Оптимизированный протокол генерации функциональных инсулинсекретирующих клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток человека

В данной статье представлен протокол направленной дифференцировки и функционального анализа β-клеточных клеток. Описаны оптимальные условия культивирования и пассажи плюрипотентных стволовых клеток человека перед получением инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Шестиступенчатая дифференцировка прогрессирует от окончательного формирования энтодермы до функциональных β-клеточных клеток, секретирующих инсулин в ответ на глюкозу.

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут дифференцироваться в любой тип клеток, что делает их отличным альтернативным источником β-клеток поджелудочной железы человека. ПСК могут быть либо эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), полученными из бластоцисты, либо индуцированными плюрипотентными клетками (ИПСК), полученными непосредственно из соматических клеток с помощью процесса перепрограммирования. Здесь представлен видеопротокол, описывающий оптимальные условия культивирования и пассажа ПСК до их дифференцировки и последующей генерации инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Эта методология следует шестиступенчатому процессу направленной дифференцировки β клеток, в ходе которого ПСК дифференцируются в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивную кишечную трубку, заднюю часть передней кишки, предшественников поджелудочной железы, эндокринных предшественников поджелудочной железы и, в конечном счете, β-клетки поджелудочной железы. Примечательно, что данная методика дифференцировки занимает 27 дней для генерации β-клеток поджелудочной железы человека. Потенциал секреции инсулина оценивали с помощью двух экспериментов, которые включали иммуноокрашивание и стимулированную глюкозой секрецию инсулина.

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железы^{человека1}. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты², и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток³. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики ^1,4. Сахарный диабет является хроническим заболеванием, поражающим >400 миллионов человек во всем мире и возникающим в результате неспособности организма регулировать гликемию из-за сбоя или потери^{β-клеток} поджелудочной железы. Ограниченная доступность островковых клеток поджелудочной железы для трансплантации препятствует разработке клеточной заместительной терапии диабета 2,4,6,7. Способность генерировать глюкозочувствительные инсулинсекретирующие клетки с помощью чПСК служит полезной клеточной моделью для изучения развития и функционирования островков человека. Он также может быть использован для тестирования потенциальных терапевтических кандидатов для лечения диабета в контролируемой среде. Кроме того, чПСК обладают потенциалом для продуцирования островковых клеток поджелудочной железы, генетически идентичных пациенту, снижая риск иммунного отторжения после трансплантации ^2,4,7.

В последние годы были достигнуты значительные успехи в совершенствовании протоколов культивирования и дифференцировки ПСК, что привело к повышению эффективности и воспроизводимости процесса дифференцировки в направлении получения β-клеток поджелудочной железы ^8,9.

В следующем протоколе описаны основные этапы направленной дифференцировки β-клеток поджелудочной железы. Он включает в себя регуляцию специфических клеточных сигнальных путей в определенные моменты времени. Он основан на протоколе, разработанном Sui L. et ^al.10 (2018) для генерации hPSCs в β-клетки поджелудочной железы. Протокол был скорректирован с учетом недавних обновлений Sui L. et ^al.11 (2021), поскольку последние исследования подчеркивают важность использования лечения афидиколином (APH) для усиления дифференцировки β-клеток. Текущий протокол включает добавление APH в среду на более поздних стадиях процесса. Кроме того, были внесены изменения в состав среды на ранних стадиях дифференцировки по сравнению с первоначальным протоколом. Заметным изменением является добавление фактора роста кератиноцитов (KGF) на 6-й день и продолжающееся до 8-го дня. Фактор роста кератиноцитов (КГФ) вводят с 6-го по 8-й день, что незначительно отличается от исходного протокола¹⁰, где КГФ не включался в среду 4-й стадии.

Первым и важным этапом в образовании β-клеточных клеток является направленная дифференцировка ПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивный зародышевой слой, который дает начало эпителиальной выстилке различных органов, включая поджелудочную железу. После образования ДЭ клетки подвергаются дифференцировке в примитивную кишечную трубку, после чего следует уточнение судьбы задней части передней кишки. Затем задняя часть передней кишки развивается в клетки-предшественники поджелудочной железы, которые обладают потенциалом дифференцироваться во все типы клеток поджелудочной железы, включая эндокринные и экзокринные клетки. Последующая стадия процесса включает эндокринных предшественников поджелудочной железы, дающих начало клеткам, секретирующим гормоны, обнаруженным в островках Лангерганса. В конце концов, процесс дифференцировки достигает своей конечной стадии, образуя полностью функциональные β-клеточные клетки поджелудочной железы ^9,10. Важно отметить, что этот процесс является сложным и часто требует оптимизации условий культивирования, таких как специфические факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса, для повышения эффективности и специфичности дифференцировки ^9,10. Кроме того, получение функциональных β-клеточных клеток из ПСК in vitro по-прежнему остается серьезной проблемой. Текущие исследования сосредоточены на совершенствовании протоколов дифференцировки и усилении созревания и функции полученных β-клеток⁹.

В этом протоколе использование щадящей диссоциации клеток во время культивирования и пассажа чПСК имеет важное значение для поддержания жизнеспособности и плюрипотентности клеток, значительно повышая эффективность дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы. Кроме того, каждая среда, специфичная для конкретной стадии, была тщательно оптимизирована в соответствии с протоколом, разработанным Sui L. et ^al.10 для обеспечения высокого выхода инсулинсекретирующих клеток в кластерах, которые очень напоминают человеческий островок.

Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 10 000 клеток. В таблице 1 приведена сводная информация о составе среды, используемой для каждого дня/стадии направленной дифференцировки на матриксе стволовых клеток и среде, а также на стимулированном глюкозой буфере секреции инсулина.

1. Пассажирование плюрипотентных стволовых клеток человека перед дифференцировкой в 6-луночных планшетах

Примечание: Надлежащий пассаж стволовых клеток человека перед их дифференцировкой в β-клеточные клетки является решающим шагом в установлении экспериментального процесса. Неправильное разведение пассажа или количество клеток присоединения может поставить под угрозу эффективность и точность дифференцировки.

1. Приготовьте питательную среду для стволовых клеток, покрытие и растворы для диссоциации (как указано в таблице 1).
2. За 1-2 ч до пассажа шестилуночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия (1 мл на лунку) и инкубировать при 37 °C, 5% CO₂.
3. Нагреть аликвоту питательной среды стволовых клеток при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин.
4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 1 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния.
5. Повторите шаг 1.4. дважды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: D-PBS добавляется для промывки ячеек и удаления предыдущей среды и соединений. Важно отметить, что для этапов промывки не требуется никаких конкретных временных рамок, так как воздействие D-PBS не повреждает hPSCs, предотвращая разрыв или усадку клеток, вызванных осмосом.
6. Аспирируйте D-PBS, добавьте 500 мкл раствора диссоциации для каждой лунки и оставьте на 2-5 минут при комнатной температуре (15 - 25 °C).
7. Пока клетки диссоциируют, аспирируйте раствор для покрытия новой 6-луночной планшета и добавьте 1-2 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния, в каждую лунку.
8. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом.
9. Отсасывайте раствор диссоциации, когда 80-90% клеток округлились, но все еще прилипают.
10. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK.
11. Соберите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, используя 1 000 мкл стерильных фильтрованных наконечников для пипеток и пипетку P1000.
12. Медленно растирайте клеточную суспензию вверх и вниз в пипетке стерильным наконечником пипетки с фильтром на 1000 мкл, чтобы разбить колонии, но не более 10 раз.
13. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK, чтобы помочь отделить оставшиеся ПСК, и перенести клеточную суспензию в ту же коническую пробирку объемом 15 мл (1.10).
14. Аспирируйте D-PBS из только что покрытой пластины и сразу же добавьте клеточную суспензию из конической пробирки объемом 15 мл. Чтобы обеспечить оптимальный рост клеток, высевайте в диапазоне 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ жизнеспособных клеток на лунку при использовании 6-луночной пластины (от 1 из 10 до 1 из 50 расщепов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета объема каждая лунка 6-луночного планшета должна содержать 2 мл среды стволовых клеток с ингибитором ROCK.
15. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, а также из стороны в сторону 5-10 раз.
16. Поместите планшет в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 24 ч.
17. На следующий день заменяют свежей средой стволовых клеток без ингибитора РОК, а затем каждые 2 дня до тех пор, пока слияние ПСК не достигнет 80 - 95%.

2. Направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК могут быть использованы для прямого процесса дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы при достижении 80-95% конфлюенции.

1. День -1: Пассаж клеток День -1 дифференцировки:
   1. За 1-2 ч до прохода 6-луночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ в течение 1 ч.
   2. Выполните шаги с 1.1 по 1.10 и перейдите к подсчету ячеек.
   3. Загрузите 10 мкл клеточной смеси, добавьте равный объем трипанового синего и аккуратно перемешайте.
   4. Рассчитайте концентрацию клеток. Используйте 0,8 × 10⁶ клеток/мл - 1,0 x 10⁶ клеток/мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, для покрытия покрытой 6-луночной пластины 2 мл среды на лунку.
   5. Быстро перемещайте пластину вперед и назад, из стороны в сторону три раза.
   6. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 . Быстро перемещайте пластину вперед и назад, а затем снова из стороны в сторону 10 раз. Затем выдерживают планшет в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что максимальное прикрепление и равномерное распределение клеток не нарушают клетки, перемещая пластину после помещения в инкубатор. Открывайте и закрывайте инкубатор очень аккуратно.
   7. Поместите бутылку с базальной средой на дни 0-4 при температуре 4 °C, чтобы она оттаяла на ночь.
2. День 0
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК должны быть на 80 - 95% сливающимися, не запускайте процесс дифференцировки в окончательную энтодерму под этим слиянием.
   1. На льду размораживают как базальную среду в дни 0-4, так и добавки (см. Таблицу материалов).
   2. Приготовьте в двух конических пробирках только необходимый объем для использования в 1-й день (2 мл на лунку 6-луночного планшета), а в отдельной пробирке удвойте объем на 2,5-й день 4 (2 x 2 мл на лунку 6-луночного планшета). Храните среду со 2,5 по 4 день при температуре 4 °C.
   3. Прогрейте аликвоту необходимого объема среды Day 1 и средства для стирки 1 на водяной бане с температурой 37 °C в течение 5 мин.
   4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочная среда, используемая в протоколе, состоит из базальной среды, специфичной для каждого дня/этапа, дополненной 1% антибиотиками. Этапы промывки, предусмотренные протоколом прямой дифференциации, включают в себя только добавление назначенной промывочной среды (называемой «промывочная среда 1 или 2», Таблица материалов) и последующую аспирацию в соответствии с описанной процедурой 2.2.4. Важно отметить, что для этих этапов стирки не указаны конкретные временные рамки.
   5. Отсасывайте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл средства 1-го дня к стенке лунки.
   6. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч.
3. День 1
   1. Предварительно прогрейте аликвоту необходимого объема среды 2,5-4 дня на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
   2. Аспирируйте среду 1-го дня и сразу же добавьте 2 мл среды 2,5-4 дня к стенке лунки. Не мойте клетки.
   3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 36 часов.
4. Дни с 2,5 по 4
   1. Предварительно подогрейте аликвоту оставшегося объема 2,5-4 суток на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
   2. Аспирируйте среду и сразу же добавьте 2 мл свежеприготовленной среды 2,5-4 дня к краю лунки.
   3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 36 часов.
5. День 4
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии экспрессия окончательных маркеров энтодермы максимальна, и клетки могут инициировать примитивную дифференцировку кишечных трубок.
   1. Приготовьте аликвоту необходимого объема среды 4-го дня примитивной кишки (2 мл на лунку шестилуночной пластины) и прогрейте ее при комнатной температуре (15 °С -25 °С) в течение 20 мин.
   2. Аспират со 2,5 по 4 день и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
   3. Аспирируйте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл примитивной кишки на 4-й день в стенку лунки.
   4. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 48 часов.
6. Дни с 6 по 8
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии клетки инициируют дальнейшую дифференцировку в заднюю часть передней кишки.
   1. На 6-8 дни приготовьте необходимый объем среды для задней кишки (2 мл на лунку 6-луночной пластины) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 минут.
   2. Аспирируйте среду на 4-й день и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8-го дня задней кишки сбоку от лунки.
   3. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, содержащий 5%_CO2 , на 48 ч.
7. Дни с 8 по 12
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к дифференцировке предшественников поджелудочной железы.
   1. Приготовьте необходимый объем среды стадии панкреатических предшественников с 8 по 12 день (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 мин.
   2. Аспират на 6-8 дни и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8 дней задней кишки к краю лунки.
   3. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, содержащий 5%_CO2 , на 48 ч.
8. День 12: Выполнение шага кластеризации
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки образуют плотный монослой и будут переведены в 3D-клеточную культуру для формирования кластеров. Этот этап имеет решающее значение для дифференцировки, чтобы усилить структурное сходство β подобных клеток с нативными человеческими островками, а также улучшить их функциональное сходство как на клеточном, так и на кластерном уровнях¹¹ (рис. 1).
   1. Обработайте 6-луночную планшет, содержащую микролунки размером 400 мкм (как указано в таблице материалов: направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека, день 12) 2 мл раствора для промывки против адгезии при комнатной температуре (15 °C - 25 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микролунка предотвращает прикрепление клеток к дну скважины и облегчает механическое формирование 3D-кластеров.
   2. Центрифужная пластина при 1 300 x g в течение 5 мин.
   3. Проверьте наличие пузырьков под инвертированным микроскопом. Если пузырьков не наблюдается, отсасывайте антиадгезионный промывочный раствор и немедленно добавляйте 2 мл моющего средства 2 (Таблица материалов).
   4. Повторите шаг 1.8.3. два раза.
   5. Подготовьте необходимый объем кластерной среды и прогрейте ее при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин. Убедитесь, что две лунки 6-луночной планшета входят в одну лунку 6-луночной микролунки 6-луночной планшета с 4 мл кустовой среды.
   6. Аспират панкреатической среды-предшественника и добавление диссоциационного буфера (0,5 мл на лунку).
   7. Выдерживают при комнатной температуре (15 °C - 25 °C) в течение 2-5 мин. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом и аспирируйте диссоциационный буфер, когда большинство клеток округлились, но все еще адгезивны.
   8. Аспирируйте диссоциационный буфер и сразу же добавляйте по 1 мл кластерной среды в каждую лунку.
   9. Диссоциируйте клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз шесть раз с помощью пипетки P1000 и наконечников фильтра объемом 1 000 мкл.
   10. Переложите клетки и смесь кластерной среды в коническую пробирку объемом 50 мл.
   11. Добавьте 1 мл кластерной среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки.
   12. Добавьте кластерную среду к общему необходимому объему, чтобы в каждой лунке планшета микролунок было 4 мл смеси кластерной среды/ячеек.
   13. Отсасывают промывное средство 2 из микролунок 6-луночной пластины и переносят суспензию ячейки. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 24 ч.
9. День 13: Работа с клетками после кластеризации и смена их среды, начиная с 13-го дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры очень чувствительны и требуют осторожного обращения, чтобы обеспечить их целостность и жизнеспособность в последующие дни. Поэтому крайне важно внимательно следить за кластерами в течение периода после кластеризации после 12-го дня. Регулярная оценка и корректировка необходимы для достижения успешных результатов в экспериментальном процессе.
   1. Готовят необходимый объем среды 13-го дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и в отдельной конической пробирке по 50 мл на 15-20 сутки эндокринной среды-предшественника поджелудочной железы.
   2. Медленно собирайте кластеры из планшета с 6 лунками в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки p1000 и фильтрованных наконечников объемом 1 000 мкл.
   3. Добавьте 1 мл среды на 13-й день, чтобы собрать оставшиеся кластеры и перенести кластеры в пробирку.
   4. Дайте клеткам естественным образом застыть под действием силы тяжести на дно конической трубки в течение 5 минут.
   5. Отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости из пробирки, не нарушая клеточные кластеры. Наконечники пипеток не должны касаться и аспирировать кластеры, а только надосадочную жидкость.
   6. Добавьте необходимый объем среды на 13-й день следующим образом: 1 лунка микролунки 6-луночная пластина входит в три лунки низкоприкрепленной 6-луночной пластины (2 мл среды на лунку).
   7. Осторожно поднимайте и опускайте пипетку, избегая аспирационных кластеров.
   8. Переложите суспензию на 6-луночную пластину с очень низкой адгезией.
   9. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, из стороны в сторону шесть раз.
   10. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 48 ч.
   11. Выполняйте изменения среды на всех последующих шагах до конца дифференцирования, как описано в разделе 2.9.
10. Дни с 15 по 20
    1. Каждые 48 ч до 21-го дня дифференцировки переходят на эндокринную среду эндокринной стадии поджелудочной железы, собирая клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и выполняя шаги 2.9.4–2.9.10 в течение 13-го дня.
11. Дни с 21 по 27
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кластеры дифференцируются в β-клетки поджелудочной железы.
    1. Подготавливают среду β-клеточной стадии поджелудочной железы.
    2. Меняйте носитель через день, как описано в течение 15-21 дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После 25-го дня островковые органоиды могут быть подвергнуты анализу, чтобы подтвердить, что они полностью функциональны.

3. Окрашивание β-клеточных кластеров поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг для изучения функциональной оценки кластеров после дифференцировки

1. Соберите от пяти до десяти кластеров в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл в конце дифференцировки.
2. Зафиксируйте клеточные кластеры 200 мкл 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте 1 мл PBS к кластерам и удалите PBS наконечником пипетки объемом 1 000 мкл, не повредив кластеры.
4. Добавьте 200 мкл 30% сахарозы к кластерам и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
5. Переложите кластеры в криоформу, удалите лишнюю сахарозу, добавьте каплю среды O.C.T. и смешайте кластеры со средой O.C.T.
6. Заморозьте криомолд на сухом льду и храните при температуре -80 °C.
7. Вырежьте срезы размером 5 мкм из замороженного блока на предметных стеклах микроскопа с помощью микротома/или криостата.
8. Храните предметные стекла при температуре -80 °C в морозильной камере до появления пятен.
9. В день окрашивания достаньте предметные стекла из морозильной камеры с температурой -80 °C.
10. Осторожно удалите лед вокруг секций криоформы.
11. Обведите скопления клеток на предметных стеклах гидрофобной ручкой.
12. Регидратируйте предметные стекла в банке для окрашивания предметных стекол, содержащей PBS, в течение 15 минут.
13. Добавьте холодный метанол в банку для окрашивания предметных стекол и поместите банку с предметными стеклами при температуре -20 °C на 10 минут.
14. Погрузите слайды в банку PBS.
15. Повторите шаг 3.14 три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для всех последующих этапов стирки.
16. Снимите ПБС с предметных стекол и немедленно накройте 100 мкл блокирующего раствора с 2-5% БСА в ПБС-Т.
17. Добавьте блокирующий раствор на каждое предметное стекло и накройте парафиновой пленкой.
18. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре (15 -25 °С).
19. Разведите первичные антитела в блокирующем растворе, используя соотношения, указанные в разделе «Реагенты и растворы».
20. Снимите блокирующий раствор с направляющих.
21. Сразу же добавьте разбавленные антитела и накройте предметные стекла парапленкой, чтобы предметное стекло не высохло.
22. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
23. На следующий день промойте предметные стекла 3 - 5 раз ПБС-Т.
24. Приготовьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК.
25. Удалите излишки PBS-T с предметных стекол.
26. Добавьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК. Выдерживать 45 мин при комнатной температуре (15 -25 °C).
27. Вымойте предметные стекла 3 - 5 раз с помощью PBS-T.
28. Удалите жидкость с предметных стекол.
29. Добавьте по капле гистологической монтажной среды в каждый срез.
30. Накройте предметное стекло крышкой.
31. Сфотографируйте окрашенные предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. GSIS (глюкозостимулированный анализ секреции инсулина)

1. Приготовьте три разных раствора: раствор KREBS с низким содержанием глюкозы, раствор KREBS с высоким содержанием глюкозы и раствор KREBS с низким содержанием глюкозы и KCl.
2. Подогрейте все растворы на водяной бане 37 °C.
3. Осторожно отоберите около 10–15 кластеров одинакового размера с помощью наконечника для пипетки на 1000 мкл и переложите их в пробирку объемом 1,5 мл вместе с небольшим количеством дифференцированной среды, чтобы избежать высыхания кластеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры должны быть видны невооруженным глазом, но если нет, поместите планшет с дифференцированными кластерами под инвертированный микроскоп, чтобы выбрать кластеры и перенести их в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Поместите пробирку с гроздьями и средой на решетку для пробирок и подождите, пока грозди опустятся на дно пробирки.
5. Медленно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 200 мкл и добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы.
6. Островки инкубируют в растворе с низким содержанием глюкозы в течение 1 ч при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точной оценки числа кластеров и согласованности в экспериментах рекомендуется проверять наличие всех кластеров в растворе во время переноса, так как они имеют тенденцию прилипать к пробирке.
7. Извлеките пробирку из инкубатора и медленно аспирируйте 200 мкл раствора KREBS, не аспирируя кластеры.
8. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
9. Аспирируйте объем 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
10. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
11. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с высоким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
12. Аспирируйте 200 мкл KREBS с высоким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
13. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
14. Добавьте 200 мкл раствора KCl KREBS и повторите для отдельных обработок.
15. Выдерживать 30 мин при температуре 37 °C.
16. Аспирируйте 200 мкл раствора KCl KREBS в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для других процедур.
17. Добавьте 50 мкл сверхчистой воды и приступайте к измерению общего содержания инсулина.
18. Добавьте 150 мкл кислого раствора этанола в пробирку с островками и сверхчистой водой.
19. Хранить образцы при температуре 4 °C в течение ночи (12 - 15 ч).
20. На следующий день перемешайте каждый образец.
21. Выполняйте ультразвуковую терапию с помощью электрического ультразвукатора, установленного на мощность 20% в течение 1 с, чтобы обеспечить полный лизис островковой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте шаг 4.21 до тех пор, пока не исчезнут оставшиеся кластеры.
22. Центрифугируют все образцы при 10 000 × г в течение 10 мин и выдерживают надосадочную жидкость.
23. Измерьте концентрацию ДНК с помощью нанокапельного спектрофотометра, который затем можно использовать для нормализации показателей инсулина.

Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК¹⁰. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких как дифференциация обучения, небольшие проекты и лаборатории, а также пилотные тесты для оценки потенциала линии iPSC для дифференциации.

Важно охарактеризовать функциональные свойства дифференцированных β-клеток в островках, чтобы получить представление о гомеостазе глюкозы. Обычно это достигается с помощью различных экспериментов, таких как иммуноокрашивание на маркеры β-клеток и экспрессию инсулина, а также анализы глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS), которые проверяют функцию островков в ответ на низкие и высокие концентрации глюкозы^12,13. β-клетки обладают сигнатурными генами, включая Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 и Neurod1, которые имеют решающее значение для установления и^{поддержания идентичности} β-клеток9. Методы иммуноокрашивания полезны для исследования экспрессии и локализации белка в срезах тканей. Иммуноокрашивание для маркеров β-клеток позволяет оценить уровни экспрессии ключевых маркеров линии поджелудочной железы, что дает представление о точности и оптимизации процесса дифференцировки для конкретных применений ^9,12.

В этом исследовании репортерная линия Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC была использована для дифференциации кластеров, содержащих различные типы клеток, включая β-клетки, напоминающие те, которые обнаружены в нативных островках человека. На рисунке 2 в этой статье представлены важные выводы относительно эффективности и точности процесса дифференциации. Результаты демонстрируют высокое обогащение инсулин-экспрессирующих клеток в пределах линии поджелудочной железы, и эти клетки демонстрируют глюкозостимулированную секрецию инсулина. Это указывает на успешную генерацию функциональных β подобных клеток в процессе дифференцировки.

Дифференцированные клетки стимулировали низкими и высокими концентрациями глюкозы, и результаты GSIS показали, что кластеры, полученные из клеток Mel1, функционировали аналогично островкам в их реакции секреции инсулина на глюкозу. Было обнаружено, что кластеры, полученные из Mel1, секретируют в 100 раз больше инсулина в ответ на высокие концентрации глюкозы по сравнению с низкими концентрациями глюкозы. В частности, содержание инсулина составляло 0,003 ± 0,002% при низком содержании глюкозы 3,3 мМ и 0,236 ± 0,197% при высоком содержании глюкозы 16,7 мМ.

Кластеры, полученные из ЭСК Mel1 INS-GFP, были подвергнуты дальнейшему анализу для определения их состава и функциональности в дополнение к анализу GSIS. В частности, была исследована экспрессия β-клеточных сигнатурных генов и присутствие различных типов клеток в кластерах. Результаты показали, что панкреатическая линия, полученная в результате этого процесса, высоко обогащена инсулин-положительными клетками, что свидетельствует о высоком уровне успешности процесса дифференцировки чЭСК в β-клеточные клетки. Кроме того, была изучена экспрессия сигнатурных генов, таких как Nkx6.1 и Pdx1, важных для установления и поддержания идентичности β-клеток. Анализ показал, что примерно 25% и 40% клеток экспрессировали Nkx6.1 и Pdx1 соответственно, что дает дополнительные доказательства того, что кластеры содержат дифференцированные β-подобные клетки (среднее количество клеток Nkx6.1+ на кластер 24,9% ± 6,2%, n=9 кластеров, клетки Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, SEM, рис. 2). Кроме того, кластеры содержали другие типы клеток, такие как глюкагон-положительные клетки, которые составляли около 15% от общей клеточной популяции. Эти клетки, как правило, обнаруживаются в альфа-клетках нативных островков Лангерганса, что позволяет предположить, что кластеры очень похожи на человеческие островки с точки зрения клеточного состава.

Рисунок 1: Дифференцировка чПСК в сторону β-клеток поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение направленной дифференцировки ПСК in vitro в β-клетки поджелудочной железы, которая включает шесть последовательных стадий: окончательная индукция энтодермы, формирование примитивной кишечной трубки, спецификация судьбы задней части передней кишки, генерация предшественника поджелудочной железы, формирование эндокринного предшественника поджелудочной железы и, в конечном счете, дифференцировка β-клеток поджелудочной железы. Дифференцировка β-клеток поджелудочной железы использует ключевые стадии развития островков человека с регуляцией специфических сигнальных путей клеток в определенное время. B27: Дополнение B-27; Ri: ро-ассоциированный ингибитор протеинкиназы или ингибитор РОК; Т3: гормон щитовидной железы; KGF: человеческий белок KGF/FGF-7; RepSox: ингибитор пути активина/нода/TGF-β; Ингибирует ALK5; RA: Ретиноевая кислота; ZS: сульфат цинка; НФГ: нефракционированный гепарин; XX: ингибитор гамма-секретазы XX; APH: афидиколин; EGF: эпидермальный фактор роста; LDN: Ингибитор BMP III, LDN-212854; Цикло: Циклопамин - KAAD. (B) Изображения клеточной морфологии, полученные на различных стадиях дифференцировки от плюрипотентных стволовых клеток до β-клеток поджелудочной железы. На первом изображении показаны плюрипотентные стволовые клетки человека в первый день дифференцировки (монослой HPSCs). (C) На 11-й день клетки находятся в стадии предшественника поджелудочной железы. Масштабная линейка 100 мкм. (D) На 12-е сутки после диссоциации клеток на стадии предшественника поджелудочной железы в микролунках 6-луночного планшета образуются кластеры. (E) На 13-й день кластеры находятся в 6-луночном планшете с низким прикреплением. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Кластеры, полученные из дифференцированной репортерной линии¹⁴ Mel1 InsGFP/w hESC, были оценены на наличие инсулин-продуцирующих клеток, экспрессирующих маркеры зрелости β-клеток. (A) Иммунофлуоресцентные изображения кластеров были получены из криомольдных срезов (5 мкм) с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском, которая выявила преобладание инсулин-продуцирующих клеток (около 60%) по сравнению с глюкагон-продуцирующими клетками (примерно 15%) (n=9 кластеров, примерно 18 000 ячеек, SEM). (B) Иммунофлуоресцентные изображения кластеров были получены из криомольдных срезов (5 мкм) с помощью конфокальной микроскопии вращающихся дисков, которые показали преобладание инсулин-продуцирующих клеток, совместно экспрессирующих маркеры β-клеток поджелудочной железы Nkx6,1 (n=9 кластеров, приблизительно 18 000 клеток). (C) Для определения процентного содержания инсулин-позитивных, глюкагон-положительных и β-клеточных маркеров Nkx6.1-положительных клеток и β-клеточных маркеров Pdx1-положительных клеток использовали макрос ImageJ, специально разработанный для иммуноокрашивания маркеров. (D) Была оценена глюкозо-стимулированная секреция инсулина кластеров, полученных из Mel1 InsGFP/w hESC, которая продемонстрировала увеличение в 100 раз в ответ на высокую стимуляцию глюкозы (16,7 мМ глюкозы) в дифференцированных кластерах (n=9, SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сводная информация о составе сред для направленной дифференциации. В этой таблице представлена сводная информация о составе среды, используемой для каждого дня/стадии направленной дифференцировки на матриксе стволовых клеток и среде, а также на глюкозостимулируемом буфере секреции инсулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Успешная дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы зависит от оптимизации всех аспектов рутинного культивирования и пассажа выбранных ПСК. Это включает в себя обеспечение того, чтобы клеточная линия имела нормальный кариотип, была отрицательной на микоплазменную инфекцию и не содержала геномов плазмид или вирусных векторов. Кроме того, при использовании ИПСК важно избегать использования для пилотных экспериментов самых ранних пассажей, которые все еще подвергаются перепрограммированию. Эти эксперименты должны проводиться в небольших масштабах для выявления линии hPSC с наилучшим потенциалом дифференцировки и оптимальным числом пассажей.

Другие параметры, которые могут влиять на эффективность дифференцировки, включают качество используемой среды стволовых клеток, плотность покрытия и количество пассажей^10,12. Этот протокол был оптимизирован для обеспечения максимальной эффективности дифференциации за счет оптимизации всех соответствующих параметров¹⁰.

На каждом этапе используются дифференцировочные среды со специфическими составами для поддержки дифференцировки чПСК в β-клетки. Активин А и агонист Wnt используются в дифференцировочной среде для инициирования перехода к дефинитивным клеткам энтодермы. Во время примитивной стадии кишечной трубки KGF добавляется в среду для содействия дальнейшей дифференцировке в β-клетки¹⁵, и это включение KGF поддерживается с 6-го по 8-й день, в отличие от первоначального протокола Sui, Egli, et ^al.10. На стадии предшественника поджелудочной железы специфический состав среды оптимизируется для усиления экспрессии транскрипционного фактора Pdx1. Это достигается за счет использования высокой концентрации ретиноевой кислоты (RA), KGF и LDN193189, которые ингибируют путь⁸ костного морфогенетического белка (BMP). По мере того, как дифференцировка прогрессирует до эндокринной стадии, питательная среда модифицируется таким образом, чтобы подавить передачу сигналов Notch. Это достигается за счет включения XXI, ингибитора γ-секретазы, наряду с T3 (гормоном щитовидной железы), RA и RepSox, ингибитором пути^Activin/BMP/TGF-β 8. Эта специфическая комбинация соединений используется для того, чтобы способствовать дифференцировке предшественников поджелудочной железы в эндокринных предшественников. Наконец, для оптимизации процесса прямой дифференцировки в эндокринные предшественники вводят афидиколин (АФК). Это добавление APH направлено на дальнейшее усиление дифференцировки β-клеток и представляет собой модификацию, отличную от первоначального протокола, предложенного Sui, Egli, et ^al.10,11.

В процессе дифференцировки крайне важно контролировать плотность клеток и предотвращать чрезмерное слияние, так как это может препятствовать правильной дифференцировке. Культуры высокой плотности могут поддерживать высокую экспрессию Oct4, ингибируя дифференцировку в дефинитивную энтодерму. Удаление ингибитора ROCK на первом этапе промывки имеет важное значение для инициирования дифференцировки и изменения плюрипотентного состояния ПСК. Использование флуоресцентного маркера, такого как Mel1 INS-GFP с GFP, интегрированным в локус инсулина, облегчает оценку прогресса дифференцировки на стадии предшественника поджелудочной железы и β-клеток, помогая в последующих экспериментах¹⁴.

Текущий протокол дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в β подобные клетки поджелудочной железы продемонстрировал вариабельность эффективности среди различных линий hPSC¹⁰. Кроме того, полученные β-подобные клетки демонстрируют функциональную незрелость по сравнению с островками поджелудочной железы человека, демонстрируя более низкую секрецию инсулина на клетку. Для дальнейшего устранения этого ограничения созревание β подобных клеток in vivo может быть достигнуто путем трансплантации островковых органоидов животным моделям на заключительных стадиях дифференцировки ^6,7.

Несмотря на эти ограничения, дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы имеет значительный потенциал по сравнению с существующими методами ^8,9,10. Этот метод позволяет получить большое количество β-клеточных клеток, которые реагируют на глюкозу и экспрессируют β-клеточные маркеры (Pdx1 и Nkx6.1, см. рис. 2). Это делается без этических, технических и исходных ограничений, связанных с использованием островков поджелудочной железы человека. Кроме того, этот метод имеет потенциал для применения в персонализированной медицине, поскольку β-клетки, специфичные для конкретного пациента, могут быть сгенерированы для тестирования лекарств и моделирования заболеваний ^4,6,7. Этот метод также может найти применение в будущем при лечении диабета, связанного с потерей или дисфункцией β-клеток поджелудочной железы ^4,6,7.

Инес Шеркауи была поддержана стипендией Diabetes UK (BDA 18/0005934) для GAR, которая также благодарит Wellcome Trust за награду исследователя (212625/Z/18/Z), UKRI MRC за грант программы (MR/R022259/1), грант Diabetes UK за проект (BDA16/0005485), CRCHUM за стартап-фонды, Innovation Canada за премию John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) для проектного гранта и CIHR, JDRF для командного гранта (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Камилла Дион и д-р Гарри Лейтч за помощь в создании и культивировании ИПСК человека, Имперский центр биомедицинских исследований NIHR, Лондон.