İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) her tür hücreye farklılaşabilir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerinin mükemmel bir alternatif kaynağı haline getirir. hPSC'ler, blastosistten türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) veya bir yeniden programlama işlemi kullanılarak doğrudan somatik hücrelerden üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler) olabilir. Burada, farklılaşmadan ve daha sonra insülin üreten pankreas hücrelerinin oluşturulmasından önce hPSC'ler için optimal kültür ve geçiş koşullarını ana hatlarıyla belirtmek için video tabanlı bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hPSC'lerin kesin endoderm (DE), ilkel bağırsak tüpü, posterior ön bağırsak kaderi, pankreas progenitörleri, pankreas endokrin progenitörleri ve nihayetinde pankreas β hücrelerine farklılaştığı β hücreye yönelik farklılaşma için altı aşamalı süreci takip eder. Bu farklılaşma metodolojisinin insan pankreas β hücrelerini oluşturmak için 27 günlük bir süre alması dikkat çekicidir. İnsülin sekresyonunun potansiyeli, immün boyama ve glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu içeren iki deneyle değerlendirildi.

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), çeşitli hücre tiplerine farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerine uygun bir alternatif haline getirir¹. Bu hPSC'ler iki tipe ayrılır: blastosist^2'den türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) ve somatik hücrelerin doğrudan yeniden programlanmasıyla üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler)³. hPSC'leri β hücrelere ayırma tekniklerinin geliştirilmesi, hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir ^1,4. Diabetes mellitus, dünya çapında >400 milyon insanı etkileyen kronik bir hastalıktır ve vücudun pankreas β hücrelerinin bozulması veya kaybı nedeniyle glisemiyi düzenleyememesinden kaynaklanır⁵. Transplantasyon için pankreas adacık hücrelerinin sınırlı mevcudiyeti, diyabet^için hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini engellemiştir 2,4,6,7. hPSC'leri kullanarak glikoza duyarlı insülin salgılayan hücreler üretme yeteneği, insan adacık gelişimini ve işlevini incelemek için yararlı bir hücresel model görevi görür. Kontrollü bir ortamda diyabet tedavisi için potansiyel terapötik adayları test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, hPSC'ler, hastayla genetik olarak özdeş olan pankreas adacık hücreleri üretme potansiyeline sahiptir ve transplantasyondan sonra immün reddi riskini azaltır ^2,4,7.

Son yıllarda, hPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin iyileştirilmesinde önemli ilerlemeler olmuştur, bu da pankreas β hücreleri üretmeye yönelik farklılaşma sürecinin verimliliğinin ve tekrarlanabilirliğinin artmasına neden olmuştur ^8,9.

Aşağıdaki protokol, pankreas β hücrelerinin yönlendirilmiş farklılaşmasının temel aşamalarını özetlemektedir. Farklı zaman noktalarında spesifik hücre sinyal yollarının düzenlenmesini içerir. Sui L. ve ^ark.10 (2018) tarafından hPSC'lerin pankreas β hücrelerine dönüştürülmesi için geliştirilen protokole dayanmaktadır. En son araştırmalar, β hücrelerinin farklılaşmasını artırmak için aphidicolin (APH) tedavisinin kullanılmasının önemini vurguladığından, protokol Sui L. ve ^ark.11'in (2021) son güncellemelerine göre ayarlandı. Mevcut protokol, sürecin sonraki aşamalarında ortama APH eklenmesini içerir. Ayrıca, ilk protokole kıyasla farklılaşmanın erken aşamalarında ortamın bileşiminde değişiklikler yapılmıştır. Dikkate değer bir değişiklik, 6. günde Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF) eklenmesi ve 8. güne kadar devam etmesidir. Keratinosit büyüme faktörü (KGF), 6. günden 8. güne kadar verilir ve bu, KGF'nin evre 4 ortamına dahil edilmediği ilk protokol^10'dan biraz farklıdır.

β hücreli hücrelerin oluşumundaki ilk ve temel adım, hPSC'lerin, pankreas da dahil olmak üzere çeşitli organların epitel astarına yol açan ilkel bir germ tabakası olan kesin endoderm'e (DE) yönlendirilmiş farklılaşmasıdır. DE oluşumundan sonra, hücreler ilkel bağırsak tüpüne farklılaşır ve bunu posterior ön bağırsak kaderinin belirlenmesi izler. Posterior ön bağırsak daha sonra endokrin ve ekzokrin hücreler de dahil olmak üzere pankreasın tüm hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahip pankreas progenitör hücrelerine dönüşür. Süreçteki bir sonraki aşama, Langerhans adacıklarında bulunan hormon salgılayan hücrelere yol açan pankreas endokrin progenitörlerini içerir. Sonunda, farklılaşma süreci, tamamen işlevsel pankreas β hücresi benzeri hücreler^üreterek son aşamasına ulaşır ^9,10. Bu işlemin karmaşık olduğunu ve farklılaşmanın etkinliğini ve özgüllüğünü artırmak için spesifik büyüme faktörleri ve hücre dışı matris bileşenleri gibi kültür koşullarının optimizasyonunu gerektirdiğini^{belirtmek önemlidir 9,10}. Ayrıca, in vitro olarak hPSC'lerden fonksiyonel β hücre benzeri hücreler üretmek hala büyük bir zorluktur. Devam eden araştırmalar, farklılaşma protokollerini geliştirmeye ve ortaya çıkan β hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini geliştirmeye odaklanmaktadır⁹.

Bu protokolde, hPSC'lerin kültürü ve geçişi sırasında nazik hücre ayrışmasının kullanılması, hücre canlılığını ve pluripotentliği korumak için esastır ve pankreas β hücrelerine farklılaşma etkinliğini önemli ölçüde artırır. Ek olarak, her aşamaya özgü ortam, insan adacığına çok benzeyen kümelerde yüksek miktarda insülin salgılayan hücre verimini teşvik etmek için Sui L. ve ^ark.10 tarafından geliştirilen protokol izlenerek titizlikle optimize edilmiştir.

Farklılaşmaya başlamadan önce, deneysel amaçlar için gerekli sayıda adacık benzeri organoidin belirlenmesi önerilir. 6 oyuklu bir plakada, %80'in üzerinde birleşmeye sahip tek bir kuyu tipik olarak 2-2,3 milyon hPSC'den oluşur. hPSC hatlarındaki farklılıklar ve farklılaşma verimliliği nedeniyle doğru bir tahmin zor olsa da, kaba bir tahmin, ilk kuyu sayısının 1,5 katıdır. Etkili bir şekilde yönlendirilmiş bir farklılaşma, genellikle altı oyuklu plakalarda oyuk başına 1.6 ila 2 milyon hücre verir ve yalnızca insülin üreten hücrelerden ziyade kümeler içindeki tüm hücreleri kapsar. 50 μm'lik bir küme için, yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde tahmin edilebilir. Tablo 1 , glikoz ile uyarılan insülin sekresyon tamponu ile birlikte, kök hücre matrisi ve ortamının üzerinde yönlendirilmiş farklılaşmanın her günü/aşaması için kullanılan ortam bileşiminin bir özetini sağlar.

1. İnsan pluripotent kök hücrelerinin 6 oyuklu plakalarda farklılaşmadan önce geçirilmesi

NOT: İnsan kök hücrelerinin β hücre benzeri hücrelere farklılaşmadan önce uygun şekilde geçirilmesi, deneysel sürecin oluşturulmasında çok önemli bir adımdır. Yanlış geçiş seyreltmesi veya bağlantı hücre numarası, farklılaşma verimliliğini ve aslına uygunluğu tehlikeye atabilir.

1. Kök hücre kültürü ortamı, kaplama ve ayrışma solüsyonları hazırlayın ( Tablo 1'de belirtildiği gibi).
2. Geçişten 1-2 saat önce, altı oyuklu bir plakayı soğuk kaplama çözeltisi (oyuk başına 1 mL) ile kaplayın ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
3. Kök hücre kültürü ortamının bir kısmını oda sıcaklığında (15-25 °C) 20 dakika ısıtın.
4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 1 mL kalsiyum/magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
5. Adım 1.4'ü tekrarlayın. Iki kez.
   NOT: D-PBS, hücreleri yıkamak ve önceki ortamı ve bileşikleri çıkarmak için eklenir. D-PBS'ye maruz kalmak hPSC'lere zarar vermediğinden, ozmozun neden olduğu hücre yırtılmasını veya büzülmesini önlediğinden, yıkama adımları için belirli bir zaman çerçevesine gerek olmadığına dikkat etmek önemlidir.
6. D-PBS'yi aspire edin, her kuyucuk için 500 μL ayrışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında (15 - 25 °C) 2-5 dakika bekletin.
7. Hücreler ayrışırken, yeni 6 oyuklu plakanın kaplama solüsyonunu aspire edin ve her oyuğa 1-2 mL kalsiyum / magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
8. Ters mikroskop altında ayrışma sürecini düzenli olarak kontrol edin.
9. Hücrelerin% 80 - 90'ı yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma çözeltisini aspire edin.
10. 10 μM ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin.
11. Ayrışmış hücreleri 1.000 μL steril filtreli pipet uçları ve bir P1000 pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
12. Kolonileri kırmak için 1.000 μL steril pipet filtreli uçla hücre süspansiyonunu pipette yavaşça yukarı ve aşağı ezin, ancak 10 katı geçmeyin.
13. Kalan hPSC'lerin ayrılmasına yardımcı olmak için ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mL konik tüpe aktarın (1.10).
14. D-PBS'yi yeni kaplanmış plakadan aspire edin ve hemen 15 mL'lik konik tüpten hücre süspansiyonunu ekleyin. Optimum hücre büyümesini sağlamak için, 6 oyuklu bir plaka (10'da 1 ila 50'de 1) kullanırken oyuk başına 2 x 10^5-1 x 10⁶ canlı hücre aralığını tohumlayın.
    NOT: Hacim hesaplaması için, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu, ROCK inhibitörlü 2 mL kök hücre ortamı içermelidir.
15. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 5 - 10 kez yan yana hareket ettirin.
16. Plakayı 37 °C'de, %5_CO2 inkübatörde 24 saat yerleştirin.
17. Ertesi gün ROCK inhibitörü içermeyen taze kök hücre besiyeri ile değiştirin ve daha sonra hPSC'lerin birleşmesi% 80 - 95'e ulaşana kadar her 2 günde bir.

2. İnsan kök hücresi kaynaklı β hücrelerine yönelik farklılaşma

NOT: hPSC'ler,% 80-95 birleşme sağlandığında pankreas β hücrelerine doğrudan farklılaşma işlemi için kullanılabilir.

1. Gün -1: Hücrelerin geçişi Farklılaşmanın -1. günü:
   1. Geçişten 1-2 saat önce, 6 oyuklu bir plakayı 37 °C,% 5_CO2 inkübatörde 1 saat boyunca soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın.
   2. 1.1'den 1.10'a kadar olan adımları izleyin ve hücreleri saymaya devam edin.
   3. 10 μL hücre karışımı yükleyin, eşit hacimde Tripan Mavisi ekleyin ve hafifçe karıştırın.
   4. Hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Kaplanmış 6 oyuklu plakayı oyuk başına 2 mL ortam ile kaplamak için 10 μM ROCK inhibitörü içeren 0.8 × 10 6 hücre / mL - 1.0 x 10⁶ hücre / mL kök hücre ortamı kullanın.
   5. Plakayı üç kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   6. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 10 kez tekrar yan yana hareket ettirin. Ardından plakayı 4 saat inkübe edin.
      NOT: İnkübatöre yerleştirildikten sonra plakayı hareket ettirerek hücrelerin maksimum bağlantısının ve eşit dağılımının hücreleri rahatsız etmediğinden emin olun. İnkübatörü çok dikkatli bir şekilde açın ve kapatın.
   7. Bazal ortam şişesini 0 ila 4. günler için 4 ° C'de gece boyunca eritmek için yerleştirin.
2. Gün 0
   NOT: hPSC'ler %80 - 95 birleşim şeklinde olmalıdır, bu birleşim altında kesin endoderm için farklılaşma sürecini başlatmayın.
   1. Buz üzerinde, hem 0 ila 4. günler için bazal ortamı hem de takviyeleri çözün (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. İki konik tüpte sadece 1. günde kullanılacak gerekli hacmi hazırlayın (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve ayrı bir tüpte, 2.5 ila 4. gün için hacmi iki katına çıkarın (2 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 x 6 mL). Gün 2.5 ila Gün 4 ortamını 4 °C'de saklayın.
   3. Gün 1 ortamı ve yıkama ortamı 1'in gerekli hacminde bir alikotu 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın.
   4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
      NOT: Protokolde kullanılan yıkama besiyeri, %1 antibiyotik ile desteklenmiş, her güne/evreye özgü bazal besiyerinden oluşur. Doğrudan farklılaştırma protokolünün yıkama adımları, yalnızca belirtilen yıkama ortamının ("yıkama ortamı 1 veya 2", Malzeme Tablosu olarak anılır) eklenmesini ve ardından açıklanan prosedür 2.2.4'ü izleyerek aspirasyonu içerir. Bu yıkama adımları için belirtilen belirli bir zaman dilimi olmadığını belirtmek önemlidir.
   5. Yıkama ortamı 1'i aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL Gün 1 ortamı ekleyin.
   6. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO₂ 'de 24 saat inkübe edin.
3. 1. Gün
   1. 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca gerekli hacimde 2,5 ila 4 orta miktarda bir alikotu önceden ısıtın.
   2. Gün 1 ortamını aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2.5 ila 4 orta günün 2 mL'sini ekleyin. Hücreleri yıkamayın.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
4. Günler 2,5 ila 4
   1. Günün kalan hacminin bir kısmını 2,5 ila 4 orta boy 37 °C su banyosunda 5 dakika önceden ısıtın.
   2. Ortamı aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL taze hazırlanmış Gün 2.5 ila 4 orta ekleyin.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
5. 4. Gün
   NOT: Bu aşamada, kesin endoderm belirteçlerinin ekspresyonu maksimumdadır ve hücreler ilkel bağırsak tüpü farklılaşmasını başlatabilir.
   1. 4. Gün ilkel bağırsak aşaması ortamının (altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) gerekli hacminin bir alikotunu hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. Aspire Günleri 2,5 ila 4 orta ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
   3. Yıkama ortamını 1 aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 4. gün ilkel bağırsak aşaması ekleyin.
   4. Plakayı 48 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
6. 6 ila 8. Günler
   NOT: Bu aşamada, hücreler posterior ön bağırsak kaderi üzerinde daha fazla farklılaşma başlatır.
   1. Gerekli hacim 6 ila 8 posterior foregut ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 4. Gün ortamını aspire edin ve hemen kuyunun kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 48 saat boyunca% 5 CO₂ içeren 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
7. 8 ila 12. Günler
   NOT: Hücreler pankreas progenitörlerinin farklılaşmasına hazırdır.
   1. Gerekli hacim 8 ila 12 gün pankreas progenitörleri sahne ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 6 ila 8 orta günleri aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca %5_CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.
8. 12. Gün: Kümeleme adımını gerçekleştirme
   NOT: Bu aşamada, hücreler yoğun bir tek tabaka oluşturur ve kümeler oluşturmak için 3D hücre kültürüne geçirilir. Bu adım, β benzeri hücrelerin doğal insan adacıklarına yapısal benzerliğini arttırmak için farklılaşma için çok önemlidir, ancak aynı zamanda hem hücresel hem de küme seviyelerinde işlevsel benzerliklerini geliştirir¹¹ (Şekil 1).
   1. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2 mL yapışma önleyici durulama solüsyonu ile 400 μm'lik mikro kuyular içeren 6 oyuklu bir plakaya (Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi: İnsan Kök Hücresinden Kaynaklı β Hücreler Yönlendirilmiş Farklılaşma, Gün 12) muamele edin.
      NOT: Mikro kuyu, hücrelerin kuyu dibine yapışmasını önler ve 3D kümelerin mekanik oluşumunu kolaylaştırır.
   2. Santrifüj plakasını 1.300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Ters mikroskop altında herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Kabarcık gözlenmezse, yapışma önleyici durulama solüsyonunu aspire edin ve hemen 2 mL yıkama ortamı 2 ekleyin (Malzeme tablosu).
   4. Adım 1.8.3'ü tekrarlayın. iki kez.
   5. Küme ortamının gerekli hacmini hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 -25 °C) 20 dakika ısıtın. 6 oyuklu bir plakanın iki oyuğunun, 4 mL küme ortamı ile 400 μm mikro kuyulu 6 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna girdiğinden emin olun.
   6. Pankreas progenitör ortamını aspire edin ve ayrışma tamponu ekleyin (oyuk başına 0.5 mL).
   7. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2-5 dakika inkübe edin. Ayrışma sürecini ters çevrilmiş bir mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin ve hücrelerin çoğu yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma tamponunu aspire edin.
   8. Ayrışma tamponunu aspire edin ve hemen her oyuğa 1 mL küme ortamı ekleyin.
   9. P1000 pipet ve 1.000 μL filtre uçları kullanarak altı kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın.
   10. Hücreleri ve küme ortamı karışımını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   11. Kalan tüm hücreleri toplamak için 1 mL küme ortamı ekleyin.
   12. Küme ortamını gereken toplam hacme ekleyin, böylece mikro kuyu plakasının her bir oyuğu 4 mL karışım kümesi ortamına/hücrelerine sahip olur.
   13. Yıkama ortamını 2 mikro kuyulu 6 oyuklu plakadan aspire edin ve hücre süspansiyonunu aktarın. Plakayı 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
9. 13. Gün: Kümelenme sonrası hücrelerin ele alınması ve 13. günden itibaren ortamlarının değiştirilmesi.
   NOT: Kümeler son derece hassastır ve sonraki günlerde bütünlüklerini ve yaşayabilirliklerini sağlamak için dikkatli bir şekilde ele alınmaları gerekir. Bu nedenle, 12. günden sonraki kümelenme sonrası dönemde kümeleri yakından izlemek çok önemlidir. Deneysel süreçte başarılı sonuçları teşvik etmek için düzenli değerlendirme ve ayarlamalar şarttır.
   1. Gerekli hacimde 13 gün ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve 15 ila 20 pankreas endokrin progenitör ortamı için 50 mL'lik ayrı bir konik tüpte hazırlayın.
   2. Bir p1000 pipet ve 1.000 μL filtrelenmiş uçlar kullanarak mikro kuyu 6 oyuklu plakadan kümeleri 50 mL'lik bir konik tüpe yavaşça toplayın.
   3. Kalan kümeleri toplamak ve kümeleri tüpe aktarmak için 1 mL Gün 13 ortamı ekleyin.
   4. Hücrelerin yerçekimi altında 5 dakika boyunca konik tüpün dibine doğal olarak oturmasına izin verin.
   5. Hücre kümelerini bozmadan tüpten mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin. Pipet uçları kümelere dokunmamalı veya aspire etmemelidir, sadece süpernatanta dokunmalıdır.
   6. Aşağıdakilere göre gerekli Gün 13 ortamı hacmini ekleyin: 1 kuyucuklu mikro kuyu 6 oyuklu plaka, düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakanın (oyuk başına 2 mL ortam) üç kuyucuğuna gider.
   7. Aspirasyon kümelerinden kaçınarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   8. Süspansiyonu çok düşük yapışan 6 oyuklu bir plakaya aktarın.
   9. Plakayı altı kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   10. Plakayı 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
   11. Bu bölüm 2.9'da açıklandığı gibi, farklılaşmanın sonuna kadar sonraki tüm adımlarda ortam değişikliklerini gerçekleştirin.
10. 15 - 20. Günler
    1. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe toplayarak ve 13. gün için 2.9.4 ila 2.9.10 arasındaki adımları izleyerek, farklılaşmanın 21. gününe kadar her 48 saatte bir pankreas endokrin progenitör evre ortamına geçin.
11. 21-27. Günler
    NOT: Bu aşamada, kümeler pankreas β hücrelerine farklılaşır.
    1. Pankreas β hücreli aşama ortamını hazırlayın.
    2. Ortamı 15 ila 21. günler için açıklandığı gibi iki günde bir değiştirin.
       NOT: 25. günden sonra, adacık benzeri organoidler, tamamen işlevsel olduklarını doğrulamak için analize tabi tutulabilir.

3. Pankreas β hücreli kümelerin boyanması

NOT: Farklılaşma sonrası kümelerin işlevsel değerlendirmesini incelemek için bu adımı gerçekleştirin

1. Farklılaşmanın sonunda 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde beş ila on küme toplayın.
2. Hücre kümelerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin.
3. Kümelere 1 mL PBS ekleyin ve kümeleri bozmadan 1.000 μL'lik bir pipet ucuyla PBS'yi çıkarın.
4. Kümelere 200 μL %30 sükroz ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Kümeleri bir kriyokalıba aktarın, fazla sakkarozu çıkarın, bir damla OCT ortamı ekleyin ve kümeleri OCT ortamı ile karıştırın.
6. Cryomold'u kuru buz üzerinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
7. Bir mikrotom/veya kriyostat kullanarak mikroskop lamları üzerindeki donmuş bloktan 5 μm'lik kesitler kesin.
8. Slaytları lekelenene kadar -80 °C dondurucuda saklayın.
9. Boyama gününde slaytları -80 °C dondurucudan çıkarın.
10. Kriyo kalıbın bölümlerinin etrafındaki buzu dikkatlice çıkarın.
11. Hücre kümelerini hidrofobik bir kalemle slaytlar üzerinde daire içine alın.
12. Slaytları PBS içeren bir slayt boyama kavanozunda 15 dakika boyunca rehidre edin.
13. Slayt boyama kavanozuna soğuk metanol ekleyin ve sürgülü kavanozu -20 °C'de 10 dakika bekletin.
14. Slaytları bir PBS kavanozuna daldırın.
15. Adım 3.14'ü üç kez tekrarlayın.
    NOT: Aşağıdaki tüm yıkama adımları için bu yöntemi kullanın.
16. PBS'yi slaytlardan çıkarın ve PBS-T'de %2-5 BSA içeren 100 μL engelleme solüsyonu ile hemen kapatın.
17. Her slayta engelleme solüsyonu ekleyin ve parafin filmle örtün.
18. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 1 saat inkübe edin.
19. Reaktifler ve Çözeltiler bölümünde verilen oranları kullanarak bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin.
20. Engelleme çözümünü slaytlardan çıkarın.
21. Hemen seyreltilmiş antikorlar ekleyin ve slaytın kurumasını önlemek için slaytları parafilm ile örtün.
22. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
23. Ertesi gün slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
24. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası hazırlayın.
25. Slaytlardan fazla PBS-T'yi çıkarın.
26. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası ekleyin. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 45 dakika inkübe edin.
27. Slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
28. Slaytlardaki sıvıyı çıkarın.
29. Her bölüme bir damla histoloji montaj ortamı ekleyin.
30. Slaytı bir cam kapakla örtün.
31. Floresan mikroskobu kullanarak lekeli slaytların fotoğraflarını çekin.

4. GSIS (glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu testi)

1. Üç farklı çözelti hazırlayın: düşük glikozlu KREBS çözeltisi, yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ve KCl'li düşük glikozlu KREBS çözeltisi.
2. Tüm çözeltileri 37 °C su banyosunda ısıtın.
3. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak benzer büyüklükte yaklaşık 10 - 15 kümeyi dikkatlice seçin ve kümelerin kurumasını önlemek için bunları az miktarda farklılaştırılmış ortamla birlikte 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Kümeler çıplak gözle görülebilmelidir, ancak değilse, kümeleri seçmek ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için farklılaşmış kümeler içeren plakayı ters mikroskop altına yerleştirin.
4. Tüpü kümeler ve ortam ile bir tüp rafına yerleştirin ve kümelerin tüpün dibine batmasını bekleyin.
5. 200 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı yavaşça aspire edin ve 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin.
6. Adacıkları düşük glikoz çözeltisinde 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Deneylerde küme sayılarının ve tutarlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için, tüpe yapışma eğiliminde olduklarından, aktarım sırasında çözeltideki tüm kümelerin varlığının kontrol edilmesi önerilir.
7. Tüpü inkübatörden çıkarın ve herhangi bir küme aspire etmeden 200 μL KREBS çözeltisini yavaşça aspire edin.
8. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
9. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisinin hacmini 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
10. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
11. 200 μL yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
12. 200 μL yüksek glikozlu KREBS'yi 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümü için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
13. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
14. 200 μL KCl KREBS çözeltisi ekleyin ve ayrı tedaviler için tekrarlayın.
15. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
16. 200 μL KCl KREBS solüsyonunu 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Diğer tedaviler için tekrarlayın.
17. 50 μL ultra saf su ekleyin ve toplam insülin içeriğini ölçmeye devam edin.
18. Adacıklar ve ultra saf su ile tüpe 150 μL asit etanol çözeltisi ekleyin.
19. Numuneleri gece boyunca (12 - 15 saat) 4 °C'de saklayın.
20. Ertesi gün, her numuneyi girdaplayın.
21. Adacık dokusunun tamamen parçalanmasını sağlamak için 1 saniye boyunca% 20 güce ayarlanmış bir elektrik sonikatörü ile sonikasyon gerçekleştirin.
    NOT: Görünür küme kalmayana kadar 4.21 adımını yineleyin.
22. Tüm numuneleri 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı saklayın.
23. Daha sonra insülin ölçümlerini normalleştirmek için kullanılabilecek bir nanodrop spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.

Bu yazıda açıklanan protokol, β benzeri hücreleri hPSC'lerden¹⁰ ayırt etmek için oldukça verimli bir yaklaşım sunar. Bu süreç, kolayca ölçeklendirilebilen bir 2D kültür sistemi kullanır ve farklılaşmayı öğrenme, daha küçük projeler ve laboratuvarlar ve bir iPSC hattının farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için pilot testler gibi çeşitli deneysel ortamlarda kullanılmasını sağlar.

Glikoz homeostazı hakkında fikir edinmek için adacıklardaki farklılaşmış β hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek esastır. Bu tipik olarak, β hücre belirteçleri ve insülin ekspresyonu için immün boyama gibi çeşitli deneylerin yanı sıra, düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak adacık işlevini test eden glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testleri yoluyla elde edilir ^12,13. β hücreleri, β hücre kimliğini oluşturmak ve sürdürmek için kritik olan Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 ve Neurod1 dahil olmak üzere imza genlerine sahiptir⁹. İmmün boyama teknikleri, doku kesitleri içinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştırmak için değerlidir. β hücreli belirteçler için immün boyama, temel pankreas soy belirteçlerinin ekspresyon seviyelerini değerlendirebilir ve farklılaşma sürecinin aslına uygunluğu ve belirli uygulamalar için optimizasyonu hakkında içgörüler sağlayabilir ^9,12.

Bu çalışmada, insan doğal adacıklarında bulunanlara benzeyen β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerini içeren kümeleri ayırt etmek için Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC raportör hattı kullanıldı. Bu belgedeki Şekil 2 , farklılaşma sürecinin verimliliği ve doğruluğu ile ilgili önemli bulgular sunmaktadır. Sonuçlar, pankreas soyu içinde insülin eksprese eden hücrelerin yüksek oranda zenginleştiğini ve bu hücrelerin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu sergilediğini göstermektedir. Bu, farklılaşma süreci boyunca fonksiyonel β benzeri hücrelerin başarılı bir şekilde üretildiğini gösterir.

Farklılaşmış hücreler düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonları ile uyarıldı ve GSIS sonuçları, Mel1 hücrelerinden türetilen kümelerin, glikoza insülin sekresyonu yanıtlarında adacıklara benzer şekilde işlev gördüğünü gösterdi. Mel1'den türetilen kümelerin, düşük glikoz konsantrasyonlarına kıyasla yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 100 kat daha fazla insülin salgıladığı bulundu. Spesifik olarak, insülin içeriği 3.3 mM düşük glikozda %0.003 ± %0.002 ve 16.7 mM yüksek glikozda %0.236 ± %0.197 idi.

Mel1 INS-GFP hESC'lerden türetilen kümeler, GSIS testine ek olarak bileşimlerini ve işlevselliklerini belirlemek için daha fazla analize tabi tutuldu. Spesifik olarak, β hücreli imza genlerinin ekspresyonu ve kümeler içinde farklı hücre tiplerinin varlığı araştırıldı. Sonuçlar, bu işlemden elde edilen pankreas soyunun insülin pozitif hücrelerde yüksek oranda zenginleştirildiğini gösterdi, bu da hESC'lerin β hücre benzeri hücrelere farklılaşma sürecinde yüksek düzeyde başarı olduğunu gösterdi. Ayrıca, β hücreli kimliklerin kurulması ve sürdürülmesi için önemli olan Nkx6.1 ve Pdx1 gibi imza genlerinin ekspresyonu incelenmiştir. Analiz, hücrelerin yaklaşık% 25 ve% 40'ının sırasıyla Nkx6.1 ve Pdx1'i eksprese ettiğini ortaya koydu ve kümelerin farklılaşmış β benzeri hücreler içerdiğine dair ek kanıtlar sağladı (küme başına ortalama Nkx6.1+ hücreleri% 24.9 ±% 6.2, n = 9 küme, Pdx1+ hücreleri% 40.2 ±% 6.2, n = 9, SEM, Şekil 2). Ek olarak, kümeler, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık% 15'ini oluşturan glukagon pozitif hücreler gibi diğer hücre tiplerini içeriyordu. Bu hücreler tipik olarak Langerhans'ın doğal adacıklarının alfa hücrelerinde bulunur, bu da kümelerin hücre bileşimi açısından insan adacıklarına çok benzediğini düşündürür.

Şekil 1: hPSC'lerin pankreas β hücrelerine doğru farklılaşması. (A) Şematik gösterimi in vitro hPSC'lerin pankreas β hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması, altı ardışık aşamayı içerir: kesin endoderm indüksiyonu, ilkel bağırsak tüpü oluşumu, posterior ön bağırsak kader spesifikasyonu, pankreas progenitör üretimi, pankreas endokrin progenitör oluşumu ve nihayetinde pankreas β hücre farklılaşması. Pankreas β hücre farklılaşması, belirli zamanlarda belirli hücre sinyal yollarının düzenlenmesi ile insan adacık gelişiminin temel aşamalarını kullanır. B27: B-27 Eki; Ri: rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü veya ROCK inhibitörü; T3: tiroid hormonu; KGF: insan KGF / FGF-7 proteini; RepSox: Aktivin / Nodal / TGF-β yolu inhibitörü; ALK5'i inhibe eder; RA: Retinoik asit; ZS: çinko sülfat; UFH: fraksiyone edilmemiş heparin; XX: gama-Sekretaz İnhibitörü XX; APH: afidikolin; EGF: epidermal büyüme faktörü; LDN: BMP İnhibitörü III, LDN-212854; Siklo: Siklopamin- KAAD. (B) Pluripotent kök hücrelerden pankreas β hücrelerine farklılaşmanın çeşitli aşamalarında yakalanan hücresel morfoloji görüntüleri. İlk görüntü, farklılaşmanın ilk gününde insan pluripotent kök hücrelerini göstermektedir (HPSC'lerin tek tabakası). (C) 11. günde, hücreler pankreas progenitör aşamasındadır. 100 μm'lik ölçek çubuğu. (D) 12. günde, pankreas progenitör aşamasında hücrelerin ayrışmasından sonra 6 oyuklu plakanın mikro kuyularında kümeler oluşur. (E) 13. günde, kümeler düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakadadır. 100 μm'lik ölçek çubuğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farklılaşmış Mel1 InsGFP/w hESC raportör hattı^14'ten elde edilen kümeler, β hücre olgunluk belirteçlerini eksprese eden insülin üreten hücrelerin varlığı açısından değerlendirildi. (A) Kümelerin immünofloresan görüntüleri, glukagon üreten hücrelere (yaklaşık% 15) kıyasla insülin üreten hücrelerin (yaklaşık% 60) baskınlığını ortaya çıkaran dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak kriyokalıp kesitlerinden (5 μm) yakalandı (n = 9 küme, yaklaşık 18.000 hücre, SEM). (B) Kümelerin immünofloresan görüntüleri, pankreas β hücresi belirteçleri Nkx6.1'i birlikte eksprese eden insülin üreten hücrelerin baskınlığını gösteren dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak kriyokalıp kesitlerinden (5 μm) elde edildi (n = 9 küme, yaklaşık 18.000 hücre). (C) İnsülin pozitif, glukagon pozitif ve β hücreli belirteçler Nkx6.1 pozitif hücrelerin ve β hücreli belirteçler Pdx1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için belirteçlerin immün boyanması için özel olarak tasarlanmış ImageJ hücre sayacı makrosu kullanıldı. (D) Farklılaşmış kümelerde (n=9, SEM) yüksek glikoz stimülasyonuna (16.7mM glikoz) yanıt olarak 100 kat artış gösteren Mel1 InsGFP/w hESC türevi kümelerin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yönlendirilmiş farklılaşma için medya kompozisyonunun özeti. Bu tablo, glikoz ile uyarılan insülin sekresyon tamponu ile birlikte kök hücre matrisi ve ortamının üzerinde yönlendirilmiş farklılaşmanın her günü/aşaması için kullanılan ortam bileşiminin bir özetini sağlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

hPSC'lerin pankreas β hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaşması, rutin kültürlemenin ve seçilen hPSC'lerin geçişinin tüm yönlerinin optimize edilmesine bağlıdır. Bu, hücre hattının normal bir karyotipe sahip olmasını, mikoplazma enfeksiyonu için negatif olmasını ve plazmit veya viral vektör genomlarından arınmış olmasını sağlamayı içerir. Ayrıca, hiPSC'leri kullanırken, pilot deneyler için hala yeniden programlanmakta olan en eski pasajı kullanmaktan kaçınmak önemlidir. Bu deneyler, en iyi farklılaşma potansiyeline ve optimum geçiş sayısına sahip hPSC hattını belirlemek için küçük ölçekte yapılmalıdır.

Farklılaşma verimliliğini etkileyebilecek diğer parametreler arasında kullanılan kök hücre ortamının kalitesi, kaplama yoğunluğu ve geçiş sayısı^10,12 yer alır. Bu protokol, ilgili tüm parametrelerin optimize edilmesini sağlayarak farklılaşma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir¹⁰.

hPSC'lerin β hücrelere farklılaşmasını desteklemek için her aşamada spesifik formülasyonlara sahip farklılaşma ortamı kullanılır. Aktivin A ve bir Wnt agonisti, kesin endoderm hücrelerine geçişi başlatmak için farklılaşma ortamında kullanılır. İlkel bağırsak tüpü aşamasında, β hücrelere¹⁵ daha fazla farklılaşmayı teşvik etmek için ortama KGF eklenir ve KGF'nin bu dahil edilmesi, Sui, Egli ve ^ark.10'un orijinal protokolünden farklı olarak 6. günden 8. güne kadar korunur. Pankreas progenitör aşamasında, spesifik ortam bileşimi, Pdx1 transkripsiyon faktörünün ekspresyonunu arttırmak için optimize edilir. Bu, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu^8'i inhibe eden yüksek konsantrasyonda retinoik asit (RA), KGF ve LDN193189 kullanılarak elde edilir. Farklılaşma endokrin aşamasına ilerledikçe, kültür ortamı Notch sinyalini aşağı regüle edecek şekilde değiştirilir. Bu, bir γ-sekretaz inhibitörü olan XXI'nin yanı sıra T3 (tiroid hormonu), RA ve Aktivin / BMP / TGF-β yolu^8'in bir inhibitörü olan RepSox'un dahil edilmesiyle elde edilir. Bu spesifik bileşik kombinasyonu, pankreas progenitörlerinin endokrin progenitörlere farklılaşmasını teşvik etmek için kullanılır. Son olarak, doğrudan farklılaşma sürecini optimize etmek için, pankreas progenitörlerinden endokrin progenitörlere farklılaşma sırasında afidikolin (APH) eklenir. APH'nin bu ilavesi, β hücre farklılaşmasını daha da geliştirmeyi amaçlamaktadır ve Sui, Egli ve ^ark.10,11 tarafından önerilen ilk protokolden farklı bir modifikasyonu temsil etmektedir.

Farklılaşma işlemi sırasında, hücre yoğunluğunu izlemek ve aşırı birleşmeyi önlemek çok önemlidir, çünkü bu, uygun farklılaşmayı engelleyebilir. Yüksek yoğunluklu kültürler, kesin endoderme farklılaşmayı inhibe ederek yüksek Oct4 ekspresyonunu koruyabilir. İlk yıkama adımında ROCK inhibitörünün çıkarılması, farklılaşmayı başlatmak ve hPSC'lerin pluripotent durumunun değiştirilmesine izin vermek için gereklidir. İnsülin lokusuna entegre edilmiş bir GFP'ye sahip Mel1 INS-GFP gibi bir floresan markörü kullanmak, pankreas progenitörü ve β hücre aşamalarındaki farklılaşma ilerlemesinin değerlendirilmesini kolaylaştırır ve aşağı akış deneylerine yardımcı olur¹⁴.

İnsan pluripotent kök hücrelerini pankreas β benzeri hücrelere ayırmak için mevcut protokol, farklı hPSC hatları arasında verimlilikte değişkenlik göstermiştir¹⁰. Ek olarak, ortaya çıkan β benzeri hücreler, insan pankreas adacıklarına kıyasla fonksiyonel olgunlaşmamışlık sergiler ve hücre başına daha düşük insülin sekresyonu gösterir. Bu sınırlamayı daha da ileri götürmek için, β benzeri hücrelerin in vivo olgunlaşması, farklılaşmanın son aşamalarında adacık organoidlerinin hayvan modellerine nakledilmesiyle^{sağlanabilir 6,7}.

Bu sınırlamalara rağmen, hPSC'lerin pankreas β hücrelerine farklılaşması, mevcut yöntemlere göre önemli bir potansiyele sahiptir ^8,9,10. Bu teknik, glikoza yanıt veren ve β hücreli belirteçleri eksprese eden çok sayıda β hücre benzeri hücre üretmeye izin verir (Pdx1 ve Nkx6.1, bkz. Şekil 2). Bu, insan pankreas adacıklarının kullanımıyla ilgili etik, teknik ve kaynak sınırlamaları olmadan yapılır. Ek olarak, bu teknik, ilaç testi ve hastalık modellemesi için hastaya özgü β hücreler üretilebildiğinden, kişiselleştirilmiş tıbba uygulanma potansiyeline sahiptir ^4,6,7. Teknik ayrıca, pankreas β hücrelerinin kaybını veya işlev bozukluğunu içeren diyabet tedavisinde gelecekteki uygulamalara da sahip olabilir ^4,6,7.

Ines Cherkaoui, Araştırmacı Ödülü için Wellcome Trust'a (212625/Z/18/Z), Program hibesi için UKRI MRC'ye (MR/R022259/1), Proje hibesi için Diabetes UK'ye (BDA16/0005485), başlangıç fonları için CRCHUM'a, John R. Evans Lider Ödülü için Innovation Canada'ya (CFI 42649) teşekkür eden GAR'a Diabetes UK öğrenciliği (BDA 18/0005934) tarafından desteklendi. Proje hibesi için NIH-NIDDK (R01DK135268) ve ekip hibesi için CIHR, JDRF (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-SN). Camille Dion ve Dr Harry Leitch, insan hiPSC'lerinin üretimi ve kültürüne yardımları için, NIHR Imperial BRC (Biyomedikal Araştırma Merkezi) Organoid tesisi, Londra.