العزل المغناطيسي المناعي للخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية من الفئران

أنشأت هذه الدراسة طريقة مستقرة وفعالة للعزل والثقافة والتحديد الوظيفي للخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية (CD34 ⁺ VW-SCs). يمكن استخدام طريقة العزل سهلة المتابعة والفعالة من قبل باحثين آخرين لدراسة الآليات المحتملة التي تنطوي عليها أمراض القلب والأوعية الدموية.

يتم التعرف بشكل متزايد على الخلايا الجذعية والسلفية المقيمة في جدار الأوعية الدموية CD34 ⁺ (VW-SCs) لدورها الحاسم في تنظيم إصابات الأوعية الدموية وإصلاحها. يعد إنشاء طريقة مستقرة وفعالة لزراعة الفئران الوظيفية CD34 ⁺ VW-SCs أمرا ضروريا لمزيد من التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها انتشار هذه الخلايا وهجرتها وتمايزها في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. تجمع الطريقة الموصوفة بين فحص الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي لتنقية CD34 ⁺ VW-SCs المقيمة الأولية. ثم يتم تحديد الخلايا النقية وظيفيا من خلال تلطيخ التألق المناعي وتصوير الكالسيوم²⁺ . باختصار ، يتم الحصول على الخلايا الوعائية من adventitia من الشريان الأورطي الفئران والشريان المساريقي من خلال ربط كتلة الأنسجة ، تليها زراعة فرعية حتى تصل إلى عدد الخلايا على الأقل 1 × 10⁷. بعد ذلك ، يتم تنقية CD34 ⁺ VW-SCs باستخدام فرز الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي. يتضمن تحديد CD34 ⁺ VW-SCs تلطيخ التألق المناعي الخلوي ، بينما يتم تحديد تعدد القدرات الوظيفية عن طريق تعريض الخلايا لوسط ثقافة معين للتمايز الموجه. علاوة على ذلك ، يتم تقييم إطلاق Ca²⁺ الداخلي الوظيفي وإدخال Ca²⁺ الخارجي باستخدام محطة عمل تصوير متاحة تجاريا في الخلايا المحملة ب Fura-2 / AM المعرضة ل ATP أو الكافيين أو thapsigargin (TG). توفر هذه الطريقة تقنية مستقرة وفعالة لعزل وزراعة وتحديد الخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية ، مما يوفر فرصة للدراسات المختبرية حول الآليات التنظيمية ل VW-SCs وفحص الأدوية المستهدفة.

يلعب جدار الأوعية الدموية دورا محوريا في نمو الأوعية الدموية ، وتنظيم الاستتباب ، وتطور أمراض الأوعية الدموية. في السنوات الأخيرة ، كشفت العديد من الدراسات عن وجود سلالات مختلفة من الخلايا الجذعية في الشرايين. في عام 2004 ، أبلغت مجموعة البروفيسور Qingbo Xu لأول مرة عن وجود خلايا جذعية / سلفية وعائية في محيط جدار الأوعية الدموية للبالغين ، معبرة عن CD34 و Sca-1 و c-kit و Flk-1¹. تظهر هذه الخلايا الجذعية الوعائية إمكانية التمايز والانتشار متعدد الاتجاهات. في ظل الظروف العادية ، تظل هادئة نسبيا. ومع ذلك ، عند تنشيطها بواسطة عوامل محددة ، يمكن أن تتمايز إلى خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية والخلايا الليفية. بدلا من ذلك ، يمكنهم تنظيم المصفوفة المحيطة بالأوعية الدموية وتشكيل الأوعية الدقيقة من خلال تأثيرات paracrine لتعزيز إصلاح أو إعادة تشكيل الأوعية المصابة^{2،3،4،5،6}. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على الخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية للعب دور في تجديد الخلايا البطانية بعد إصابة سلك توجيه الشريان الفخذي². وبالتالي ، فإن عزل وقياس CD34 ⁺ VW-SCs وفحص الخصائص البيولوجية الأساسية للخلايا الجذعية CD34 ⁺ أمر بالغ الأهمية لمزيد من الدراسة لمسارات الإشارة المشاركة في تنظيم CD34 ⁺ VW-SCs.

تتوفر حاليا طرق مختلفة لفصل الخلايا ، بما في ذلك التقنيات القائمة على خصائص زراعة الخلايا أو الخصائص الفيزيائية للخلايا مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، مما ينتج عنه خلايا مصنفة تحتوي على العديد من الخلايا غير المستهدفة ونقاوة منخفضة نسبيا^{7،8،9،10،11،12}. تقنية أخرى شائعة الاستخدام هي فرز الخلايا بمساعدة الفلورة / المغناطيسية. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو نظام معقد ذو متطلبات تقنية عالية ، وهو مكلف نسبيا ويستغرق وقتا طويلا ويحتمل أن يؤثر على نشاط الخلايا المصنفة^13,14. ومع ذلك ، فإن فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) أكثر كفاءة وملاءمة ، مع معدل استرداد مرتفع ونشاط خلية وتأثير أقل على تطبيقات المصب⁸. لذلك ، في هذا البروتوكول ، قمنا بتطبيق MACS لتنقية CD34 ⁺ VW-SCs وحددنا الخلايا بشكل أكبر عن طريق قياس التدفق الخلوي. إن إنشاء طرق عزل قائمة على MACS لدراسة الخلايا الجذعية لجدار الأوعية الدموية سيكون لا يقدر بثمن. أولا ، يسمح بإجراء دراسات وراثية وبيولوجية خلوية. ثانيا ، يسمح العزل الفعال وزراعة الخلايا الجذعية المقيمة في جدار الأوعية الدموية بالتقييم والفحص المنهجي لعوامل الإشارة التي تنظم وظائف الخلايا الجذعية. ثالثا ، يوفر تحديد الأنماط الظاهرية الحاسمة في الخلايا الجذعية "مراقبة جودة" مهمة في تقييم حالة الخلية. وبالتالي ، فإن تحديد طرق التنقية يمكن أن يكون مفيدا لتطبيقات مماثلة للخلايا الجذعية المماثلة المشتقة من الأوعية.

يقدم هذا التقرير عرضا مفصلا لطريقة مستقرة وموثوقة لثقافة CD34 ⁺ VW-SCs ، بما في ذلك تحديد الخلايا والتقييم الوظيفي الذي يتم إجراؤه عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتلطيخ التألق المناعي ، وقياس إشارات Ca²⁺ . توفر هذه الدراسة أساسا لمزيد من البحث المتعمق حول وظيفة CD34 ⁺ VW-SCs وآلياتها التنظيمية في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

تمت الموافقة على هذه الدراسة ، وتم التعامل مع وفقا للمبادئ التوجيهية لإدارة واستخدام المختبر في الصين. التزم البحث التزاما صارما بالمتطلبات الأخلاقية للتجارب على ، بموافقة لجنة أخلاقيات (رقم الموافقة: SWMU2020664). تم استخدام الفئران السليمة C57BL / 6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع من كلا الجنسين ، والتي يتراوح وزنها بين 18-20 جم ، في الدراسة الحالية. تم إيواء في مركز المختبر بجامعة ساوث ويست الطبية (SWMU).

1. زراعة كتلة الأنسجة من adventitia من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية

1. عزل CD34 ⁺ VW-SCs المقيم
   1. تخدير فأرين باستنشاق 3٪ إيزوفلوران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكيد التخدير الكافي عن طريق قرصة إصبع القدم. ضع الماوس مستلقيا بشريط طبي ورش 70٪ مطهر إيثانول لتطهير فراء الفأر. افتح تجاويف الصدر والبطن باستخدام مقص وملقط عيني معقم لكشف القلب والأمعاء. بعد تشريح الشريان الأورطي المعزول والشرايين المساريقية ، قم بتثبيت الشريان الأورطي والسرير المساريقي في طبق بتري يحتوي على مطاط السيليكون ومملوء بمحلول ملح فسيولوجي. باستخدام مجموعة أخرى من المقصات والملقط المعقم ، قم بتشريح الدهون حول الشريان الأورطي والشرايين المساريقية بسرعة.
   2. انقل الأنسجة المشرحة إلى طبق بتري 6 سم يحتوي على محلول بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب 1٪ (انظر جدول المواد). بعد الشطف مرتين ، انقل الشرايين إلى غطاء زراعة الأنسجة تحت مجهر ستيريو.
   3. قطع الشرايين طوليا واستخدام ملقط دقيق لتقشير الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي والفرع الأول من الشرايين المساريقي. انقل الطبقات الخارجية إلى طبق بتري 3.5 سم يحتوي على 0.1-0.2 مل من وسط الاستزراع (انظر جدول المواد). قطع الطبقات الخارجية إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم³).
   4. انقل قطع الأنسجة إلى دورق T25 مغلف بالجيلاتين ، مما يضمن توزيعا متساويا على قاع القارورة. حافظ على مسافة معتدلة بين قطع الأنسجة لتسهيل زحف الخلايا ونموها. ضع القارورة عموديا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂) لمدة 3 ساعات للسماح لكتل الأنسجة بالالتصاق بقاع القارورة.
   5. بعد 3 ساعات ، أضف 5 مل من وسط نمو الجلوكوز العالي DMEM لغمر كتل الأنسجة. قم بتوجيه قارورة T25 أفقيا. راقب هجرة الخلايا حول كتل الأنسجة من خلال المجهر كل 3 أيام.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي الوسط على 20٪ مصل بقري جنيني ، و 0.2٪ عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) ، و 0.2 مللي مول β-Mercaptoethanol ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (انظر جدول المواد). يدعم مصل الأبقار الجنينية تكاثر الخلايا ، بينما يعيق LIF و β-Mercaptoethanol تمايز الخلايا ^7,8.
   6. عندما تصل الخلايا الموجودة في قارورة T25 إلى حوالي 80٪ من التقاء، قم بتمريرها واستزراعها في قارورة واحدة أو اثنتين من قارورة T75. الاستزراع الفرعي للخلايا على مدى خمسة ممرات لضمان النمو السليم والصحة.
2. الفصل المغناطيسي للخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة
   1. عندما تصل الخلايا الموجودة في قارورة أو قارورة T75 إلى التقاء 80٪ ، قم بفصل الخلايا مع التربسين ، وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت للفرز (2 mM EDTA و 0.5٪ FBS). حدد رقم الخلية (10⁷ / T75 قارورة) وأجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة).
   2. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق حبيبات الخلية في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز لكل 10⁷ خلايا إجمالية. أضف 2 ميكرولتر CD34 جسم مضاد (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام مع الرج من حين لآخر.
   3. اغسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت للفرز وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وبشكل كامل ، وأعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز.
   5. أضف 20 ميكروبيدات Micro Beads المضادة ل FITC (لكل 10⁷ خلايا إجمالية ، انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت. تخلط جيدا عن طريق السحب المتكرر وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام مع اهتزاز متقطع.
   6. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق لطرد الخلايا. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت.
   7. ضع عمود MS واحدا داخل المجال المغناطيسي للفاصل المناسب ، مع التأكد من وضع أنبوب تجميع (على سبيل المثال ، أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل) أسفل عمود MS لجمع المكونات المنفصلة. (انظر جدول المواد). اشطف العمود بمخزن مؤقت سعة 500 ميكرولتر وانتظر حتى يمر بالكامل.
   8. قم بتحميل معلق الخلية في العمود واجمع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مسماة في أنبوب سعة 15 mL.
   9. قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أدخل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في العمود ، ثم اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية على الفور عن طريق دفع المكبس إلى العمود.
   10. لتعزيز نقاء خلايا CD34 ⁺ ، يمكن أن يخضع الجزء المستخلص للتخصيب باستخدام عمود MS ثان. كرر عملية الفصل كما ذكر أعلاه. تقييم نقاء الخلايا التي تم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
       ملاحظة: عادة ، يتم الحصول على خلايا CD34 ⁺ بنسبة 10٪ -20٪ ، مع حوالي 70٪ -80٪ خلايا سلبية ، وفقدان حوالي 10٪ بسبب إجراءات التلوين والطرد المركزي.
   11. لمزيد من التأكيد على نقاء الخلايا الجذعية CD34 ⁺ جدار الأوعية الدموية ، حدد الخلايا التي تم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي. أظهرت الدراسة الحالية نقاء أكثر من 90٪.

2. تحديد الخلايا عن طريق التألق المناعي

1. خلايا البذور على أغطية (قطر 8 مم) مغلفة مسبقا ب 0.04٪ جيلاتين.
2. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 60٪ -70٪ التقاء ، شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.
3. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات) ، وتخلل الخلايا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 (في PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات) ، ومنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بمصل حمار 5٪ (في PBS) لمدة 1 ساعة.
5. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب عن طريق تثبيت كل غطاء على حافته بالملقط وتصريفه على ورقة من المناديل الخالية من النسالة.
6. احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الأولية المخففة 100 مرة (CD34 ، Flk-1 ، c-kit ، Sca-1 ، Ki67 ، انظر جدول المواد) في 1٪ BSA (في PBS) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
7. صب المحلول وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق (3 مرات). احتضان الخلايا باستخدام Alexa Fluor 488 المسمى بالجسم المضاد الثانوي (1: 200 في 1٪ BSA) (انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
8. قم بإجراء تلطيخ DAPI المضاد عن طريق تخفيف محلول مخزون DAPI إلى 0.5 ميكروغرام / مل في PBS واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق.
9. شطف مع برنامج تلفزيوني وختم أغطية مع كاشف مضاد للبهتان. التقط الصور تحت مجهر المسح البؤري بالليزر.

3. التمايز والتوصيف المستحث ل CD34 ⁺ VW-SCs

1. الخلايا الجذعية CD34 ⁺ البذور بكثافة مناسبة (التقاء 40٪ -50٪) على أغطية وألواح 6 آبار ، على التوالي.
2. تحفيز التمايز الموجه لخلايا البطانة من خلايا CD34 ⁺ عن طريق زراعة الخلايا في وسط زراعة الخلايا البطانية EBM-2 (انظر جدول المواد) لمدة أسبوع واحد.
3. تحفيز التمايز الموجه للخلايا الليفية عن خلايا CD34 ⁺ عن طريق زراعة الخلايا في وسط زراعة الخلايا الليفية FM-2 (انظر جدول المواد) لمدة 3 أيام.
4. إخضاع الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة للتلطيخ المناعي (كما هو مذكور في الخطوة 2) عند إثارة الليزر 488 نانومتر وهدف 40x. الكشف عن التعبير عن علامات الخلايا البطانية (CD31 ، VWF) وعلامات الخلايا الليفية (PDGFRα ، Vimentin) (انظر جدول المواد).
5. فصل الخلايا مع التربسين والحصول على بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي (300 × غرام ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة). أعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز. احتضان معلق الخلية مسبقا باستخدام CD16 / CD32 mAb المنقى المضاد للفأر (1 ميكروغرام) (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
6. أضف 2 ميكرولتر من PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50) ، CD31 (PECAM-1) الجسم المضاد أحادي النسيلة APC (2 ميكرولتر ، 1:50) ، و CD140a (PDGFRa) الجسم المضاد أحادي النسيلة FITC (2 ميكرولتر ، 1:50) مباشرة إلى الخلايا المحتضنة مسبقا في وجود Mouse Fc Block واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
7. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة) لإعادة تقشير الخلايا. تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت. ضع أنابيب التدفق ذات الخلايا الملطخة في صندوق ثلج جاهز لقياس التدفق الخلوي.

4. الكشف عن إشارات Ca²⁺ داخل الخلايا في الخلايا الجذعية CD34 ⁺ الوعائية

1. خلايا البذور على أغطية 10 ساعات قبل التجارب بكثافة تصل إلى التقاء 70 ٪.
2. أخرج أغطية الغطاء وألصقها في قاع غرفة مخصصة بأي هلام البترول.
3. اغسل أغطية الغطاء مرة واحدة باستخدام PBS ، واستبدلها ب Fura-2 / AM (5 μM) في محلول Tyrode (NaCl 137 mM ، KCl 5.4 mM ، MgCl₂ 1.2 mM ، الجلوكوز 10 mM ، HEPES 10 mM ، CaCl₂ 2.4 mM) (انظر جدول المواد) ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام.
4. قم بإزالة الصبغة عن طريق المعالجة بمحلول Tyrode لمدة 10 دقائق للسماح بإزالة أسترة fura-2 / AM.
5. قم بتركيب الغرفة على مسرح مجهر مضان مقلوب مجهز بنظام تصوير واسع المجال يحتوي على أحادي اللون وكاميرا CCD (انظر جدول المواد).
6. افتح النافذة الرئيسية ، وانتقل إلى مربع حوار إعدادات الاستيلاء وصفحة الكاميرا ، واضغط على الزر المباشر لعرض الصور الحية .
7. اختر نوع الصورة الفلورية ، واضبط أوقات تكرار الحلقة 340 نانومتر / 380 نانومتر ، وحجم الصورة ، ووقت تعرض الكاميرا عند 380 نانومتر و 340 نانومتر لتحقيق سطوع الصورة الأمثل.
8. التقط لقطات فردية ، وارسم عدة خطوط يدوية لوضع دائرة حول الخلايا بألوان مختلفة وتحديد منطقة الاهتمام (ROIs) مسبقا ، مع الإشارة إلى الخلفية على أنها عائد استثمار 0.
9. أعد تحرير بروتوكول مضمن بالفعل في طريقة عرض مساحة العمل وأنشئ مساحة عمل جديدة.
10. قم بتنفيذ البروتوكول ، وسيعرض "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" الرسم البياني الحركي عبر الإنترنت.
11. في طريقة العرض الرقمية ، سيكون جدول البيانات مرئيا ، ويقدم أعمدة من قيم التدرج الرمادي ومعلومات الوقت المقابلة. تصدير بيانات جدول البيانات باستخدام الحافظة.
12. احسب F340 نانومتر / F380 نانومتر مع الإشارة إلى تغييرات Ca²⁺ داخل الخلايا بعد طرح مضان الخلفية (ROI 0).

عزل وتنقية CD34⁺ VW-SCs
يتم الحصول على درجة نقاء عالية من CD34 ⁺ VW-SCs من عرضية الشريان الأبهري والمساريقي للفأر عن طريق ربط الأنسجة وفرز الميكروبيدات المغناطيسية. النسبة المئوية لخلايا CD34 ⁺ في جدار الوعاء الدموي بشكل عام 10٪ -30٪. يؤكد قياس التدفق الخلوي أن نقاء خلايا CD34 ⁺ التي تم الحصول عليها عن طريق فرز الخرزة المغناطيسية يزيد عن 90٪ (الشكل 1 أ). يظهر تلطيخ التألق المناعي الخلوي أن CD34 ⁺ VW-SCs تعبر في الغالب عن CD34 و c-kit و Flk-1 و Ki-67 ، مع تعبير أقل نسبيا عن Sca-1 (الشكل 1B).

تمايز CD34 ⁺ VW-SCs
CD34 ⁺ VW-SCs قادرة على التمايز إلى خلايا بطانية وخلايا ليفية في المختبر. يمكن حث الخلايا الجذعية CD34 ⁺ على التمايز إلى خلايا بطانية مع زيادة التعبير عن علامات الخلايا البطانية CD31 و VWF. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت خلايا الخلايا الليفية المتمايزة مورفولوجيا مغزل طويلة وزيادة التعبير عن علامات الخلايا الليفية PDGFRα و Vimentin (الشكل 2A ، B). علاوة على ذلك ، أكد قياس التدفق الخلوي أيضا قدرة الخلايا على التمايز. زادت النسبة المئوية للخلايا البطانية CD34 ⁺ CD31 ⁺ بعد التمايز 1.5 مرة مقارنة بالخلايا غير المتمايزة (الشكل 2C) ، وزادت النسبة المئوية لخلايا الخلايا الليفية CD34 ⁺ PDGFRa ⁺ بعد التمايز 1.7 مرة مقارنة بالخلايا غير المتمايزة (الشكل 2D).

توصيف إشارات Ca²⁺ في CD34 ⁺ VW-SCs
أدى إعطاء ATP خارج الخلية (10 μM) إلى زيادة مستوى الكالسيوم²⁺ داخل الخلايا من خلال مسار الإشارة بوساطة مستقبلات البروتين G (GPCR) ، ويثبط ثابسيجارجين (TG) الشبكة الساركوبلازمية (SR) Ca²⁺ ATPase (SERCA) لاستنفاد مخازن SR Ca²⁺ داخل الخلايا وتشغيل دخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر (SOCE). علاوة على ذلك ، حفز الكافيين زيادة [Ca²⁺] i عن طريق تنشيط مستقبلات الريانودين (RyRs) بوساطة إطلاق Ca²⁺ (الشكل 3).

الشكل 1: CD34 ⁺ VW-SCs المحصودة عن طريق زراعة الأنسجة وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). (أ) تقييم التدفق الخلوي ل CD34⁺ VW-SCs المنقاة. (ب) صور تمثيلية تظهر تعبير علامات الخلايا الجذعية CD34 و c-kit و Flk-1 و Sca-1 وعلامة تكاثر الخلايا (Ki-67). قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: الكشف عن قدرة التمايز متعددة الاتجاهات ل CD34⁺ VW-SCs. (أ) صور تمثيلية توضح تعبير العلامات البطانية CD31 و VWF ، وعلامات الخلايا الليفية PDGFRα و Vimentin في CD34 ⁺ VW-SCs قبل التمايز. (B) صور تمثيلية توضح تعبير العلامات البطانية CD31 و VWF ، وعلامات الخلايا الليفية PDGFRα و Vimentin في CD34 ⁺ VW-SCs بعد التمايز. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. شريط المقياس الداخلي هو 10 ميكرومتر. (ج) النسبة المئوية للخلايا البطانية CD34 ⁺ CD31 ⁺ قبل وبعد التمايز المقاس بواسطة قياس التدفق الخلوي. د: النسبة المئوية لخلايا الخلايا الليفية CD34 ⁺ PDGFRa ⁺ قبل التمايز وبعده مقاسة بواسطة قياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إشارة Ca²⁺ داخل الخلايا في CD34⁺ VW-SCs. (A) يوضح المنحنى التمثيلي تأثير ATP (10 μM) على إشارات Ca²⁺ داخل الخلايا. (B) يظهر المنحنى التمثيلي إطلاق TG (1 μM) داخل الخلايا Ca²⁺ المستحث من مخزن SR والتدفق اللاحق خارج الخلية Ca²⁺ الناجم عن استنفاد Ca²⁺ بعد إعادة إضافة 2 mM Ca²⁺. (C) منحنى تمثيلي يوضح إشارات الكافيين (10 mM) المنشطة داخل الخلايا Ca²⁺ . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توفر هذه الدراسة طريقة سريعة ومريحة للحصول على CD34 ⁺ VW-SCs الوظيفية من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية للفئران. CD34 ⁺ VW-SCs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لها نشاط تكاثري وخصائص تمايز متعددة الاتجاهات. مستقبلات إينوزيتول ثلاثي الفوسفات 1،4،5-ثلاثي الفوسفات (IP₃Rs) ، مستقبلات ريانودين (RyRs) ، وقنوات الكالسيوم التي يتم تشغيلها في المتجر تتوسط إطلاق Ca²⁺ والدخول في CD34 ⁺ VW-SCs. سيضع إنشاء هذه التقنية الأساس لمزيد من التحقيق في الآليات المشاركة في CD34 ⁺ VW-SCs المشاركة في إعادة البناء الهيكلي والوظيفي في أمراض القلب والأوعية الدموية.

تشمل الطرق الأكثر شيوعا لعزل الخلايا الأولية ارتباط كتلة الأنسجة والتفكك الأنزيمي^15,16. في هذا التقرير ، يتم الجمع بين ربط كتلة الأنسجة وفرز الخرزة المغناطيسية للحصول على نقاء عال من CD34 ⁺ VW-SCs. الخلايا الجذعية CD34 ⁺ جدار الوعاء المصنف إيجابية ل CD34 ، وقليل منها يعبر عن علامة الخلايا البطانية CD31 ، وهو ما يتوافق مع تقرير سابق². أيضا ، وجد Jiang et ^al.2 ، باستخدام تسلسل الخلية المفردة لخلايا الشريان الفخذي المعزولة حديثا في الفئران ، أن CD34 تم التعبير عنه بشكل أساسي في مجموعات الخلايا البطانية والوسيطة وليس في عدد خلايا العضلات الملساء. تؤكد التجارب في الجسم الحي أيضا أن CD34 ⁺ VW-SCs يمكن أن تتمايز إلى خلايا بطانية للمشاركة في إصلاح الأوعية الدموية بعد الإصابة. نظرا لأن VW-SCs غير متجانسة ، فإن CD34 ⁺ VW-SCs التي تم فرزها بهذه الطريقة ، جنبا إلى جنب مع العلامات الإيجابية الأخرى للخلايا الجذعية مثل Flk-1 و c-kit و Sca-1 ، لها مجموعات فرعية مختلفة ، لذلك قد يكون مورفولوجيتها مختلفا.

الطرق الأكثر استخداما لفرز الخلايا الجذعية هي قياس التدفق الخلوي وفرز الخرزة المغناطيسية^{المناعية 17،18،19}. تتميز طريقة FACS بارتفاع نقاء الخلايا ومعدل الاسترداد ، ولكن FACS تستغرق وقتا طويلا نسبيا ومكلفة. فصل الخرزة المغناطيسية المناعية هو تقنية فرز خلايا محددة للغاية تدمج نظريات علم المناعة وبيولوجيا الخلية والميكانيكا المغناطيسية. هذه الطريقة بسيطة وسريعة ويمكن إكمالها في غضون 2 ساعة. تؤثر طرق فرز الخلايا المختلفة على نقاء الخلية وتنتج²⁰. على غرار التقارير السابقة²¹ ، يبلغ قطر حبات الفرز المغناطيسية المستخدمة في هذه التجربة 50 نانومتر فقط ، مما يمارس ضغطا ميكانيكيا أقل نسبيا على الخلايا ولا يسبب تلفا للخلايا ويؤثر على النشاط البيولوجي للخلايا المصنفة. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس طريقة الفصل المذكورة في الأدبيات⁸ ، نقوم عموما بفرز الخلايا بعد مرورها لمدة 5 أجيال ، عندما يصل عدد الخلايا في قارورة T75 إلى 1 × 10⁷ على الأقل ، ويكون تكاثر الخلايا نشطا. علاوة على ذلك ، بعد زراعة الخلايا المصنفة لمدة 3-5 مقاطع ، من الضروري تكرار بروتوكول التنقية والتأكد مما إذا كان التمايز التلقائي موجودا أثناء الثقافة والممرات.

خلال الاستزراع الفرعي ل VW-SCs ، يتم استخدام وسط DMEM عالي الجلوكوز بنسبة 0.2٪ LIF ، حيث يعزز FBS تكاثر VW-SCs ، ويمنع LIF تمايز الخلايا ويدعم توسع الخلايا الجذعية. بالاتفاق مع الدراسة الحالية¹¹ ، تفضل الثقافة منخفضة الكثافة الحفاظ على جذعية فولكس فاجن - SCs ، وتزداد إمكانية التمايز الذاتي مع الممرات. علاوة على ذلك ، فإن اختيار المصل أثناء الاستزراع أمر بالغ الأهمية أيضا لأن بعض المصل من المحتمل أن يحفز التمايز الذاتي للخلايا ويؤثر على الخصائص البيولوجية¹⁰.

Ca²⁺ هو رسول ثان رئيسي يتحكم في الوظائف الخلوية المختلفة ، بما في ذلك تقلص الخلايا والهجرة والتعبير الجيني ونمو الخلايا وموت الخلايا المبرمج⁹. وصفت التقارير السابقة⁸ بإيجاز الخصائص الأساسية ل CD34 ⁺ VW-SCs ، بينما في هذه الدراسة ، اكتشفنا أيضا إطلاق Ca²⁺ من مخازن الكالسيوم الداخلية وتدفق Ca²⁺ خارج الخلية الناجم عن ATP والكافيين و TG ، على التوالي. ATP هي نيوكليوتيد لا يعتبر فقط عملة الطاقة الرئيسية داخل الخلايا ولكنه يعمل أيضا كجزيء مرسل / إشارة. يقوم ATP بتنشيط إصدار IP₃Rs بوساطة Ca²⁺ من SR وينظم نشاط أهداف المصب المتعددة. لذلك ، قد تعكس الاستجابة الخلوية ل ATP الحالة الوظيفية للخلية²². منذ فترة طويلة يستخدم الكافيين كمسبار دوائي لدراسة إطلاق Ca²⁺ داخل الخلايا بوساطة RyRs. في هذه الدراسة ، زاد كل من ATP والكافيين بسرعة داخل الخلايا Ca²⁺ ، وانخفض ارتفاع Ca²⁺ داخل الخلايا ببطء إلى خط الأساس في غضون دقيقة واحدة. علاوة على ذلك ، يوجد SOCE في معظم الخلايا غير القابلة للإثارة والقابلة للإثارة جزئيا. في هذه الدراسة ، يقوم TG بقمع إنزيم Ca^{2 +} -ATP في CD34 ⁺ VW-SCs للحث على استنفاد الكالسيوم²⁺ في SR والتوسط في تدفق Ca²⁺ الخارجي²³. يتوافق تأثير ATP والكافيين و TG على Ca²⁺ داخل الخلايا في CD34 ⁺ VW-SCs مع الخلايا الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة^24,25 ، مما يشير إلى أن الخلايا الجذعية CD34 ⁺ المعزولة في هذه الدراسة لها إطلاق طبيعي داخل الخلايا Ca²⁺ وخصائص إشارات تدفق Ca²⁺ الخارجية.

في هذه الدراسة ، يتم استزراع CD34 ⁺ VW-SCs الوظيفية من شرايين الفئران الأبهرية والمساريقي بكفاءة. قد توفر دراسة VW-SCs رؤى مهمة حول آليات إعادة تشكيل الأوعية الدموية. إن تطوير بروتوكولات مع المزيد من العلامات والدراسات الوظيفية ل CD34 ⁺ VW-SCs سيحدد دور هذه الخلايا في أمراض القلب والأوعية الدموية. يعمل تنقية الخلايا كأداة قوية للتعمق في الأسس الخلوية والجينية لتطور الأعضاء ونموها. تقدم تنقية MACS ميزة كونها طريقة ملائمة لتكرير إثراء الخلايا. عندما يقترن بتقنيات أخرى ، مثل تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي ، فإن لديه القدرة على الكشف عن آليات جديدة تكمن وراء تكاثر الخلايا الجذعية والهجرة والتمايز في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية¹². يسهل هذا النهج الفحص المنهجي للعوامل البيولوجية ومكونات المصفوفة خارج الخلية والجزيئات الصغيرة التي إما تعزز أو تمنع الوظائف الأساسية للخلايا الجذعية. إن إجراء مثل هذه الدراسات يفتح فرصا فريدة لإجراء تجارب فقدان الوظيفة واكتساب الوظيفة ، مما يساهم في نهاية المطاف في فهم أعمق للأساس الجيني لأمراض القلب والأوعية الدموية. هناك أيضا بعض القيود في هذه الطريقة. على سبيل المثال ، بسبب عدم التجانس الظاهري والوظيفي لخلايا CD34 ⁺ في جدار الأوعية الدموية ، ستحتاج إلى المزيد من العلامات لتحديد النوع دون الخلوي المحدد لخلايا CD34 ⁺ الوعائية المقيمة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تم تمويل هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070502 ، 31972909 ، 32171099) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (23NSFSC0576 ، 2022YFS0607). يود المؤلفون أن يشكروا Qingbo Xu من جامعة Zhejiang للمساعدة في زراعة الخلايا ، ويعترف المؤلفون بالمساعدة العلمية والتقنية لمنصة قياس التدفق الخلوي في جامعة ساوث ويست الطبية.