskop in Abständen von 3 Tagen.
      HINWEIS: Das Medium sollte 20 % fötales Rinderserum, 0,2 % Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,2 mM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin enthalten (siehe Materialtabelle). Fötales Rinderserum unterstützt die Zellproliferation, während LIF und β-Mercaptoethanol die Zelldifferenzierung behindern ^7,8.
   6. Wenn die Zellen im T25-Kolben eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, werden sie in einen oder zwei T75-Kolben geleitet und kultiviert. Subkulturieren Sie die Zellen über fünf Passagen, um ein angemessenes Wachstum und Gesundheit zu gewährleisten.
2. Magnetische Trennung von residenten CD34⁺ Stammzellen
   1. Wenn die Zellen in einem oder zwei T75-Kolben eine Konfluenz von 80 % erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin und resuspendieren sie in 1 ml Sortierpuffer (2 mM EDTA und 0,5 % FBS). Die Zellzahl (10⁷/T75 Kolben) bestimmen und die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min (bei Raumtemperatur) zentrifugieren.
   2. Der Überstand wird vollständig verworfen und das Zellpellet in 98 μl Sortierpuffer pro insgesamt 10⁷ Zellen resuspendiert. Fügen Sie 2 μl CD34-Antikörper hinzu (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min bei 4°C im Dunkeln unter gelegentlichem Schütteln inkubieren.
   3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 mL Sortierpuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
   4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig und resuspendieren Sie die Zellen in 80 μl Sortierpuffer.
   5. 20 μl Anti-FITC-Mikrokügelchen (pro insgesamt 10⁷ Zellen, siehe Materialtabelle) in den Puffer geben. Durch wiederholtes Pipettieren gut mischen und 15 Minuten bei 4 °C im Dunkeln unter intermittierendem Schütteln inkubieren.
   6. Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 2 mL Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren, um die Zellen zu repelletieren. Den Überstand vollständig verwerfen und die Zellen in 1 ml Puffer resuspendieren.
   7. Positionieren Sie eine MS-Säule innerhalb des Magnetfelds eines geeigneten Separators und stellen Sie sicher, dass ein Sammelröhrchen (z. B. ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen) unter der MS-Säule platziert wird, um die getrennten Komponenten zu sammeln. (siehe Materialtabelle). Spülen Sie die Säule mit 500 μL Puffer und warten Sie, bis sie vollständig durchlaufen ist.
   8. Laden Sie die Zellsuspension in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss mit unmarkierten Zellen in das 15-ml-Röhrchen.
   9. Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und setzen Sie sie auf ein neues 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 500 μl Puffer in die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben in die Säule drücken.
   10. Um die Reinheit von CD34⁺ -Zellen zu verbessern, kann die eluierte Fraktion mit einer zweiten MS-Säule angereichert werden. Wiederholen Sie den Trennvorgang wie oben beschrieben. Beurteilen Sie die Reinheit der sortierten Zellen mittels Durchflusszytometrie.
       HINWEIS: In der Regel werden 10%-20% CD34⁺ -Zellen erhalten, mit etwa 70%-80% negativen Zellen und einem Verlust von ca. 10% durch Färbe- und Zentrifugenverfahren.
   11. Um die Reinheit der CD34⁺ -Stammzellen der Gefäßwand weiter zu bestätigen, werden die sortierten Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert. Die vorliegende Studie zeigte eine Reinheit von mehr als 90%.

2. Zellidentifikation durch Immunfluoreszenz

1. Samenzellen auf Deckgläsern (Durchmesser 8 mm) mit 0,04 % Gelatine vorbeschichtet.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 60 % bis 70 % erreichen, spülen Sie sie zweimal mit PBS und fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd.
3. Waschen Sie die Zellen 3 Minuten lang (3 Mal) mit PBS und permeabilisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,2 % Triton X-100 (in PBS).
4. Waschen Sie die Zellen 3 min lang (3 mal) mit PBS und blockieren Sie die unspezifische Bindung der Antikörper mit 5% Eselsserum (in PBS) für 1 h.
5. Entfernen Sie den Blockierungspuffer, indem Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette an der Kante festhalten und auf ein Blatt fusselfreies Tuch abtropfen lassen.
6. Die Zellen werden in 100-fach verdünnten Primärantikörpern (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, siehe Materialtabelle) in 1% BSA (in PBS) über Nacht bei 4 °C inkubiert.
7. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zellen 3 Minuten lang (3 Mal) mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit einem Alexa Fluor 488-markierten Sekundärantikörper (1:200 in 1% BSA) (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
8. Führen Sie eine DAPI-Gegenfärbung durch, indem Sie die DAPI-Stammlösung in PBS auf 0,5 μg/ml verdünnen und die Zellen 5 Minuten lang inkubieren.
9. Mit PBS spülen und die Deckgläser mit Antifading-Reagenz versiegeln. Nehmen Sie Bilder unter dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop auf.

3. Induzierte Differenzierung und Charakterisierung von CD34⁺ VW-SCs

1. Züchten Sie CD34⁺ -Stammzellen mit einer angemessenen Dichte (40%-50% Konfluenz) auf Deckgläsern bzw. 6-Well-Platten.
2. Induktion der Endothelzell-orientierten Differenzierung von CD34⁺ -Zellen durch Kultivierung von Zellen im Endothelzellkulturmedium EBM-2 (siehe Materialtabelle) für 1 Woche.
3. Induktion der Fibroblastenzell-orientierten Differenzierung von CD34⁺ -Zellen durch Kultivierung von Zellen im Fibroblasten-Zellkulturmedium FM-2 (siehe Materialtabelle) für 3 Tage.
4. Die undifferenzierten und differenzierten Zellen werden einer Immunfluoreszenzfärbung (wie in Schritt 2 erwähnt) bei einer Laseranregung von 488 nm und einem 40-fachen Objektiv unterzogen. Nachweis der Expression von Endothelzellmarkern (CD31, VWF) und Fibroblastenzellmarkern (PDGFRα, Vimentin) (siehe Materialtabelle).
5. Dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin und erhalten Sie das Zellpellet durch Zentrifugation (300 x g, 5 min, Raumtemperatur). Zellen mit 100 μl Sortierpuffer resuspendieren. Die Zellsuspension wird mit gereinigtem Anti-Maus-CD16/CD32 mAb (1 μg) (siehe Materialtabelle) bei 4 °C für 5 min vorinkubiert.
6. Geben Sie 2 μl PE Ratte Anti-Maus CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonaler Antikörper APC (2 μL, 1:50) und CD140a (PDGFRa) Monoklonaler Antikörper FITC (2 μL, 1:50) direkt in vorinkubierte Zellen in Gegenwart von Maus Fc Block und inkubieren Sie diese 15 Minuten lang bei 4 °C.
7. Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 2 mL Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g (Raumtemperatur) zentrifugieren, um die Zellen wieder zu pelletieren. Der Überstand wird vollständig verworfen und die Zellen in 300 μl Puffer resuspendiert. Legen Sie die Durchflussröhrchen mit den gefärbten Zellen in eine Eisbox, die für die Durchflusszytometrie bereit ist.

4. Nachweis des intrazellulären Ca2⁺ -Signalwegs in vaskulären CD34⁺ -Stammzellen

1. Keimzellen auf Deckgläsern 10 h vor Experimenten mit einer Dichte von bis zu 70% Konfluenz.
2. Nehmen Sie die Deckgläser heraus und befestigen Sie sie mit Vaseline auf dem Boden einer speziellen Kammer.
3. Waschen Sie die Deckgläser einmal mit PBS, ersetzen Sie sie durch Fura-2/AM (5 μM) in Tyrode-Lösung (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, Glukose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln.
4. Entfernen Sie den Farbstoff, indem Sie 10 Minuten lang mit der Tyrode-Lösung behandeln, um eine Entesterung von Fura-2/AM zu ermöglichen.
5. Montieren Sie die Kammer auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das mit einem Weitfeld-Bildgebungssystem ausgestattet ist, das einen Monochromator und eine CCD-Kamera enthält (siehe Materialtabelle).
6. Öffnen Sie das Hauptfenster, gehen Sie zum Dialogfeld "Grab-Einstellungen " und zur Kameraseite und drücken Sie die Live-Taste für die Live-Bildanzeige.
7. Wählen Sie den Fluoreszenzbildtyp, stellen Sie die Wiederholungszeiten der Schleife von 340 nm/380 nm, die Bildgröße und die Kamerabelichtungszeit auf 380 nm und 340 nm ein, um eine optimale Bildhelligkeit zu erzielen.
8. Machen Sie einzelne Schnappschüsse und zeichnen Sie mehrere Freihandlinien, um die Zellen mit unterschiedlichen Farben zu umkreisen und den Interessenbereich (ROIs) vorzudefinieren, wobei der Hintergrund als ROI 0 angezeigt wird.
9. Bearbeiten Sie ein bereits eingebettetes Protokoll in der Arbeitsbereichsansicht erneut, und erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich.
10. Führen Sie das Protokoll aus, und die Meldung "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" zeigt das kinetische Online-Diagramm an.
11. In der numerischen Ansicht wird eine Tabelle angezeigt, in der Spalten mit Graustufenwerten und entsprechenden Zeitinformationen angezeigt werden. Exportieren Sie die Tabellenkalkulationsdaten mithilfe der Zwischenablage.
12. Berechnen Sie F340 nm/F380 nm, was auf intrazelluläre Ca2⁺ -Veränderungen nach Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz hinweist (ROI 0).

Isolierung und Reinigung von CD34⁺ VW-SCs
Die hohe Reinheit von CD34⁺ VW-SCs wird aus der Adventitia der Aorta und der Mesenterialarterie der Maus durch Gewebeattachment und magnetische Mikrokügelchensortierung gewonnen. Der Anteil der CD34⁺ -Zellen in der Gefäßwand liegt im Allgemeinen bei 10%-30%. Die Durchflusszytometrie bestätigt, dass die Reinheit von CD34⁺ -Zellen, die durch magnetische Bead-Sortierung erhalten werden, mehr als 90 % beträgt (Abbildung 1A). Die zelluläre Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass CD34⁺ VW-SCs überwiegend CD34, c-kit, Flk-1 und Ki-67 exprimieren, mit einer relativ geringeren Expression von Sca-1 (Abbildung 1B).

Unterscheidung von CD34⁺ VW-SCs
CD34⁺ VW-SCs sind in der Lage, sich in vitro in Endothelzellen und Fibroblasten zu differenzieren. CD34⁺-Stammzellen konnten dazu gebracht werden, sich in Endothelzellen zu differenzieren, wobei die Expression der Endothelzellmarker CD31 und VWF erhöht wurde. Darüber hinaus zeigten die differenzierten Fibroblastenzellen eine lange Spindelmorphologie und eine erhöhte Expression der Fibroblastenmarker PDGFRα und Vimentin (Abbildung 2A,B). Darüber hinaus bestätigte die Durchflusszytometrie auch die Differenzierungsfähigkeit der Zellen; Der Prozentsatz der CD34⁺CD31⁺-Endothelzellen nach der Differenzierung stieg im Vergleich zu den undifferenzierten Zellen um das 1,5-fache (Abbildung 2C), und der Prozentsatz der CD34⁺PDGFRa⁺-Fibroblastenzellen nach der Differenzierung stieg um das 1,7-fache im Vergleich zu den undifferenzierten Zellen (Abbildung 2D).

Charakterisierung des Ca2⁺ -Signalwegs in CD34⁺ VW-SCs
Die extrazelluläre Verabreichung von ATP (10 μM) erhöhte den intrazellulären Ca2⁺ -Spiegel über den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)-vermittelten Signalweg, und Thapsigargin (TG) hemmte die sarkoplasmatische Retikulum (SR) Ca2⁺ -ATPase (SERCA), um die intrazellulären SR^Ca2+ -Speicher zu erschöpfen, und löste den speicherbetriebenen Kalziumeintritt (SOCE) aus. Darüber hinaus stimulierte Koffein die erhöhte [Ca²⁺]i, indem es die Ryanodinrezeptoren (RyRs)-vermittelte Ca2⁺ -Freisetzung aktivierte (Abbildung 3).

Abbildung 1: Geerntete CD34⁺ VW-SCs durch Gewebekultur und magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS). (A) Durchflusszytometrische Auswertung von gereinigten CD34⁺ VW-SCs. (B) Repräsentative Bilder, die die Expression der Stammzellmarker CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 und des Zellproliferationsmarkers (Ki-67) zeigen. Maßstabsleisten: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Nachweis der multidirektionalen Differenzierungsfähigkeit von CD34⁺ VW-SCs. (A) Repräsentative Bilder, die die Expression der endothelialen Marker CD31 und VWF sowie der Fibroblastenmarker PDGFRα und Vimentin in CD34⁺ VW-SCs vor der Differenzierung zeigen. (B) Repräsentative Bilder, die die Expression der endothelialen Marker CD31 und VWF sowie der Fibroblastenmarker PDGFRα und Vimentin in CD34⁺ VW-SCs nach der Differenzierung zeigen. Maßstabsleisten: 50 μm. Der eingesetzte Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (C) Der prozentuale Anteil der CD34⁺CD31⁺ -Endothelzellen vor und nach der Differenzierung, gemessen durch Durchflusszytometrie. (D) Der prozentuale Anteil von CD34⁺PDGFRa^+- Fibroblastenzellen vor und nach der Differenzierung, gemessen mittels Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Intrazelluläres Ca2⁺ -Signal in CD34⁺ -VW-SCs. (A) Die repräsentative Kurve zeigt die Wirkung von ATP (10 μM) auf die intrazelluläre^Ca2+ -Signalübertragung. (B) Die repräsentative Kurve zeigt die TG (1 μM)-induzierte intrazelluläre Ca2⁺ -Freisetzung aus dem SR-Speicher und den anschließenden extrazellulären Ca2⁺ -Zustrom, der durch eine Ca2⁺ -Depletion nach erneuter Zugabe von 2 mM Ca2⁺ ausgelöst wurde. (C) Repräsentative Kurve, die die intrazelluläre Ca2⁺ -Signalgebung von Koffein (10 mM) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Studie bietet eine schnelle und bequeme Methode zur Gewinnung von funktionellen CD34⁺ VW-SCs aus der Aorta und den Mesenterialarterien von Mäusen. CD34⁺ VW-SCs, die mit dieser Methode erhalten werden, haben proliferative Aktivität und multidirektionale Differenzierungseigenschaften. Triphosphat-Inositol-1,4,5-Trisphosphat-Rezeptoren (IP₃Rs), Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und speicherbetriebene Calciumkanäle vermitteln die Freisetzung und den Eintritt von Ca2⁺ in CD34⁺ VW-SCs. Die Etablierung dieser Technik wird die Grundlage für die weitere Erforschung der Mechanismen legen, die an der Beteiligung von CD34⁺ VW-SCs am strukturellen und funktionellen Umbau bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Zu den gebräuchlichsten Methoden zur Isolierung von Primärzellen gehören die Bindung von Gewebeblöcken und die enzymatische Dissoziation^15,16. Im vorliegenden Bericht werden die Anheftung von Gewebeblöcken und die Sortierung von magnetischen Beads kombiniert, um eine hohe Reinheit von CD34⁺ VW-SCs zu erhalten. Die sortierten CD34⁺-Stammzellen an der Gefäßwand sind positiv für CD34, und nur wenige exprimieren den Endothelzellmarker CD31, was mit einem früheren Bericht^{übereinstimmt 2}. Außerdem fanden Jiang et ^al.2 unter Verwendung einer Einzelzellsequenzierung von frisch isolierten Zellen der Oberschenkelarterie bei Mäusen heraus, dass CD34 hauptsächlich in den endothelialen und mesenchymalen Zellpopulationen und nicht in der Zellpopulation der glatten Muskulatur exprimiert wurde. Experimente in vivo bestätigen auch, dass CD34⁺ VW-SCs sich in Endothelzellen differenzieren können, um an der Gefäßreparatur nach einer Verletzung teilzunehmen. Da VW-SCs heterogen sind, haben die CD34⁺ VW-SCs, die nach dieser Methode sortiert wurden, zusammen mit anderen Stammzell-positiven Markern wie Flk-1, c-kit und Sca-1, unterschiedliche Subpopulationen, so dass ihre Morphologie unterschiedlich sein kann.

Die am weitesten verbreiteten Methoden zur Sortierung von Stammzellen sind die Durchflusszytometrie und die Sortierung immunomagnetischer Beads 17,18,19. Die FACS-Methode zeichnet sich durch eine hohe Zellreinheit und Wiederfindungsrate aus, während FACS relativ zeitaufwändig und teuer ist. Die immunomagnetische Bead-Trennung ist eine hochspezifische Zellsortiertechnologie, die die Theorien der Immunologie, der Zellbiologie und der magnetischen Mechanik integriert. Diese Methode ist einfach und schnell und kann innerhalb von 2 Stunden durchgeführt werden. Unterschiedliche Zellsortiermethoden beeinflussen die Zellreinheit und die Ausbeute²⁰. Ähnlich wie in früheren Berichten²¹ haben die in diesem Experiment verwendeten magnetischen Sortierkügelchen einen Durchmesser von nur 50 nm, was relativ weniger mechanischen Druck auf die Zellen ausübt und keine Zellschäden verursacht und die biologische Aktivität der sortierten Zellen nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus sortieren wir im Gegensatz zu der in der Literatur^berichteten Trennmethode 8 Zellen im Allgemeinen nach der Passage über 5 Generationen, wenn die Anzahl der Zellen in einem T75-Kolben mindestens 1 × 10⁷ erreichen kann und die Zellproliferation aktiv ist. Darüber hinaus ist es nach der Kultivierung sortierter Zellen für 3-5 Passagen entscheidend, das Aufreinigungsprotokoll zu wiederholen und sicherzustellen, ob während der Kultur und der Passagen eine Autodifferenzierung vorhanden ist.

Während der Subkultur von VW-SCs wird DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt und 0,2 % LIF verwendet, wobei FBS die Proliferation von VW-SCs fördert und LIF die Zelldifferenzierung hemmt und die Vermehrung von Stammzellen unterstützt. In Übereinstimmung mit der bestehenden Studie¹¹ begünstigt die Kultur mit niedriger Dichte die Aufrechterhaltung der Stammheit von VW-SCs, und die Möglichkeit der Selbstdifferenzierung nimmt mit den Passagen zu. Darüber hinaus ist auch die Auswahl des Serums während der Kultur von entscheidender Bedeutung, da ein Teil des Serums möglicherweise die Selbstdifferenzierung der Zellen induziert und die biologischen Eigenschaften beeinflusst¹⁰.

Ca²⁺ ist ein wichtiger zweiter Botenstoff, der verschiedene zelluläre Funktionen steuert, darunter Zellkontraktion, Migration, Genexpression, Zellwachstum und Apoptose⁹. In früheren Berichten⁸ wurden die grundlegenden Eigenschaften von CD34⁺ VW-SCs nur kurz beschrieben, während wir in dieser Studie die Ca2⁺-Freisetzung aus internen Kalziumspeichern und den extrazellulären^Ca2+-Einstrom, der durch ATP, Koffein bzw. TG ausgelöst wurde, nachweisen konnten. ATP ist ein Nukleotid, das nicht nur als die wichtigste Energiewährung in den Zellen gilt, sondern auch als Transmitter-/Signalmolekül fungiert. ATP aktiviert die IP₃Rs-vermittelte Ca2⁺-Freisetzung aus dem SR und reguliert die Aktivität mehrerer nachgeschalteter Ziele. Daher kann die zelluläre Reaktion auf ATP den Funktionszustand der Zelle^{widerspiegeln 22}. Koffein wird seit langem als pharmakologische Sonde zur Untersuchung der RyRs-vermittelten intrazellulären Ca2⁺-Freisetzung verwendet. In dieser Studie erhöhten sowohl ATP als auch Koffein schnell das intrazelluläre Ca²⁺, und das erhöhte intrazelluläre Ca²⁺ sank langsam innerhalb von 1 Minute auf den Ausgangswert. Darüber hinaus ist SOCE in den meisten nicht erregbaren und teilweise erregbaren Zellen vorhanden. In der vorliegenden Studie unterdrückt TG das^Ca2+-ATP-Enzym in CD34⁺ VW-SCs, um eine Ca2⁺-Depletion in der SR zu induzieren und den externen^Ca2+-Einstrom^{zu vermitteln 23}. Die Wirkung von ATP, Koffein und TG auf intrazelluläres Ca2⁺ in CD34⁺ VW-SCs stimmt mit anderen Zellen überein, die in früheren Studien berichtet wurden^24,25, was darauf hindeutet, dass die in dieser Studie isolierten CD34⁺-Stammzellen eine normale intrazelluläre Ca2⁺-Freisetzung und externe^Ca2+-Einstromsignaleigenschaften aufweisen.

In dieser Studie werden funktionelle CD34⁺ VW-SCs aus Aorten- und Mesenterialarterien der Maus effizient kultiviert. Die Untersuchung von VW-SCs könnte wichtige Einblicke in die Mechanismen des vaskulären Umbaus liefern. Die Entwicklung von Protokollen mit mehr Markern und funktionellen Studien von CD34⁺ VW-SCs wird die Rolle dieser Zellen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen weiter definieren. Die Zellreinigung dient als wirksames Werkzeug, um in die zellulären und genetischen Grundlagen der Organentwicklung und des Organwachstums einzutauchen. Die MACS-Aufreinigung bietet den Vorteil, dass sie eine bequeme Methode zur Verfeinerung der Zellanreicherung ist. In Verbindung mit anderen Techniken, wie z. B. der RNA-Sequenzierungsanalyse, hat sie das Potenzial, neue Mechanismen aufzudecken, die der Proliferation, Migration und Differenzierung von Stammzellen sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten zugrunde liegen¹². Dieser Ansatz ermöglicht ein systematisches Screening von biologischen Faktoren, extrazellulären Matrixkomponenten und kleinen Molekülen, die die grundlegenden Funktionen von Stammzellen entweder fördern oder hemmen. Die Durchführung solcher Studien eröffnet einzigartige Möglichkeiten für die Durchführung von Funktionsverlust- und Funktionsgewinnexperimenten und trägt letztlich zu einem tieferen Verständnis der genetischen Grundlagen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei. Es gibt auch einige Einschränkungen innerhalb dieser Methode. Aufgrund der phänotypischen und funktionellen Heterogenität von CD34⁺ -Zellen in der Gefäßwand werden beispielsweise mehr Marker benötigt, um den spezifischen subzellulären Typ der residenten vaskulären CD34⁺ -Zellen zu identifizieren.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070502, 31972909, 32171099) und des Sichuan Science and Technology Program der Provinz Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607) finanziert. Die Autoren danken Qingbo Xu von der Zhejiang University für die Hilfe bei der Zellkultur, und die Autoren danken der Durchflusszytometrie-Plattform an der Southwest Medical University für die wissenschaftliche und technische Unterstützung.