Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen küçük EV'lerin (sEV'ler) (preeklampsinin bir yönünü modelleme) hamile olmayan yetişkin dişi farelerde kan-beyin bariyerini bozup bozmadığını değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.
Serebral ödem, iskemik ve hemorajik inme gibi serebrovasküler komplikasyonlar, preeklampsi ile ilişkili maternal mortalitenin önde gelen nedenini oluşturur. Bu serebrovasküler komplikasyonların altında yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, plasental disfonksiyon ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması ile bağlantılıdırlar. Bununla birlikte, bu iki uzak organ arasındaki bağlantı hala belirlenmektedir. Artan kanıtlar, plasentanın hücre dışı veziküller de dahil olmak üzere sinyal moleküllerini maternal dolaşıma saldığını göstermektedir. Hücre dışı veziküller, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda kritik sinyal parçacıkları olarak kabul edilen küçük hücre dışı veziküller (çapı 200 nm'den küçük sEV'ler) ile boyutlarına göre kategorize edilir. Preeklampside, maternal dolaşımda, sinyal fonksiyonu iyi anlaşılmamış olan dolaşımdaki sEV'lerin sayısında artış vardır. Preeklampside veya hipoksiye maruz kalan normal gebelik plasentalarından salınan plasental sEV'ler beyin endotel disfonksiyonuna ve BBB'nin bozulmasına neden olur. Bu protokolde, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin (preeklampsinin bir yönünü modelleme) BBB'yi in vivo bozup bozmadığını değerlendiriyoruz.
Preeklampsiye bağlı maternal ölümlerin yaklaşık% 70'i, bozulmuş plasentasyon süreçleri, maternal sistemik endotel disfonksiyonu ve ciddi vakalarda çoklu organ yetmezliği 1,2 ile karakterize hipertansif bir gebelik sendromu, akut serebrovasküler komplikasyonlarla ilişkilidir 3,4. Anne ölümlerinin çoğu düşük ve orta gelirli ülkelerde meydana gelmektedir5. Bununla birlikte, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonların klinik ve epidemiyolojik önemine rağmen altta yatan mekanizmalar hala belirsizdir.
Öte yandan, hücre dışı veziküller (EV'ler) (çap ~ 30-400 nm), maternal-plasental etkileşim de dahil olmak üzere dokular ve organlar arasındaki hücreler arası iletişimin temel aracılarıdır6. Dış yüzeydeki proteinlere ve lipitlere ek olarak, EV'ler içinde kargo taşır (proteinler, RNA ve lipitler). EV'ler (1) eksozomlar (çap ~50-150 nm, küçük EV'ler (sEV'ler) olarak da adlandırılır), (2) orta/büyük EV'ler ve (3) boyut, biyogenez, içerik ve potansiyel sinyal fonksiyonuna göre farklılık gösteren apoptotik cisimler olarak kategorize edilebilir. EV'lerin bileşimi, kaynaklandıkları hücreler ve hastalık tipi7 tarafından belirlenir. Sinsityotrofoblasttan türetilen EV'ler, gebelikte plasenta kaynaklı dolaşımdaki küçük EV'leri (PDsEV'ler) tespit eden plasental alkalen fosfataz (PLAP)8,9 eksprese eder. Ayrıca, PLAP, PDsEVs kargosundaki değişiklikleri ve bunların preeklampsi ile normotansif gebeliklerdeki etkilerini ayırt etmeye yardımcı olur 10,11,12,13,14,15.
Plasenta, preeklampsi16 patofizyolojisinde veya bu hastalıkla ilişkili serebral komplikasyonlarda gerekli bileşen olarak kabul edilmiştir 17,18,19. Bununla birlikte, bu uzak organın beyin dolaşımında değişikliklere nasıl neden olabileceği bilinmemektedir. sEV'ler, biyoaktif bileşenleri donörden alıcı hücrelere aktarma kapasiteleri nedeniyle hücreden hücreye iletişimde çok önemli roller oynadığından 6,20,21, giderek artan sayıda çalışma, plasental sEV'leri beyin endotel hücreleri21,22,23,24 dahil olmak üzere maternal endotel disfonksiyonunun oluşumu ile ilişkilendirmiştir25,26preeklampsili kadınlarda. Bu nedenle, beyin endotel fonksiyonunun tehlikeye girmesi, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonlarda kritik bir bileşen olan kan-beyin bariyerinin (BBB) bozulmasına yol açabilir 3,27.
Bununla birlikte, preeklampsi28 olan kadınların serumuna maruz kalan sıçan serebral damarları veya preeklampsi29 olan kadınların plazmasına maruz kalan insan beyni endotel hücreleri kullanılarak yapılan klinik öncesi bulgular, dolaşımdaki faktör(ler)in BBB'nin bozulmasına neden olduğunu bildirmiştir. Yüksek seviyelerde proinflamatuar sitokinler (yani tümör nekroz faktörü)18,28 veya vasküler düzenleyiciler (yani vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF))29,30,31 veya oksidize lipoproteinler (okso-LDL)32,33 gibi oksidatif moleküller gibi preeklampsi sırasında maternal dolaşımda bulunan BBB'ye zarar verme potansiyeline sahip birkaç adaya rağmen, diğerleri arasında34, hiçbiri plasenta ve BBB arasında doğrudan bir bağlantı kurmaz. Son zamanlarda, hipoksik plasentalardan izole edilen sEV'ler, gebe olmayan dişi farelerde BBB'yi bozma kapasitesini göstermiştir25. Plasental sEV'ler, BBB'yi bozma kapasitesi ile listelenen dolaşım faktörlerinin çoğunu taşıyabileceğinden, sEV'ler yaralı plasentayı bağlamak, zararlı dolaşım faktörlerinin taşıyıcısı olmak ve preeklampside BBB'yi bozmak için uygun adaylar olarak kabul edilir.
Bu protokol, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin, preeklampsi sırasında serebral komplikasyonların patofizyolojisini anlamak için bir vekil olarak gebe olmayan dişi farelerde BBB'yi bozup bozamayacağını araştırmamızı sağlar.
Araştırma, Helsinki Bildirgesi'nde ifade edilen ilkelere uygun olarak ve ilgili Etik İnceleme Kurullarının yetkisi altında gerçekleştirilmiştir. Tüm insan katılımcılar, daha önce bildirildiği gibi, numune alınmadan önce bilgilendirilmiş onamlarını verdiler25. Ek olarak, Bío-Bío Üniversitesi Biyoetik ve Biyogüvenlik Komitesi bu projeyi onayladı (Fondecyt hibe 1200250). Hayvan çalışması, deneylerde hayvanların kullanımında üç R'nin temel ilkelerine uygun olarakve ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kılavuzlarının tavsiyelerine göre yürütülmüştür. Hayvanlar, Bío-Bío Üniversitesi'nin Vivarium'unda uygun ortamlarda tutuldu. Taze plasentalar (n=4), elektif sezaryen sonrası 1 saat içinde, term gebelikleri normal olan annelerden (28-31 yaş) (38-41 gebelik haftası) elde edildi. Sezaryen, daha önce bildirildiği gibi Şili'nin Chillan kentindeki Herminda Martin Klinik Hastanesi'nde gerçekleştirildi25. İn vivo modeli uygulamak için 4-6 aylık dişi gebe olmayan fareler (suş C57BLACK/6) kullanıldı. Üç deney grubuna ayrıldılar: (1) kontrol (tedavi olmadan), (2) normoksiden sEV'lerle tedavi edildi (sEVs-Nor) ve (3) hipoksik kültürlenmiş plasentalardan (sEVs-Hyp) sEV'lerle tedavi edildi, BBB'nin bozulmasını değerlendirmek için kullanıldı in vivo25. Enjekte edilen tüm çözeltiler sterildi. Ayrıca, sEV'lerin hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için aseptik koşullarda ve sınıf II biyogüvenlik başlığı altında gerçekleştirildi.
1. Plasental kültür eksplantları
2. Plasental kaynaklı sEV izolasyonu
3. Fare enjeksiyonu
4. Hızlı murin koma ve davranış ölçeği (RMCBS)
5. Evan'ın mavi ekstravazasyonunun analizi
Bu protokol, hipokside kültürlenen plasentalardan türetilen sEV'lerin gebe olmayan farelerde BBB'yi bozma kapasitesini değerlendirir. Bu yöntem, normal ve patolojik koşullarda plasenta ve beyin arasındaki potansiyel bağlantının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Özellikle, bu yöntem preeklampside serebral komplikasyonların başlangıcında plasental sEV'lerin katılımını analiz etmek için bir vekil oluşturabilir.
sEVs-Nor enjekte edilen farelerin aksine, sEVs-Hyp enjekte edilen fareler, 24 saate kadar nörolojik skorda ilerleyici bir düşüş gösterir (Tablo 1), bu da sEVs-Hyp'nin beyin fonksiyonunu bozma kapasitesini gösterir.
Ayrıca, sEVs-Hyp enjekte edilen grubun fare beyinleri, sEVs-Nor enjekte edilen farelerden veya kontrol farelerinden izole edilenlerden daha yüksek taze ağırlığa sahiptir (sırasıyla 0.51 ± 0.008; 0.46 ± 0.008; 0.47 ± 0.01 g), bu da beyin ödeminin brüt bir göstergesini oluşturabilir45.
Bu bulgu ile uyumlu olarak, bu protokol, Evan'ın mavi ekstravazasyonunu BBB'nin bozulmasının bir göstergesi olarak tanımlamaya izin verir. Bu bağlamda, sEVs-Hyp enjekte edilen farelerden alınan beyinler, sEVs-Nor grubundaki beyinlerden daha yüksek Evan'ın mavi ekstravazasyonuna sahiptir (Şekil 5A).
Her ne kadar sEVs-Hyp tarafından indüklenen BBB'nin altında yatan bozulma mekanizması bu protokolle analiz edilmemiş olsa da, sonuçlar ayrıca sEVs-Hyp enjekte edilen farelerin, BBB'nin en çok etkilendiği alanlarda (yani, arka alanlar) CLND-5'in protein miktarlarında azalma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 5B). Bu nedenle, sEVs-hyp'nin bu kritik endotelyal sıkı bağlantı proteininin fonksiyonunun ekspresyonunu bozması mümkündür.
Şekil 1: Plasental eksplant kültürü ve hücre dışı vezikül izolasyon protokolü. (A) Normal plasenta eksplant kültürleri. (B) Eksplantlar, plasentalı küçük hücre dışı veziküllerin (sEV'ler) biyogenezi için iki koşula dağıtılır. 18 saat boyunca Normoksi (sEVs-Nor,% 8 O2) veya hipoksi (sEVs-Hyp,% 1 O2) (C) Hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için şartlandırılmış ortam hasat edilir, filtrelenir ve santrifüjlenir. (D) sEV'ler ultra santrifüjlerle izole edilir. (E) sEV'ler, nano-izleme analizi ve western blot kullanılarak karakterize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan-beyin bariyeri bozulma protokolünün in vivo değerlendirmesi. 4-6 aylık gebe olmayan C57BL6/J fareler kullanılır. (A) Dış juguler ven yoluyla, hayvanlara Normoksik (sEVs-Nor,% 8 O2) veya hipoksik (sEVs-Hyp,% 1 O2) plasental kültürlerden izole edilen sEV'ler (200 μg toplam protein) verildi. RMCBS, enjeksiyondan 0-24 saat sonra izlenir. (B) sEV enjeksiyonundan 6 saat sonra, beyinler ekstrakte edilir ve protein ekstraksiyonu için dokuz bölüme ayrılır. Claudin 5 (CLDN5) bu dokuz bölümün homojenatlarında analiz edilir. (C) Evan'ın mavi ekstravazasyon analizi (sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra), dokuz segmentin her birinde retro-orbital ponksiyon enjeksiyonundan sonra analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Evan'ın mavi boyası ve intrakardiyal perfüzyon protokolünün fotoğraf belgeselleri. (A) Fare, Evan'ın mavisini retro-orbital enjeksiyon yoluyla aldı. (Solda) Evan mavisi enjeksiyonundan önce ve (Sağda) hayvan (15 s) enjeksiyondan sonra. (B) Fosfat tampon çözeltisi (1x PBS) ve paraformaldehitin (% 4 PFA) intrakardiyal perfüzyonunu gerçekleştirmek için torakotomi. Sol ventrikül iğnenin ucu ile işaretlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: sEV'lerin enjeksiyonundan sonra Evan'ın mavi ekstravazasyonunun analizi. (A) Evan'ın mavi ekstravazasyonunu gösteren tüm beynin temsili görüntüsü. Kesikli çizgi, tüm beyinden elde edilen dokuz bölümü temsil eder. (B) Beyin faresi dilimleyici kullanılarak incelenen beyin. (C) sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra beyin dilimlerinin temsili görüntüleri. Kontrol (CTL), normoksik (sEVs-Nor) veya hipoksik koşullarda (sEVs-Hyp) plasenta. Ölçek çubuğu = 0,4 cm. (D) ImageJ kullanılarak beyin diliminin dijital taslağı. (E) Mavi kanaldaki histogram. 75-110 arasındaki değerler Evan'ın mavi ekstravazasyonu ile ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Plasental eksplantlardan izole edilen sEV'ler enjekte edilen farelerde Evan'ın mavi ekstravazasyonu ve claudin-5 seviyeleri. (A) Tüm beyin bölümleri dikkate alınarak Evan'ın mavi (EB) ekstravazasyon yüzdesi. Kontrol (CTL, mavi), normoksik (sEVs-Nor, kırmızı) veya hipoksik koşullarda (sEVs-Hyp, yeşil) plasenta. (B) Dokuz beyin bölümündeki nispi claudin 5 (CLDN5) seviyeleri üç deney grubundan elde edildi. β-aktin yükleme kontrolü olarak kullanılır. Değerler ortalama ± çeyrekler arası aralıktır. Her nokta ayrı bir deney konusunu temsil eder. *p < 0.05, **p < 0.005. p < 0.0001. p < 0.001; ANOVA testi ve ardından Bonferroni son testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Zaman (h) | Kontrol | sEVs-Normoksia | sEV'ler-Hipoksi | ANOVA |
0 | 18,75 ± 0,250 | 18.5 ± 0.288 | 18,75 ± 0,250 | Ns |
3 | 18.5 ± 0.866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
6 | 19,25 ± 0,750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
12 | 18.5 ± 0.645 | 16.75 ± 1.109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
24 | 19.5 ± 0.288 | 17,75 ± 0,250 | 10.25 ± 0.853*α | <0.0001 |
*P < 0.01'e karşı kontrol. αp < 0.01'e karşı sEVs-Normoxia |
Tablo 1: sEV enjeksiyonundan 24 saat sonra hızlı murin koma ve davranış ölçeği (RMCBS). ±Hayvanların 20'ye en yakın puanları standart iken, puan ne kadar düşükse, CNS'nin işlev bozukluğu o kadar yüksek olur.
Bu çalışma, hipoksik koşullarda kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV'lerin kemirgen kan-beyin bariyerinin bozulması üzerine ortaya çıkan potansiyel zararlara ilişkin yeni bilgiler ortaya koymaktadır. Patolojik mekanizma, arka beyin bölgesinde CLND-5'te bir azalmayı içerir25.
Önceki araştırmalar, preeklampsili bireylerden alınan plazma-sEV'lerin in vitro modeller kullanılarak çeşitli organlarda endotel disfonksiyonuna neden olduğunu ortaya koymuştur46,47. Bu araştırma özellikle kan-beyin bariyerini inceledi ve hipoksi ile kültürlenmiş plasentadan izole edilen ve bu hayati bariyeri bozan sEV'lere yeni bir bakış açısı sundu. Bu keşifler, sEV'lerin preeklampsi gibi hem normal hem de patolojik senaryolarda plasenta ve beyin arasında bir iletişim kanalı olarak hizmet edebileceği yeni bir araştırma alanı sunmaktadır.
Sunulan protokol basittir, ancak birkaç kritik adımdan bahsetmek gerekir. Bu protokol, doğumdan sonraki 1 saat içinde taze plasentalar gerektirir. Ayrıca doku bozulmasını önlemek için kültür periyodunun 24 saatten fazla uzatılmamasını tavsiye ediyoruz. Bu protokol, fare plasentaları tarafından üretilen sEV'lerden kaynaklanan potansiyel kontaminasyonu azaltır. Evan'ın mavi ekstravazasyonunun dijital analizi zaman alıcıdır. Ayrıca, Evan'ın mavi lekesi beyin kesitinden sonra daha az belirgindir. Bu nedenle, pozitif bir kontrol kullanarak mavi aralığı tanımlamak için bir ilk kurulum önerilir. Evan'ın mavi enjeksiyonuna maruz kalmayan bir farenin beyni gibi negatif bir kontrol de kullanılabilir. Potansiyel gözlemci yanlılığını önlemek için deney gruplarının kör analizi zorunludur.
Bu protokol sırasında çeşitli zorluklar ortaya çıkabilir. Önemli bir sınırlama, hem insan plasentalarından hem de enjekte edilen farelerden kaynaklanan biyolojik değişkenlikte yatmaktadır. Evan'ın mavi ekstravazasyon deneylerinin tekrarlanabilirliğini sağlamak için, insan plasentalarından izole edilen sEV dozlarının oluşturulması önerilmektedir. 200 μg'lık bir toplam protein dozu seçtik; bununla birlikte, bu miktar vezikül saflığına, juguler enjeksiyonun etkinliğine, Evan'ın mavi uygulamasına, dolaşım sisteminden temizlenmesine ve en azından içerikleri göz önüne alındığında sEV'lerin biyolojik etkisine bağlı olarak dalgalanabilir.
İnsan plasentasından gelen sEV'lerin kan-beyin bariyerini bozabileceği hücresel mekanizmalar, ek deneyler gerektirir. Bununla birlikte, bu yöntem, plasenta ve beyin arasındaki potansiyel iletişime işaret ederek daha fazla araştırmayı garanti eden alaka düzeyine sahiptir. Bu nedenle, sEV'lere ve bunların kan-beyin bariyeri ile etkileşimlerine ve kargolarının nöronal dokular üzerindeki etkisine odaklanan gelecekteki araştırmalar teşvik edilmektedir. Kan-beyin bariyeri bozukluğunun anne beyni için kalıcı sonuçlara yol açıp açmadığı daha fazla incelemeyi gerektirir.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Yazarlar, değerli katkıları için GRIVAS Health'e ait araştırmacılara teşekkür eder. Ayrıca, Kadın Hastalıkları ve Doğum Servisi'nden ebeler ve klinik personel, Şili'deki Hospital de Chillan'a aittir. Fondecyt Regular 1200250 tarafından kuruldu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır