Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare dai topi

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare (CD34⁺ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Le cellule staminali e progenitrici residenti nella parete vascolare CD34⁺ (VW-SC) sono sempre più riconosciute per il loro ruolo cruciale nella regolazione del danno vascolare e della riparazione. Stabilire un metodo stabile ed efficiente per coltivare VW-SC CD34⁺ murini funzionali è essenziale per studiare ulteriormente i meccanismi coinvolti nella proliferazione, migrazione e differenziazione di queste cellule in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Il metodo descritto combina lo screening a biglie magnetiche e la citometria a flusso per purificare i VW-SC CD34⁺ residenti primari in coltura. Le cellule purificate vengono quindi identificate funzionalmente attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging con Ca²⁺ . In breve, le cellule vascolari dall'avventizia dell'aorta murina e dell'arteria mesenterica vengono ottenute attraverso l'attacco di blocchi di tessuto, seguito da subcoltura fino a raggiungere una conta cellulare di almeno 1 × 10⁷. Successivamente, i VW-SC CD34⁺ vengono purificati mediante smistamento a biglie magnetiche e citometria a flusso. L'identificazione delle VW-SC CD34⁺ comporta la colorazione con immunofluorescenza cellulare, mentre la multipotenza funzionale viene determinata esponendo le cellule a un terreno di coltura specifico per la differenziazione orientata. Inoltre, il rilascio funzionale interno di Ca²⁺ e l'ingresso esterno di Ca²⁺ vengono valutati utilizzando una workstation di imaging disponibile in commercio in cellule caricate con Fura-2/AM esposte ad ATP, caffeina o tapsigargina (TG). Questo metodo offre una tecnica stabile ed efficiente per isolare, coltivare e identificare le cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare, fornendo l'opportunità di studi in vitro sui meccanismi regolatori delle VW-SC e lo screening di farmaci mirati.

La parete vascolare svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo vascolare, nella regolazione omeostatica e nella progressione delle malattie vascolari. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno svelato la presenza di vari lignaggi di cellule staminali nelle arterie. Nel 2004, il gruppo del professor Qingbo Xu ha riportato per la prima volta l'esistenza di cellule staminali/progenitrici vascolari nella periferia della parete vascolare adulta, che esprimono CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Queste cellule staminali vascolari mostrano un potenziale di differenziazione e proliferazione multidirezionale. In condizioni normali, rimangono relativamente quiescenti; Tuttavia, se attivati da fattori specifici, possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule endoteliali e fibroblasti. In alternativa, possono regolare la matrice perivascolare e la formazione di microvasi attraverso effetti paracrini per promuovere la riparazione o il rimodellamento dei vasi danneggiati 2,3,4,5,6. Recentemente, è stato scoperto che le cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare svolgono un ruolo nella rigenerazione delle cellule endoteliali dopo una lesione del filo guida dell'arteria femorale². Di conseguenza, l'isolamento e la quantificazione delle VW-SC CD34⁺ e l'esame delle caratteristiche biologiche di base delle cellule staminali CD34⁺ sono cruciali per studiare ulteriormente le vie di segnale coinvolte nella regolazione delle VW-SC CD34⁺.

Attualmente sono disponibili vari metodi per la separazione cellulare, comprese le tecniche basate sulle caratteristiche della coltura cellulare o sulle proprietà fisiche delle cellule, come la centrifugazione in gradiente di densità, che si traduce in cellule selezionate contenenti molte cellule non bersaglio e una purezza relativamente bassa 7,8,9,10,11,12 . Un'altra tecnica comunemente usata è la selezione cellulare a fluorescenza/magnetica. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è un sistema complesso con elevati requisiti tecnici ed è relativamente costoso, richiede molto tempo e potenzialmente influisce sull'attività delle cellule selezionate^13,14. Tuttavia, lo smistamento cellulare attivato da magneti (MACS) è più efficiente e conveniente, con un alto tasso di recupero e attività cellulare e un minore impatto sulle applicazioni a valle⁸. Pertanto, in questo protocollo, abbiamo applicato MACS per purificare i VW-SC CD34⁺ e abbiamo ulteriormente identificato le cellule mediante citometria a flusso. La creazione di metodi di isolamento basati su MACS per lo studio delle cellule staminali della parete vascolare sarebbe inestimabile. In primo luogo, consente studi sperimentali di genetica e biologia cellulare. In secondo luogo, l'isolamento e la coltura efficienti delle cellule staminali residenti nella parete vascolare consentono la valutazione sistematica e lo screening dei fattori di segnalazione che regolano le funzioni delle cellule staminali. In terzo luogo, l'identificazione di fenotipi cruciali nelle cellule staminali fornisce un importante "controllo di qualità" nella valutazione dello stato cellulare. Pertanto, l'identificazione di metodi di purificazione potrebbe essere utile per applicazioni simili a cellule staminali analoghe derivate da vasi.

Questo rapporto fornisce una dimostrazione dettagliata di un metodo stabile e affidabile per la coltura di VW-SC CD34⁺ , compresa l'identificazione cellulare e la valutazione funzionale eseguita mediante citometria a flusso, colorazione in immunofluorescenza e misurazione della segnalazione del Ca²⁺ . Questo studio fornisce una base per ulteriori ricerche approfondite sulla funzione dei VW-SC CD34⁺ e sui loro meccanismi di regolazione in condizioni fisiologiche e patologiche.

Questo studio è stato approvato e gli animali sono stati gestiti in conformità con le linee guida per la gestione e l'uso di animali da laboratorio in Cina. La ricerca ha aderito rigorosamente ai requisiti etici degli esperimenti sugli animali, con l'approvazione del Comitato Etico Animale (Numero di approvazione: SWMU2020664). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57BL/6 sani di otto settimane di entrambi i sessi, di peso compreso tra 18 e 20 g. Gli animali sono stati ospitati presso il Laboratory Animal Center della Southwest Medical University (SWMU).

1. Coltura a blocchi tissutali di avventizia da aorta e arterie mesenteriche

1. Isolamento VW-SC CD34⁺ residente
   1. Anestetizzare due topi con inalazione di isoflurano al 3% (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare un'adeguata anestesia con un pizzico di punta. Posizionare il topo supino con nastro adesivo e spruzzare disinfettante all'etanolo al 70% per disinfettare il pelo del topo. Apri le cavità toraciche e addominali usando forbici oftalmiche sterili e pinze per esporre il cuore e l'intestino. Dopo aver sezionato l'aorta isolata e le arterie mesenteriche, fissare l'aorta e il letto mesenterico in una capsula di Petri contenente elastomero di silicio e riempita con una soluzione salina fisiologica. Con un altro set di forbici e pinze sterilizzate, seziona rapidamente il grasso intorno all'aorta e alle arterie mesenteriche.
   2. Trasferire i tessuti sezionati in una piastra di Petri da 6 cm contenente una soluzione all'1% di penicillina-streptomicina-amfotericina B (vedere la tabella dei materiali). Dopo aver risciacquato due volte, trasferire le arterie in una cappa di coltura tissutale sotto uno stereomicroscopio.
   3. Tagliare le arterie longitudinalmente e utilizzare una pinza sottile per staccare lo strato esterno dell'aorta e il primo ramo delle arterie mesenteriche. Trasferire gli strati esterni in una piastra di Petri da 3,5 cm contenente 0,1-0,2 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali). Tagliare gli strati esterni in piccoli pezzi (circa 1 mm³).
   4. Trasferire i pezzi di tessuto in un pallone T25 rivestito di gelatina, garantendo una distribuzione uniforme sul fondo del pallone. Mantenere una distanza moderata tra i pezzi di tessuto per facilitare la scansione e la crescita delle cellule. Porre il matraccio verticalmente in un'incubatrice (37 °C, 5% CO₂) per 3 ore in modo che i blocchi di tessuto aderiscano al fondo del pallone.
   5. Dopo 3 ore, aggiungere 5 ml di terreno di coltura ad alto contenuto di glucosio DMEM per immergere i blocchi di tessuto. Orientare il pallone T25 orizzontalmente. Monitora la migrazione cellulare attorno ai blocchi di tessuto attraverso un microscopio a intervalli di 3 giorni.
      NOTA: Il terreno deve contenere il 20% di siero fetale bovino, lo 0,2% di fattore inibitorio della leucemia (LIF), 0,2 mM di β-mercaptoetanolo e l'1% di penicillina/streptomicina (vedere la Tabella dei materiali). Il siero fetale bovino supporta la proliferazione cellulare, mentre il LIF e il β-mercaptoetanolo ostacolano la differenziazione cellulare ^7,8.
   6. Quando le cellule nel pallone T25 raggiungono circa l'80% di confluenza, passarle e coltivarle in uno o due flaconi T75. Subcoltura delle cellule in cinque passaggi per garantire una crescita e una salute adeguate.
2. Separazione magnetica delle cellule staminali CD34⁺ residenti
   1. Quando le cellule in uno o due flaconi T75 raggiungono l'80% di confluenza, dissociare le cellule con la tripsina e risospenderle in 1 mL di tampone di smistamento (2 mM EDTA e 0,5% FBS). Determinare il numero di cellule (matraccio 10⁷/T75) e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti (a temperatura ambiente).
   2. Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet di cella in 98 μl di tampone di selezione per 10-7 celle totali. Aggiungere 2 μL di anticorpo CD34 (vedere la Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti a 4°C al buio con agitare di tanto in tanto.
   3. Lavare le celle aggiungendo 2 mL di tampone di selezione e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il surnatante con cura e completamente e risospendere le cellule in 80 μl di tampone di selezione.
   5. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-FITC (per 10-7 celle totali, vedere la tabella dei materiali) nel tampone. Mescolare bene con pipettaggio ripetuto e incubare per 15 minuti a 4 °C al buio con agitazione intermittente.
   6. Lavare le celle due volte aggiungendo 2 mL di tampone e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per ripellettare le cellule. Scartare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone.
   7. Posizionare una colonna MS all'interno del campo magnetico di un separatore appropriato, assicurandosi che una provetta di raccolta (ad esempio, una provetta da centrifuga da 15 mL) sia posizionata sotto la colonna MS per raccogliere i componenti separati. (vedi Tabella dei materiali). Sciacquare la colonna con un tampone da 500 μl e attendere che sia completamente attraversata.
   8. Caricare la sospensione cellulare nella colonna e raccogliere il flusso contenente le cellule non marcate nella provetta da 15 mL.
   9. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Introdurre 500 μl di tampone nella colonna, quindi sciacquare prontamente le celle marcate magneticamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
   10. Per migliorare la purezza delle cellule CD34⁺ , la frazione eluita può essere arricchita utilizzando una seconda colonna MS. Ripetere il processo di separazione come menzionato sopra. Valutare la purezza delle cellule selezionate tramite citometria a flusso.
       NOTA: In genere, si ottengono il 10%-20% di cellule CD34⁺ , con circa il 70%-80% di cellule negative e circa il 10% di perdita dovuta a procedure di colorazione e centrifugazione.
   11. Per confermare ulteriormente la purezza delle cellule staminali CD34⁺ della parete vascolare, identificare le cellule selezionate mediante citometria a flusso. Il presente studio ha dimostrato una purezza superiore al 90%.

2. Identificazione cellulare mediante immunofluorescenza

1. Cellule di semina su vetrini coprioggetti (diametro 8 mm) pre-rivestite con gelatina allo 0,04%.
2. Quando le cellule raggiungono circa il 60%-70% di confluenza, sciacquare due volte con PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti.
3. Lavare le celle con PBS per 3 minuti (3 volte) e permeabilizzare le celle con Triton X-100 allo 0,2% (in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule con PBS per 3 minuti (3 volte) e bloccare il legame non specifico degli anticorpi con il 5% di siero d'asina (in PBS) per 1 ora.
5. Rimuovere il tampone di bloccaggio tenendo ciascun vetrino coprioggetti sul bordo con una pinza e scaricandolo su un foglio di salvietta priva di lanugine.
6. Incubare le cellule in anticorpi primari diluiti 100 volte (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, vedi Tabella dei materiali) in BSA all'1% (in PBS) per una notte a 4 °C.
7. Decantare la soluzione e lavare le celle con PBS per 3 minuti (3 volte). Incubare le cellule con l'anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 (1:200 in 1% BSA) (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
8. Eseguire la controcolorazione DAPI diluendo la soluzione madre DAPI a 0,5 μg/mL in PBS e incubando le cellule per 5 minuti.
9. Risciacquare con PBS e sigillare i vetrini coprioggetti con un reagente antisbiadimento. Acquisizione di immagini con il microscopio confocale a scansione laser.

3. Differenziamento indotto e caratterizzazione di VW-SC CD34⁺

1. Seminare cellule staminali CD34⁺ a una densità appropriata (40%-50% di confluenza) rispettivamente su vetrini coprioggetti e piastre a 6 pozzetti.
2. Indurre la differenziazione orientata alle cellule endoteliali dalle cellule CD34⁺ coltivando le cellule nel terreno di coltura cellulare endoteliale EBM-2 (vedi Tabella dei materiali) per 1 settimana.
3. Indurre la differenziazione orientata alle cellule dei fibroblasti dalle cellule CD34⁺ coltivando le cellule nel terreno di coltura cellulare dei fibroblasti FM-2 (vedi Tabella dei materiali) per 3 giorni.
4. Sottoporre le cellule indifferenziate e differenziate a colorazione in immunofluorescenza (come indicato nel passaggio 2) con eccitazione laser di 488 nm e obiettivo 40x. Rilevare l'espressione dei marcatori delle cellule endoteliali (CD31, VWF) e dei marcatori delle cellule dei fibroblasti (PDGFRα, Vimentina) (vedere la Tabella dei Materiali).
5. Dissociare le cellule con la tripsina e ottenere il pellet cellulare per centrifugazione (300 x g, 5 min, temperatura ambiente). Risospendere le cellule con 100 μL di tampone di smistamento. Preincubare la sospensione cellulare con anticorpi monoclonali purificati anti-topo CD16/CD32 (1 μg) (vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C per 5 minuti.
6. Aggiungere 2 μL di PE Rat Anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody APC (2 μL, 1:50) e CD140a (PDGFRa) Monoclonal Antibody FITC (2 μL, 1:50) direttamente alle cellule preincubate in presenza di Mouse Fc Block e incubare ulteriormente a 4 °C per 15 minuti.
7. Lavare le celle due volte aggiungendo 2 mL di tampone e centrifugare a 300 x g per 5 minuti (temperatura ambiente) per ripellettare le cellule. Scartare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 300 μL di tampone. Inserire le provette di flusso con le cellule colorate in una ghiacciaia pronta per la citometria a flusso.

4. Rilevamento della segnalazione intracellulare del Ca²⁺ nelle cellule staminali vascolari CD34+

1. Cellule seme su vetrini coprioggetti 10 ore prima degli esperimenti a una densità fino al 70% di confluenza.
2. Estrarre i vetrini coprioggetti e attaccarli sul fondo di una camera personalizzata con eventuale vaselina.
3. Lavare i vetrini una volta con PBS, sostituirli con Fura-2/AM (5 μM) nella soluzione di Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (vedere la Tabella dei materiali) e incubare le cellule per 30 minuti al buio.
4. Rimuovere il colorante trattando con la soluzione di Tyrode per 10 minuti per consentire la deesterificazione della fura-2/AM.
5. Montare la camera sul tavolino di un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un sistema di imaging ad ampio campo contenente un monocromatore e una telecamera CCD (vedi Tabella dei materiali).
6. Apri la finestra principale, vai alla finestra di dialogo Grab Settings e alla pagina della fotocamera e premi il pulsante live per la visualizzazione dell'immagine live .
7. Scegli il tipo di immagine a fluorescenza, imposta i tempi di ripetizione del loop a 340 nm/380 nm, le dimensioni dell'immagine e il tempo di esposizione della fotocamera a 380 nm e 340 nm per ottenere una luminosità ottimale dell'immagine.
8. Scatta singole istantanee e disegna diverse linee a mano libera per cerchiare le celle con colori diversi e predefinire la regione di interesse (ROI), indicando lo sfondo come ROI 0.
9. Modificare nuovamente un protocollo già incorporato nella visualizzazione dell'area di lavoro e creare una nuova area di lavoro.
10. Esegui il protocollo e il "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" visualizzerà il grafico cinetico online.
11. Nella vista numerica, sarà visibile un foglio di calcolo che presenta colonne di valori in scala di grigi e le informazioni temporali corrispondenti. Esporta i dati del foglio di calcolo utilizzando gli appunti.
12. Calcolare F340 nm/F380 nm che indica le variazioni intracellulari di Ca²⁺ dopo aver sottratto la fluorescenza di fondo (ROI 0).

Isolamento e purificazione di VW-SC CD34⁺
L'elevata purezza dei VW-SC CD34⁺ è ottenuta dall'avventizia dell'arteria aortica e mesenterica di topo mediante attacco tissutale e selezione di microsfere magnetiche. La percentuale di cellule CD34⁺ nella parete del vaso è generalmente del 10%-30%. La citometria a flusso conferma che la purezza delle cellule CD34⁺ ottenute mediante smistamento con biglie magnetiche è superiore al 90% (Figura 1A). La colorazione in immunofluorescenza cellulare mostra che i VW-SC CD34⁺ esprimono prevalentemente CD34, c-kit, Flk-1 e Ki-67, con un'espressione relativamente più bassa di Sca-1 (Figura 1B).

Differenziazione dei VW-SC CD34⁺
Le VW-SC CD34⁺ sono in grado di differenziarsi in cellule endoteliali e fibroblasti in vitro. Le cellule staminali CD34⁺ potrebbero essere indotte a differenziarsi in cellule endoteliali con una maggiore espressione dei marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VWF. Inoltre, le cellule di fibroblasti differenziate hanno mostrato una lunga morfologia del fuso e un aumento dell'espressione dei marcatori dei fibroblasti PDGFRα e Vimentina (Figura 2A, B). Inoltre, la citometria a flusso ha anche confermato la capacità di differenziazione delle cellule; la percentuale di cellule endoteliali CD34⁺CD31⁺ dopo la differenziazione è aumentata di 1,5 volte rispetto alle cellule indifferenziate (Figura 2C) e la percentuale di cellule di fibroblasti CD34⁺PDGFRa⁺ dopo la differenziazione è aumentata di 1,7 volte rispetto alle cellule indifferenziate (Figura 2D).

Caratterizzazione del segnale del Ca²⁺ nei VW-SC CD34⁺
La somministrazione extracellulare di ATP (10 μM) ha aumentato il livello intracellulare di Ca²⁺ attraverso la via del segnale mediata dai recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) e la tapsigargina (TG) ha inibito il reticolo sarcoplasmatico (SR) Ca²⁺ ATPasi (SERCA) per esaurire le riserve intracellulari di SR Ca²⁺ e innescare l'ingresso di calcio operato dal negozio (SOCE). Inoltre, la caffeina ha stimolato l'aumento di [Ca²⁺]i attivando il rilascio di Ca²⁺ mediato dai recettori della rianodina (RyR) (Figura 3).

Figura 1: VW-SC CD34⁺ raccolti mediante coltura tissutale e smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS). (A) Valutazione citofluorimetrica di VW-SC CD34⁺ purificati. (B) Immagini rappresentative che mostrano l'espressione dei marcatori delle cellule staminali CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 e del marcatore di proliferazione cellulare (Ki-67). Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rilevamento della capacità di differenziazione multidirezionale delle VW-SC CD34⁺ . (A) Immagini rappresentative che mostrano l'espressione dei marcatori endoteliali CD31 e VWF e dei marcatori dei fibroblasti PDGFRα e Vimentina nelle VW-SC CD34⁺ prima della differenziazione. (B) Immagini rappresentative che mostrano l'espressione dei marcatori endoteliali CD31 e VWF e dei marcatori dei fibroblasti PDGFRα e Vimentina nei VW-SC CD34⁺ dopo la differenziazione. Barre di scala: 50 μm. La barra della scala interna è di 10 μm. (C) La percentuale di cellule endoteliali CD34⁺CD31⁺ prima e dopo la differenziazione misurata mediante citometria a flusso. (D) La percentuale di cellule di fibroblasti CD34⁺PDGFRa⁺ prima e dopo la differenziazione misurata mediante citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Segnale intracellulare del Ca²⁺ nei VW-SC CD34⁺ . (A) La curva rappresentativa mostra l'effetto dell'ATP (10 μM) sulla segnalazione intracellulare del Ca²⁺ . (B) La curva rappresentativa mostra il rilascio intracellulare di Ca²⁺ indotto da TG (1 μM) dal deposito SR e il successivo afflusso extracellulare di Ca²⁺ innescato dalla deplezione di Ca²⁺ dopo la reaggiunta di 2 mM di Ca²⁺. (C) Curva rappresentativa che mostra la segnalazione intracellulare del Ca²⁺ attivata dalla caffeina (10 mM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio fornisce un metodo rapido e conveniente per ottenere VW-SC CD34⁺ funzionali dall'aorta e dalle arterie mesenteriche dei topi. I VW-SC CD34⁺ ottenuti con questo metodo hanno attività proliferativa e proprietà di differenziazione multidirezionale. I recettori del trifosfato inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP₃Rs), i recettori della rianodina (RyRs) e i canali del calcio gestiti in negozio mediano il rilascio e l'ingresso di Ca²⁺ nelle VW-SC CD34⁺ . L'istituzione di questa tecnica getterà le basi per ulteriori indagini sui meccanismi coinvolti nelle VW-SC CD34⁺ che partecipano al rimodellamento strutturale e funzionale nelle malattie cardiovascolari.

I metodi più comuni per l'isolamento delle cellule primarie includono l'attacco del blocco tissutale e la dissociazione enzimatica^15,16. Nel presente rapporto, l'attacco del blocco di tessuto e la selezione delle biglie magnetiche sono combinate per ottenere un'elevata purezza dei VW-SC CD34⁺. Le cellule staminali CD34⁺ della parete dei vasi selezionati sono positive per CD34 e poche esprimono il marcatore delle cellule endoteliali CD31, che è coerente con un precedente rapporto². Inoltre, Jiang et ^al.2, utilizzando il sequenziamento di singole cellule dell'arteria femorale appena isolate nei topi, hanno scoperto che il CD34 era espresso principalmente nelle popolazioni di cellule endoteliali e mesenchimali e non nella popolazione di cellule muscolari lisce. Gli esperimenti in vivo confermano anche che le VW-SC CD34⁺ possono differenziarsi in cellule endoteliali per partecipare alla riparazione vascolare dopo l'infortunio. Poiché le VW-SC sono eterogenee, le VW-SC CD34⁺ selezionate con questo metodo, insieme ad altri marcatori positivi per le cellule staminali come Flk-1, c-kit e Sca-1, hanno sottopopolazioni diverse, quindi la loro morfologia potrebbe essere diversa.

I metodi più utilizzati per la selezione delle cellule staminali sono la citometria a flusso e la selezione immunomagnetica delle microsfere 17,18,19. Il metodo FACS è caratterizzato da un'elevata purezza cellulare e da un elevato tasso di recupero, ma il FACS richiede relativamente tempo e denaro. La separazione immunomagnetica delle microsfere è una tecnologia di smistamento cellulare altamente specifica che integra le teorie dell'immunologia, della biologia cellulare e della meccanica magnetica. Questo metodo è semplice e veloce e può essere completato in 2 ore. Diversi metodi di selezione cellulare influiscono sulla purezza e sulla resa cellulare²⁰. Analogamente ai precedenti rapporti²¹, le sfere magnetiche di selezione utilizzate in questo esperimento hanno un diametro di soli 50 nm, che esercita una pressione meccanica relativamente inferiore sulle cellule e non causa danni alle cellule e non influisce sull'attività biologica delle cellule selezionate. Inoltre, a differenza del metodo di separazione riportato in letteratura⁸, generalmente selezioniamo le cellule dopo essere state fatte passare per 5 generazioni, quando il numero di cellule in un pallone T75 può raggiungere almeno 1 × 10⁷ e la proliferazione cellulare è attiva. Inoltre, dopo che le cellule selezionate sono state coltivate per 3-5 passaggi, è fondamentale ripetere il protocollo di purificazione e assicurarsi che esista un'auto-differenziazione durante la coltura e i passaggi.

Durante la sottocoltura dei VW-SC, viene utilizzato un terreno ad alto glucosio DMEM con 0,2% di LIF, in cui FBS promuove la proliferazione dei VW-SC e LIF inibisce la differenziazione cellulare e supporta l'espansione delle cellule staminali. In accordo con lo studio esistente¹¹, la coltura a bassa densità favorisce il mantenimento della staminalità dei VW-SC e la possibilità di autodifferenziazione aumenta con i passaggi. Inoltre, anche la selezione del siero durante la coltura è fondamentale poiché alcuni sieri indurranno potenzialmente l'autodifferenziazione cellulare e influenzeranno le caratteristiche biologiche¹⁰.

Il Ca²⁺ è un secondo messaggero importante che controlla varie funzioni cellulari, tra cui la contrazione cellulare, la migrazione, l'espressione genica, la crescita cellulare e l'apoptosi⁹. I rapporti precedenti⁸ descrivevano solo brevemente le caratteristiche di base dei VW-SC CD34⁺, mentre in questo studio abbiamo ulteriormente rilevato il rilascio di Ca²⁺ dalle riserve interne di calcio e l'afflusso extracellulare di Ca²⁺ innescato rispettivamente da ATP, caffeina e TG. L'ATP è un nucleotide che non solo è considerato la principale valuta energetica all'interno delle cellule, ma agisce anche come molecola trasmettitrice/segnalatrice. L'ATP attiva il rilascio di Ca²⁺ mediato da IP₃Rs dall'SR e regola l'attività di più bersagli a valle. Pertanto, la risposta cellulare all'ATP può riflettere lo stato funzionale della cellula²². La caffeina è stata a lungo utilizzata come sonda farmacologica per studiare il rilascio intracellulare di Ca²⁺ mediato da RyR. In questo studio, sia l'ATP che la caffeina sono aumentati rapidamente di Ca²⁺ intracellulare e l'elevato Ca²⁺ intracellulare è diminuito lentamente fino al basale entro 1 minuto. Inoltre, SOCE è presente nella maggior parte delle cellule non eccitabili e parzialmente eccitabili. Nel presente studio, la TG sopprime l'enzima Ca²⁺-ATP nelle VW-SC CD34⁺ per indurre la deplezione di Ca²⁺ nella SR e mediare l'afflusso esterno di Ca^{2+ 23}. L'effetto di ATP, caffeina e TG sul Ca²⁺ intracellulare nelle VW-SC CD34⁺ è coerente con altre cellule riportate in studi precedenti^24,25, suggerendo che le cellule staminali CD34⁺ isolate in questo studio hanno normali proprietà di rilascio intracellulare^{di Ca 2+} e di segnalazione esterna dell'afflusso di Ca²⁺.

In questo studio, le VW-SC CD34⁺ funzionali delle arterie aortiche e mesenteriche di topo vengono coltivate in modo efficiente. Lo studio delle VW-SC può fornire informazioni significative sui meccanismi del rimodellamento vascolare. Lo sviluppo di protocolli con più marcatori e studi funzionali di VW-SC CD34⁺ definirà ulteriormente il ruolo di queste cellule nelle malattie cardiovascolari. La purificazione cellulare è un potente strumento per approfondire le basi cellulari e genetiche dello sviluppo e della crescita degli organi. La purificazione MACS presenta il vantaggio di essere un metodo conveniente per raffinare l'arricchimento cellulare. Se abbinato ad altre tecniche, come l'analisi del sequenziamento dell'RNA, ha il potenziale per svelare nuovi meccanismi alla base della proliferazione, migrazione e differenziazione delle cellule staminali in contesti sia fisiologici che patologici¹². Questo approccio facilita lo screening sistematico di fattori biologici, componenti della matrice extracellulare e piccole molecole che promuovono o inibiscono le funzioni fondamentali delle cellule staminali. La conduzione di tali studi apre opportunità uniche per l'esecuzione di esperimenti di perdita di funzione e guadagno di funzione, contribuendo in ultima analisi a una comprensione più profonda delle basi genetiche delle malattie cardiovascolari. Ci sono anche alcune limitazioni all'interno di questo metodo. Ad esempio, a causa dell'eterogeneità fenotipica e funzionale delle cellule CD34⁺ nella parete vascolare, saranno necessari più marcatori per identificare il tipo subcellulare specifico delle cellule vascolari CD34⁺ residenti.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 82070502, 31972909, 32171099), del Sichuan Science and Technology Program della provincia del Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Gli autori desiderano ringraziare Qingbo Xu dell'Università di Zhejiang per l'aiuto con la coltura cellulare e gli autori riconoscono l'assistenza scientifica e tecnica della piattaforma di citometria a flusso della Southwest Medical University.