Иммуномагнитная изоляция CD34⁺ стволовых клеток сосудистой стенки от мышей

В этом исследовании был разработан стабильный и эффективный метод выделения, культивирования и функционального определения CD34⁺ стволовых клеток сосудистой стенки (CD34⁺ VW-SCs). Этот простой в использовании и эффективный по времени метод изоляции может быть использован другими исследователями для изучения потенциальных механизмов, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Резидентные CD34⁺ резидентные стволовые и прогениторные клетки сосудистой стенки (VW-SCs) получают все большее признание за их решающую роль в регулировании повреждения и восстановления сосудов. Создание стабильного и эффективного метода культивирования функциональных мышиных CD34⁺ VW-SC имеет важное значение для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в пролиферации, миграции и дифференцировке этих клеток при различных физиологических и патологических условиях. Описанный метод сочетает в себе скрининг магнитных шариков и проточную цитометрию для очистки первичных культивируемых резидентных CD34⁺ VW-SC. Затем очищенные клетки функционально идентифицируются с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации Ca²⁺ . Вкратце, сосудистые клетки из адвентиции мышиной аорты и брыжеечной артерии получают путем прикрепления тканевых блоков с последующим субкультивированием до достижения количества клеток не менее 1 × 10⁷. Впоследствии CD34⁺ VW-SC очищают с помощью магнитной сортировки шариков и проточной цитометрии. Идентификация CD34⁺ VW-SC включает клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание, в то время как функциональная мультипотентность определяется путем воздействия на клетки специфической питательной среды для ориентированной дифференцировки. Кроме того, функциональный внутренний выброс Ca²⁺ и внешний вход Ca²⁺ оцениваются с помощью коммерчески доступной рабочей станции визуализации в нагруженных Fura-2/AM клетках, подвергшихся воздействию АТФ, кофеина или тапсигаргина (TG). Этот метод предлагает стабильную и эффективную технику выделения, культивирования и идентификации CD34⁺ стволовых клеток в сосудистой стенке, обеспечивая возможность проведения in vitro исследований регуляторных механизмов VW-SC и скрининга таргетных препаратов.

Сосудистая стенка играет ключевую роль в развитии сосудов, гомеостатической регуляции и прогрессировании сосудистых заболеваний. В последние годы многочисленные исследования выявили наличие различных линий стволовых клеток в артериях. В 2004 году группа профессора Цинбо Сюя впервые сообщила о существовании сосудистых стволовых/прогениторных клеток на периферии сосудистой стенки взрослого человека, экспрессирующих CD34, Sca-1, c-kit и Flk-1¹. Эти сосудистые стволовые клетки демонстрируют разнонаправленный потенциал дифференцировки и пролиферации. В нормальных условиях они остаются относительно спокойными; Однако при активации определенными факторами они могут дифференцироваться в гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. Кроме того, они могут регулировать периваскулярный матрикс и формирование микрососудов посредством паракринных эффектов, способствуя восстановлению или ремоделированию поврежденных сосудов 2,3,4,5,6. Недавно было обнаружено, что резидентные CD34⁺ стволовые клетки в сосудистой стенке играют роль в регенерации эндотелиальных клеток после повреждения проводника бедренной артерии². Следовательно, выделение и количественное определение CD34⁺ VW-SC и изучение основных биологических характеристик стволовых клеток CD34⁺ имеют решающее значение для дальнейшего изучения сигнальных путей, участвующих в регуляции CD34⁺ VW-SC.

В настоящее время доступны различные методы разделения клеток, в том числе методы, основанные на характеристиках клеточной культуры или физических свойствах клеток, такие как центрифугирование с градиентом плотности, в результате которого сортируемые клетки содержат много клеток, не являющихся мишенями, и относительно низкую чистоту 7,8,9,10,11,12 . Еще одним часто используемым методом является флуоресцентная/магнитная сортировка клеток. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) является сложной системой с высокими техническими требованиями, относительно дорогой, трудоемкой и потенциально влияет на активность сортируемых клеток^13,14. Тем не менее, магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) более эффективна и удобна, с высокой скоростью восстановления и активностью клеток и меньшим воздействием на последующие приложения⁸. Поэтому в этом протоколе мы применили MACS для очистки CD34⁺ VW-SC и далее идентифицировали клетки с помощью проточной цитометрии. Создание методов выделения на основе MACS для изучения стволовых клеток сосудистой стенки было бы неоценимым. Во-первых, это позволяет проводить экспериментальные генетические и клеточные биологические исследования. Во-вторых, эффективное выделение и культивирование резидентных стволовых клеток сосудистой стенки позволяет проводить систематическую оценку и скрининг сигнальных факторов, регулирующих функции стволовых клеток. В-третьих, идентификация важнейших фенотипов в стволовых клетках обеспечивает важный «контроль качества» при оценке клеточного статуса. Таким образом, определение методов очистки может быть полезным для аналогичных применений к аналогичным стволовым клеткам, полученным из сосудов.

В этом отчете представлена подробная демонстрация стабильного и надежного метода культивирования CD34⁺ VW-SC, включая идентификацию клеток и функциональную оценку, выполненную с помощью проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и измерения передачи сигналов Ca²⁺ . Данное исследование является основой для дальнейших углубленных исследований функции CD34⁺ VW-SC и их регуляторных механизмов при физиологических и патологических состояниях.

Это исследование было одобрено, и с животными обращались в соответствии с Руководством по обращению с лабораторными животными и их использованию в Китае. Исследование строго соответствовало этическим требованиям экспериментов на животных, с одобрения Комитета по этике животных (номер одобрения: SWMU2020664). Для настоящего исследования были использованы восьминедельные здоровые мыши C57BL/6 любого пола с массой от 18 до 20 г. Животные были размещены в Центре лабораторных животных Юго-Западного медицинского университета (SWMU).

1. Культура блокады тканей адвентиции из аорты и брыжеечных артерий

1. Резидентная изоляция CD34⁺ VW-SCs
   1. Обезболить двух мышей ингаляцией 3% изофлурана (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердить адекватную анестезию можно путем щипкования пальцев ног. Расположите мышь на спине с помощью медицинской ленты и распылите 70% этанол дезинфицирующим средством для дезинфекции шерсти мыши. Вскройте грудную и брюшную полости с помощью стерильных офтальмологических ножниц и щипцов, чтобы обнажить сердце и кишечник. После рассечения изолированных артерий аорты и брыжейки закрепите аорту и брыжеечное русло в чашке Петри, содержащей силиконовый эластомер и заполненной физиологическим раствором соли. С помощью другого набора стерилизованных ножниц и щипцов быстро удалите жир вокруг аорты и брыжеечных артерий.
   2. Перенесите рассеченные ткани в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую 1% раствор пенициллин-стрептомицин-амфотерицина В (см. Таблицу материалов). После двукратного промывания перенесите артерии в капюшон для культуры тканей под стереомикроскопом.
   3. Разрежьте артерии в продольном направлении и с помощью тонких щипцов отклейте наружный слой аорты и первую ветвь брыжеечных артерий. Переложите внешние слои в чашку Петри диаметром 3,5 см, содержащую 0,1-0,2 мл питательной среды (см. Таблицу материалов). Внешние слои нарезать на мелкие кусочки (примерно 1 мм³).
   4. Переложите кусочки салфетки в колбу T25 с желатиновым покрытием, обеспечивая равномерное распределение по дну колбы. Соблюдайте умеренное расстояние между кусочками ткани, чтобы облегчить ползание и рост клеток. Поместите колбу вертикально в инкубатор (37 °C, 5%_CO2) на 3 часа, чтобы тканевые блоки прилипли к дну колбы.
   5. Через 3 ч добавьте 5 мл питательной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, чтобы погрузить блоки тканей. Расположите колбу T25 горизонтально. Отслеживайте миграцию клеток вокруг тканевых блоков с помощью микроскопа с интервалом в 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда должна содержать 20% фетальной бычьей сыворотки, 0,2% фактора ингибирования лейкемии (ЛИФ), 0,2 мМ β-меркаптоэтанола и 1% пенициллин/стрептомицин (см. Таблицу материалов). Фетальная бычья сыворотка поддерживает пролиферацию клеток, в то время как LIF и β-меркаптоэтанол препятствуют дифференцировке клеток ^7,8.
   6. Когда клетки в колбе Т25 достигают примерно 80% конфлюенции, пассируют и культивируют их в одну или две колбы Т75. Субкультивирование клеток над пятью ходами для обеспечения правильного роста и здоровья.
2. Магнитная сепарация резидентных CD34⁺ стволовых клеток
   1. Когда клетки в одной или двух колбах T75 достигнут 80% конфлюенции, диссоциируйте клетки с помощью трипсина и ресуспендируйте их в 1 мл сортировочного буфера (2 мМ ЭДТА и 0,5% FBS). Определите номер ячейки (колба^{10 7}/T75) и центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут (при комнатной температуре).
   2. Полностью отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать клеточную гранулу в 98 мкл сортировочного буфера на^10-7 клеток. Добавьте 2 мкл антитела к CD34 (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 4°C в темноте, периодически встряхивая.
   3. Промойте ячейки, добавив 2 мл сортировочного буфера, и центрифугируйте при 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
   4. Осторожно и полностью удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в 80 мкл сортировочного буфера.
   5. Добавьте в буфер 20 μL Anti-FITC MicroBeads (на 10⁷ всего ячеек, см. Таблицу материалов). Хорошо перемешать с помощью повторяющегося пипетирования и выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C в темноте с периодическим встряхиванием.
   6. Дважды промойте ячейки, добавив 2 мл буфера, и центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут для репелляции ячеек. Полностью откажитесь от надосадочной жидкости и снова суспендируйте клетки в 1 мл буфера.
   7. Поместите одну колонку MS в магнитное поле соответствующего сепаратора, убедившись, что под колонной MS размещена сборная трубка (например, центрифужная трубка объемом 15 мл) для сбора отделенных компонентов. (см. Таблицу материалов). Промойте колонку буфером объемом 500 мкл и подождите, пока она полностью пройдет.
   8. Загрузите суспензию ячеек в колонку и соберите проточный ток, содержащий немеченые клетки, в пробирку объемом 15 мл.
   9. Снимите колонку с сепаратора и поместите ее на новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Введите 500 мкл буфера в колонку, затем быстро промойте ячейки с магнитной меткой, протолкнув поршень в колонку.
   10. Для повышения чистоты CD34⁺ клеток элюированная фракция может быть обогащена с использованием второй MS-колонки. Повторите процесс разделения, как упоминалось выше. Оцените чистоту отсортированных клеток с помощью проточной цитометрии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, получают 10%-20% CD34⁺ клеток, около 70%-80% отрицательных клеток и примерно 10% потерь из-за окрашивания и процедур центрифуги.
   11. Для дальнейшего подтверждения чистоты CD34⁺ стволовых клеток сосудистой стенки необходимо идентифицировать отсортированные клетки методом проточной цитометрии. Настоящее исследование показало чистоту более 90%.

2. Идентификация клеток методом иммунофлюоресценции

1. Семенные ячейки на покровных стеклах (диаметр 8 мм) предварительно покрыты 0,04% желатином.
2. Когда слияние клеток достигнет примерно 60%-70%, дважды промойте PBS и зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут.
3. Промойте клетки PBS в течение 3 минут (3 раза) и пропитайте клетки 0,2% Triton X-100 (в PBS) в течение 5 минут при комнатной температуре.
4. Промойте клетки PBS в течение 3 мин (3 раза) и блокируйте неспецифическое связывание антител с 5% сывороткой осла (в PBS) на 1 ч.
5. Снимите блокирующий буфер, удерживая каждый покровный лист на его краю щипцами и сливая его на лист безворсовой салфетки.
6. Инкубируйте клетки в 100 раз разбавленных первичных антителах (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, см. Таблицу материалов) в 1% BSA (в PBS) в течение ночи при 4 °C.
7. Сцедите раствор и промойте ячейки PBS в течение 3 мин (3 раза). Инкубируйте клетки с меченым Alexa Fluor 488 вторичным антителом (1:200 в 1% BSA) (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
8. Выполните противодействие DAPI путем разведения стокового раствора DAPI до 0,5 мкг/мл в PBS и инкубации клеток в течение 5 мин.
9. Промойте PBS и запечатайте покровные стекла реагентом, препятствующим выцветанию. Захватывайте изображения под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом.

3. Индуцированная дифференцировка и характеризация CD34⁺ VW-SC

1. Засейте стволовые клетки CD34⁺ с соответствующей плотностью (40%-50% конфлюенции) на покровных листах и 6-луночных планшетах соответственно.
2. Индуцировать эндотелий, ориентированную на клетки дифференцировки из клеток CD34⁺ путем культивирования клеток в среде для культивирования эндотелиальных клеток EBM-2 (см. Таблицу материалов) в течение 1 недели.
3. Индуцировать клеточную дифференцировку фибробластов из CD34⁺ клеток путем культивирования клеток в среде для культивирования фибробластов FM-2 (см. Таблицу материалов) в течение 3 дней.
4. Подвергайте недифференцированные и дифференцированные клетки иммунофлуоресцентному окрашиванию (как упоминалось на шаге 2) при лазерном возбуждении 488 нм и 40-кратном объективе. Определите экспрессию маркеров эндотелиальных клеток (CD31, VWF) и маркеров фибробластных клеток (PDGFRα, Vimentin) (см. Таблицу материалов).
5. Диссоциируйте клетки с помощью трипсина и получите клеточную гранулу центрифугированием (300 х г, 5 мин, комнатная температура). Ресуспендируйте ячейки с помощью 100 μл сортировочного буфера. Предварительно инкубируют клеточную суспензию с очищенным антимышиным CD16/CD32 mAb (1 мкг) (см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение 5 мин.
6. Добавьте 2 мкл PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Anti-Mouse APC (2 мкл, 1:50) и CD140a (PDGFRa) Monoclonal Anti-Mouse FITC (2 мкл, 1:50) непосредственно в предварительно инкубированные клетки в присутствии мышиного Fc Block и далее инкубируйте при 4 °C в течение 15 мин.
7. Промойте клетки дважды, добавив 2 мл буфера, и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут (комнатной температуры) для повторного гранулирования клеток. Полностью выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 300 мкл буфера. Поместите проточные трубки с окрашенными клетками в холодильник, готовый к проточной цитометрии.

4. Обнаружение внутриклеточной передачи сигналов Ca²⁺ в сосудистых CD34⁺ стволовых клетках

1. Семенные клетки на покровных листах за 10 ч до экспериментов при плотности до 70% слияния.
2. Достаньте покровные стекла и прикрепите их ко дну специальной камеры с любым вазелином.
3. Промойте покровные стекла один раз PBS, замените на Фура-2/АМ (5 мкМ) в растворе Тироде (NaCl 137 мМ, KCl 5,4 мМ, MgCl₂ 1,2 мМ, глюкоза 10 мМ, HEPES 10 мМ, CaCl₂ 2,4 мМ) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте.
4. Удалите краситель, обработав его раствором Tyrode в течение 10 минут, чтобы обеспечить деэтерификацию фура-2/AM.
5. Установите камеру на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного широкоугольной системой визуализации, содержащей монохроматор и ПЗС-камеру (см. Таблицу материалов).
6. Откройте главное окно, перейдите в диалоговое окно «Настройки захвата » и страницу камеры и нажмите кнопку «В реальном времени » для отображения изображения в реальном времени .
7. Выберите тип флуоресцентного изображения, установите время повторения петли 340 нм/380 нм, размер изображения и время экспозиции камеры на длинах волн 380 нм и 340 нм для достижения оптимальной яркости изображения.
8. Сделайте отдельные снимки и нарисуйте несколько линий от руки, чтобы обвести ячейки разными цветами и заранее определить область интересов (ROI), обозначив фон как ROI 0.
9. Повторно отредактируйте уже внедренный протокол в представлении рабочей области и создайте новую рабочую область.
10. Выполните протокол, и "Флуоресценция 340 нм div Флуоресценция 380 нм (живая кинетика)" отобразит онлайн-кинетический график.
11. В числовом представлении будет видна электронная таблица, представляющая столбцы значений в оттенках серого и соответствующую информацию о времени. Экспортируйте данные таблицы с помощью буфера обмена.
12. Рассчитайте F340 нм/F380 нм с указанием внутриклеточных изменений^Ca2+ после вычитания фоновой флуоресценции (ROI 0).

Выделение и очистка CD34⁺ VW-SC
Высокая чистота CD34⁺ VW-SC достигается в результате адвентиции аорты и брыжеечной артерии мыши путем прикрепления тканей и магнитной сортировки микрогранул. Процент CD34⁺ клеток в стенке сосуда обычно составляет 10%-30%. Проточная цитометрия подтверждает, что чистота CD34⁺ клеток, полученных методом магнитной сортировки шариков, составляет более 90% (рисунок 1А). Клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание показывает, что CD34⁺ VW-SC преимущественно экспрессируют CD34, c-kit, Flk-1 и Ki-67 с относительно более низкой экспрессией Sca-1 (рис. 1B).

Дифференциация CD34⁺ VW-SC
CD34⁺ VW-SC способны дифференцироваться в эндотелиальные клетки и фибробласты in vitro. Стволовые клетки CD34⁺ могут быть индуцированы к дифференцировке в эндотелиальные клетки с повышенной экспрессией маркеров эндотелиальных клеток CD31 и VWF. Кроме того, дифференцированные клетки фибробластов показали длинную веретенообразную морфологию и повышенную экспрессию маркеров фибробластов PDGFRα и Vimentin (рис. 2A, B). Кроме того, проточная цитометрия также подтвердила способность клеток к дифференцировке; процент эндотелиальных клеток CD34⁺CD31⁺ после дифференцировки увеличился в 1,5 раза по сравнению с недифференцированными клетками (рис. 2В), а процент клеток фибробластов CD34⁺PDGFRa⁺ после дифференцировки увеличился в 1,7 раза по сравнению с недифференцированными клетками (рис. 2D).

Определение характеристик передачи сигналов Ca²⁺ в CD34⁺ VW-SC
Внеклеточное введение АТФ (10 мкМ) повышало внутриклеточный уровень^Ca2+ через сигнальный путь, опосредованный рецепторами, связанными с G-белком (GPCR), а тапсигаргин (TG) ингибировал саркоплазматический ретикулум (SR) Ca²⁺ АТФазу (SERCA) для истощения внутриклеточных запасов SR Ca²⁺ и запускал управляемый ввод кальция (SOCE). Кроме того, кофеин стимулировал повышенный [Ca²⁺]i путем активации опосредованного рианодиновыми рецепторами (RyRs) высвобождения Ca²⁺ (рис. 3).

Рисунок 1: Собранные CD34⁺ VW-SC с помощью культуры тканей и магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). (A) Проточная цитометрическая оценка очищенных CD34⁺ VW-SCs. (B) Репрезентативные изображения, показывающие экспрессию маркеров стволовых клеток CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 и маркера пролиферации клеток (Ki-67). Масштабные линейки: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Обнаружение способности CD34⁺ VW-SC к многонаправленной дифференцировке. (A) Репрезентативные изображения, показывающие экспрессию эндотелиальных маркеров CD31 и VWF, а также маркеров фибробластов PDGFRα и Vimentin в CD34⁺ VW-SC до дифференцировки. (B) Репрезентативные изображения, показывающие экспрессию эндотелиальных маркеров CD31 и VWF, а также маркеров фибробластов PDGFRα и Vimentin в CD34⁺ VW-SC после дифференцировки. Масштабные линейки: 50 μм. Масштабная линейка на врезке составляет 10 мкм. (C) Процентное содержание эндотелиальных клеток CD34⁺CD31⁺ до и после дифференцировки измеряется с помощью проточной цитометрии. (D) Процентное содержание клеток фибробластов CD34⁺PDGFRa⁺ до и после дифференцировки, измеренное с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Внутриклеточный сигнал Ca²⁺ в CD34⁺ VW-SCs. (A) Репрезентативная кривая показывает влияние АТФ (10 мкМ) на внутриклеточную передачу сигналов Ca²⁺ . (B) Репрезентативная кривая показывает индуцированное TG (1 мкМ) внутриклеточное высвобождение^Ca2+ из хранилища SR и последующий внеклеточный приток^Ca2+ , вызванный истощением Ca²⁺ после повторного добавления 2 мМ Ca²⁺. (C) Репрезентативная кривая, показывающая внутриклеточную передачу сигналов^Ca2+ , активированную кофеином (10 мМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Это исследование обеспечивает быстрый и удобный метод получения функциональных CD34⁺ VW-SC из аорты и брыжеечных артерий мышей. CD34⁺ VW-SC, полученные этим методом, обладают пролиферативной активностью и свойствами разнонаправленной дифференцировки. Трифосфатинозитол-1,4,5-трифосфатные рецепторы (IP₃Rs), рианодиновые рецепторы (RyR) и накопительные кальциевые каналы опосредуют высвобождение и поступление Ca²⁺ в CD34⁺ VW-SC. Создание этой методики заложит основу для дальнейших исследований механизмов, задействованных в CD34⁺ VW-SC, участвующих в структурном и функциональном ремоделировании при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Наиболее распространенными методами первичной изоляции клеток являются прикрепление тканевых блоков и ферментативная диссоциация^15,16. В настоящем отчете прикрепление тканевых блоков и сортировка магнитных шариков сочетаются для получения высокой чистоты CD34⁺ VW-SC. Отсортированные стволовые клетки CD34⁺ стенки сосудов положительны на CD34, и лишь немногие из них экспрессируют маркер эндотелиальных клеток CD31, что согласуется с предыдущим отчетом². Кроме того, Jiang et ^al.2, используя секвенирование одиночных клеток недавно выделенных клеток бедренной артерии у мышей, обнаружили, что CD34 в основном экспрессируется в популяциях эндотелиальных и мезенхимальных клеток, а не в популяции гладкомышечных клеток. Эксперименты in vivo также подтверждают, что CD34⁺ VW-SC могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки для участия в восстановлении сосудов после травмы. Поскольку VW-SC неоднородны, CD34⁺ VW-SC, отсортированные этим методом, наряду с другими положительными маркерами стволовых клеток, такими как Flk-1, c-kit и Sca-1, имеют различные субпопуляции, поэтому их морфология может отличаться.

Наиболее широко используемыми методами сортировки стволовых клеток являются проточная цитометрия и иммуномагнитная сортировка шариков 17,18,19. Метод FACS характеризуется высокой чистотой клеток и скоростью восстановления, но FACS является относительно трудоемким и дорогостоящим. Иммуномагнитное разделение шариков — это высокоспецифичная технология сортировки клеток, объединяющая теории иммунологии, клеточной биологии и магнитной механики. Этот метод прост и быстр и может быть выполнен в течение 2 часов. Различные методы сортировки клеток влияют на чистоту клеток и выход²⁰. Как и в предыдущих отчетах²¹, сортировочные магнитные шарики, используемые в этом эксперименте, имеют диаметр всего 50 нм, что оказывает относительно меньшее механическое давление на клетки и не вызывает повреждения клеток и не влияет на биологическую активность отсортированных клеток. Кроме того, в отличие от метода разделения, описанного в литературе⁸, мы обычно сортируем клетки после пассажа в течение 5 поколений, когда количество клеток в колбе Т75 может достигать по меньшей мере 1 × 10⁷, а пролиферация клеток активна. Кроме того, после культивирования отсортированных клеток в течение 3-5 пассажей крайне важно повторить протокол очистки и убедиться в том, существует ли автодифференцировка во время культивирования и пассажа.

Во время субкультивирования VW-SCs используется среда DMEM с высоким содержанием глюкозы и 0,2% ЛИФ, в которой FBS способствует пролиферации VW-СК, а ЛИФ ингибирует дифференцировку клеток и поддерживает экспансию стволовых клеток. В соответствии с существующим исследованием¹¹, культура с низкой плотностью способствует поддержанию стволовости VW-SC, а возможность самодифференцировки увеличивается с пассажами. Кроме того, отбор сыворотки во время культивирования также имеет решающее значение, поскольку некоторые виды сыворотки потенциально индуцируют самодифференцировку клеток и влияют на биологические^{характеристики.}

Ca²⁺ является основным вторичным посредником, который контролирует различные клеточные функции, включая сокращение клеток, миграцию, экспрессию генов, рост клеток и апоптоз⁹. В предыдущих отчетах⁸ были лишь кратко описаны основные характеристики CD34⁺ VW-SC, в то время как в этом исследовании мы дополнительно обнаружили высвобождение^Ca2+ из внутренних запасов кальция и внеклеточный приток^Ca2+, вызванный АТФ, кофеином и TG соответственно. АТФ является нуклеотидом, который не только считается основной энергетической валютой в клетках, но и действует как передатчик/сигнальная молекула. АТФ активирует опосредованное IP₃Rs высвобождение^Ca2+ из SR и регулирует активность нескольких последующих мишеней. Таким образом, клеточный ответ на АТФ может отражать функциональное состояние клетки²². Кофеин уже давно используется в качестве фармакологического зонда для изучения RyR-опосредованного внутриклеточного высвобождения^Ca2+. В этом исследовании как АТФ, так и кофеин быстро увеличивали внутриклеточный^Ca2+, а повышенный внутриклеточный^Ca2+ медленно снижался до исходного уровня в течение 1 минуты. Кроме того, SOCE присутствует в большинстве невозбудимых и частично возбудимых клеток. В настоящем исследовании ТГ подавляет фермент Ca²⁺-АТФ в CD34⁺ VW-SC, вызывая истощение Ca²⁺ в SR и опосредуя внешний приток Ca^{2+ 23}. Влияние АТФ, кофеина и ТГ на внутриклеточный^Ca2+ в CD34⁺ VW-SCs согласуется с другими клетками, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях^24,25, что позволяет предположить, что выделенные в этом исследовании стволовые клетки CD34⁺ обладают нормальным внутриклеточным высвобождением^Ca2+ и внешними сигнальными свойствами притока^Ca2+.

В этом исследовании эффективно культивируются функциональные CD34⁺ VW-SC из аорты и брыжеечных артерий мыши. Изучение VW-SC может дать значительное представление о механизмах сосудистого ремоделирования. Разработка протоколов с большим количеством маркеров и функциональных исследований CD34⁺ VW-SC позволит еще больше определить роль этих клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Очистка клеток служит мощным инструментом для проникновения в клеточные и генетические основы развития и роста органов. Преимущество очистки MACS заключается в том, что она является удобным методом обогащения клеток. В сочетании с другими методами, такими как анализ секвенирования РНК, он обладает потенциалом для раскрытия новых механизмов, лежащих в основе пролиферации, миграции и дифференцировки стволовых клеток как в физиологическом, так и в патологическом контекстах¹². Такой подход способствует систематическому скринингу биологических факторов, компонентов внеклеточного матрикса и малых молекул, которые либо стимулируют, либо подавляют фундаментальные функции стволовых клеток. Проведение таких исследований открывает уникальные возможности для проведения экспериментов по потере и приобретению функции, что в конечном итоге способствует более глубокому пониманию генетических основ сердечно-сосудистых заболеваний. В рамках этого метода также есть некоторые ограничения. Например, из-за фенотипической и функциональной гетерогенности CD34⁺ клеток в сосудистой стенке, потребуется больше маркеров для идентификации специфического субклеточного типа резидентных сосудистых CD34⁺ клеток.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Эта работа финансировалась за счет грантов Национального фонда естественных наук Китая (No 82070502, 31972909, 32171099), Сычуаньской научно-технической программы провинции Сычуань (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Авторы хотели бы поблагодарить Цинбо Сюя из Чжэцзянского университета за помощь в создании клеточной культуры, а также выражают признательность за научную и техническую помощь платформы проточной цитометрии в Юго-Западном медицинском университете.