פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתמיין לכל סוג של תא, מה שהופך אותם למקור חלופי מצוין לתאי β לבלב אנושיים. hPSCs יכולים להיות תאי גזע עובריים (hESCs) שמקורם בבלסטוציסט או תאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) הנוצרים ישירות מתאים סומטיים באמצעות תהליך תכנות מחדש. כאן מוצג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לתאר את התרבית האופטימלית ואת תנאי המעבר עבור hPSCs, לפני התמיינותם והדור הבא של תאי לבלב מייצרי אינסולין. מתודולוגיה זו עוקבת אחר תהליך בן שישה שלבים להתמיינות מכוונת של β תאים, שבו hPSCs מתמיינים לאנדודרם סופי (DE), צינור מעיים פרימיטיבי, גורל המעי הקדמי האחורי, אבות הלבלב, אבות אנדוקריניים של הלבלב, ובסופו של דבר תאי β של הלבלב. ראוי לציין כי מתודולוגיית התמיינות זו לוקחת תקופה של 27 ימים כדי ליצור תאי β הלבלב האנושי. הפוטנציאל של הפרשת אינסולין הוערך באמצעות שני ניסויים, שכללו הפרשת אינסולין ממריצה חיסונית והפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יש יכולת ייחודית להתמיין לסוגי תאים שונים, מה שהופך אותם לחלופה בת קיימא לתאי β של הלבלב האנושי¹. תאי גזע עובריים (hESCs) אלה מסווגים לשני סוגים: תאי גזע עובריים (hESCs), הנגזרים מהבלסטוציסט², ותאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs), הנוצרים על ידי תכנות מחדש של תאים סומטיים ישירות³. לפיתוח טכניקות להתמיין hPSCs לתאי β, יש השלכות חשובות הן על המחקר הבסיסי והן על הפרקטיקה הקלינית ^1,4. סוכרת היא מחלה כרונית המשפיעה על >400 מיליון אנשים ברחבי העולם ונובעת מחוסר היכולת של הגוף לווסת את הגליקמיה עקב תקלה או אובדן של תאי β הלבלב⁵. הזמינות המוגבלת של תאי איון בלבלב להשתלה עיכבה את הפיתוח של טיפולים בתחליפי תאים לסוכרת 2,4,6,7. היכולת לייצר תאים מפרישי אינסולין המגיבים לגלוקוז באמצעות hPSCs משמשת כמודל תאי שימושי לחקר התפתחות ותפקוד איים אנושיים. זה יכול לשמש גם כדי לבחון מועמדים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסוכרת בסביבה מבוקרת. יתר על כן, hPSCs יש פוטנציאל לייצר תאי איון הלבלב זהים גנטית לחולה, הפחתת הסיכון לדחייה חיסונית לאחר ההשתלה ^2,4,7.

בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בשכלול תרביות hPSC ופרוטוקולי התמיינות וכתוצאה מכך יעילות מוגברת ויכולת שחזור של תהליך ההתמיינות לקראת יצירת תאי β לבלב ^8,9.

הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים החיוניים של התמיינות מכוונת של תאי β הלבלב. זה כרוך בוויסות של מסלולי איתות תאיים ספציפיים בנקודות זמן שונות. הוא מבוסס על פרוטוקול שפותח על ידי Sui L. et ^al.10 (2018) לייצור hPSCs לתוך תאי β הלבלב. הפרוטוקול הותאם לעדכונים האחרונים של Sui L. et ^al.11 (2021), כאשר המחקר האחרון מדגיש את המשמעות של שימוש בטיפול באפידיקולין (APH) כדי לשפר את ההתמיינות של תאי β. הפרוטוקול הנוכחי כולל הוספת APH למדיום בשלבים מאוחרים יותר של התהליך. כמו כן, נעשו שינויים בהרכב המדיום בשלבים המוקדמים של הבידול בהשוואה לפרוטוקול הראשוני. שינוי בולט הוא הוספת גורם גדילה קרטינוציטים (KGF) ביום 6 ונמשך עד יום 8. גורם הגדילה של קרטינוציטים (KGF) מוצג מהיום ה-6 עד היום ה-8, השונה במקצת מהפרוטוקול הראשוני¹⁰, שבו KGF לא נכלל בתווך שלב 4.

השלב הראשון והחיוני ביצירת תאים דמויי תאי β הוא התמיינות מכוונת של hPSCs לאנדודרם סופי (DE), שכבת נבט פרימיטיבית המולידה את רירית האפיתל של איברים שונים, כולל הלבלב. לאחר היווצרות DE, התאים עוברים התמיינות לתוך צינור המעי הפרימיטיבי, אשר ואחריו מפרט את גורל המעי הקדמי האחורי. המעי הקדמי האחורי מתפתח לתאי אב של הלבלב, שיש להם פוטנציאל להתמיין לכל סוגי התאים של הלבלב, כולל התאים האנדוקריניים והאקסוקריניים. השלב הבא בתהליך מערב אבות אנדוקריניים של הלבלב, מה שמוליד את התאים מפרישי ההורמונים הנמצאים באיים של לנגרהנס. בסופו של דבר, תהליך ההתמיינות מגיע לשלב הסופי שלו על ידי ייצור תאי β לבלב מתפקדים במלואם דמויי תאים ^9,10. חשוב לציין כי תהליך זה מורכב ולעתים קרובות דורש אופטימיזציה של תנאי התרבית, כגון גורמי גדילה ספציפיים ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כדי לשפר את היעילות והספציפיות של התמיינות ^9,10. יתר על כן, יצירת תאים פונקציונליים דמויי תאי β מתאי PSC במבחנה היא עדיין אתגר גדול. המחקר המתמשך מתמקד בשיפור פרוטוקולי התמיינות ושיפור ההבשלה והתפקוד של β התאים המתקבלים⁹.

בפרוטוקול זה, השימוש בדיסוציאציה עדינה של תאים במהלך התרבית והמעבר של hPSCs חיוני לשמירה על יכולת הקיום והפלוריפוטנציה של התא, ומשפר באופן משמעותי את יעילות ההתמיינות לתאי β של הלבלב. בנוסף, כל מדיום ספציפי לשלב עבר אופטימיזציה קפדנית בהתאם לפרוטוקול שפותח על ידי Sui L. et ^al.10 כדי לקדם תפוקה גבוהה של תאים מפרישי אינסולין בצבירים הדומים מאוד לאי האנושי.

לפני תחילת ההבחנה, מומלץ לקבוע את המספר הנדרש של אורגנואידים דמויי איון למטרות ניסוי. בצלחת של 6 בארות, באר אחת עם מפגש של מעל 80% מורכבת בדרך כלל מ-2-2.3 מיליון hPSCs. בעוד שתחזית מדויקת מאתגרת בשל שינויים בקווי hPSC ויעילות הבידול, הערכה גסה היא פי 1.5 ממספר הבארות הראשוניות. התמיינות מכוונת יעילה מניבה בדרך כלל 1.6 עד 2 מיליון תאים לבאר בשש צלחות באר, המקיפות את כל התאים בתוך הצבירים ולא רק תאים מייצרי אינסולין. עבור צביר של 50 מיקרומטר, ניתן להעריך שהוא מכיל כ-10,000 תאים. טבלה 1 מספקת סיכום של הרכב המדיה המשמש לכל יום/שלב של התמיינות מכוונת על גבי מטריצת תאי גזע ומדיום, יחד עם מאגר הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

1. העברת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים התמיינות קודמת ב-6 צלחות באר

הערה: המעבר המתאים של תאי גזע אנושיים לפני התמיינות לתאים דמויי β תאים הוא צעד מכריע בביסוס תהליך הניסוי. דילול מעבר שגוי או מספר תא מצורף עלולים לפגוע ביעילות ההתמיינות ובנאמנות.

1. הכנת מדיום תרבית תאי גזע, ציפוי ותמיסות דיסוציאציה (כמפורט בטבלה 1).
2. 1-2 שעות לפני המעבר, מצפים צלחת שש בארות עם תמיסת ציפוי קר (1 מ"ל לכל באר) ודגרים ב 37 ° C, 5% CO₂.
3. מחממים אליקוט של תרבית תאי גזע בינונית בטמפרטורת החדר (15 -25 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות.
4. שאפו את מדיום תאי הגזע והוסיפו 1 מ"ל של D-PBS נטול סידן/מגנזיום.
5. חזור על שלב 1.4. פעמיים.
   הערה: D-PBS מתווסף כדי לשטוף את התאים ולהסיר את המדיום הקודם ותרכובות. חשוב לציין כי לא נדרשת מסגרת זמן ספציפית לשלבי השטיפה, שכן חשיפה ל- D-PBS אינה פוגעת ב- hPSCs, ומונעת קרע או התכווצות תאים הנגרמים על ידי אוסמוזה.
6. שואפים D-PBS, להוסיף 500 μL של פתרון דיסוציאציה עבור כל באר, ולתת לו לשבת במשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C).
7. בזמן שהתאים מתנתקים, שאפו את תמיסת הציפוי של צלחת 6 הבארות החדשה והוסיפו 1-2 מ"ל של D-PBS נטול סידן/מגנזיום לכל באר.
8. בדוק באופן קבוע את תהליך הדיסוציאציה תחת המיקרוסקופ ההפוך.
9. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה כאשר 80-90% מהתאים התעגלו אך עדיין דבקים.
10. הוסף 1 מ"ל של מדיום תאי גזע המכיל 10 μM מעכב ROCK.
11. אספו את התאים המנותקים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות קצוות פיפטה מסוננים סטריליים של 1,000 μL ופיפטה P1000.
12. לאט לאט triturate התא השעיה למעלה ולמטה פיפטה עם 1,000 μL פיפטה סטרילית מסונן קצה כדי לשבור את המושבות, אבל לא יעלה על 10 פעמים.
13. הוסף 1 מ"ל של מדיום תאי הגזע המכיל מעכב ROCK כדי לעזור לנתק את hPSCs הנותרים ולהעביר את תרחיף התא לאותו צינור חרוטי 15 מ"ל (1.10).
14. שאפו את D-PBS מהצלחת המצופה החדשה והוסיפו מיד את מתלה התא מצינור החרוטי 15 מ"ל. כדי להבטיח צמיחת תאים אופטימלית, זרעו טווח של 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ תאים קיימא לכל באר בעת שימוש בצלחת 6 באר (1 ל 10 עד 1 ל 50 פיצולים).
    הערה: לצורך חישוב נפח, כל באר של צלחת בעלת 6 בארות חייבת להכיל 2 מ"ל של תווך תאי גזע עם מעכב ROCK.
15. הזז את הצלחת במהירות קדימה ואחורה, ומצד לצד 5 - 10 פעמים.
16. מניחים את הצלחת ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור במשך 24 שעות.
17. החלף עם תווך תאי גזע טריים ללא מעכב ROCK למחרת, ולאחר מכן כל יומיים עד מפגש של hPSCs הגיע 80 - 95%.

2. התמיינות מכוונת β של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

הערה: hPSCs יכולים לשמש לתהליך התמיינות ישיר לתאי β לבלב כאשר 80-95% מפגש מושגת.

1. יום -1: מעבר התאים יום -1 להתמיינות:
   1. 1-2 שעות לפני המעבר, מצפים צלחת 6 באר עם תמיסת ציפוי קר ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור במשך 1 שעות.
   2. בצע את שלבים 1.1 עד 1.10 והמשך לספירת תאים.
   3. טוענים 10 μL מתערובת התאים, מוסיפים נפח שווה של Trypan Blue, ומערבבים בעדינות.
   4. חשב את ריכוז התא. השתמש 0.8 × 10⁶ תאים / מ"ל - 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל של תווך תאי גזע המכיל 10 μM מעכב ROCK כדי צלחת מצופה 6 באר עם 2 מ"ל של מדיה לכל באר.
   5. הזיזו את הצלחת במהירות קדימה ואחורה, מצד לצד שלוש פעמים.
   6. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ . הזז במהירות את הצלחת קדימה ואחורה, ומצד לצד שוב 10 פעמים. ואז לדגור את הצלחת במשך 4 שעות.
      הערה: ודא שהחיבור המרבי והפיזור הזוגי של התאים אינם מפריעים לתאים על-ידי הזזת הצלחת לאחר שהונחה באינקובטור. פתח וסגור את האינקובטור בזהירות רבה.
   7. הניחו את בקבוק המדיום הבסיסי לימים 0 עד 4 מעלות צלזיוס כדי להפשיר אותו למשך הלילה.
2. יום 0
   הערה: hPSCs חייב להיות 80 - 95% confluent, לא להתחיל את תהליך ההתמיינות כדי endoderm סופי תחת מפגש זה.
   1. על קרח, הפשירו גם את המדיום הבסיסי לימים 0 עד 4 וגם תוספים (ראו טבלת חומרים).
   2. הכינו בשני צינורות חרוטיים רק את הנפח הדרוש לשימוש ביום 1 (2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 בארות), ובצינור נפרד, הכפילו את הנפח ליום 2.5 עד 4 (2 x 2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר). אחסן את היום 2.5 עד יום 4 בינוני ב 4 °C (75 °F).
   3. יש לחמם אליציטוט של הנפח הדרוש של יום 1 בינוני וכביסה בינונית 1 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   4. שואפים את מדיום תאי הגזע ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום כביסה 1.
      הערה: אמצעי הכביסה המשמש בפרוטוקול מורכב מהמדיום הבסיסי הספציפי לכל יום/שלב, בתוספת אנטיביוטיקה 1%. שלבי הכביסה של פרוטוקול הבידול הישיר כוללים רק תוספת של אמצעי הכביסה הייעודי (המכונה "מדיום כביסה 1 או 2", טבלת חומרים) ושאיפה לאחר מכן, בהתאם לנוהל המתואר 2.2.4. חשוב לציין כי אין מסגרת זמן ספציפית המצוינת לשלבי כביסה אלה.
   5. שואפים לשטיפה בינונית 1 ומיד מוסיפים 2 מ"ל של מדיום יום 1 לצד הבאר.
   6. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.
3. יום 1
   1. מראש לחמם aliquot של נפח הדרוש של ימים 2.5 עד 4 בינוני באמבט מים 37 ° C במשך 5 דקות.
   2. שואפים את יום 1 בינוני ומיד מוסיפים 2 מ"ל של היום 2.5 עד 4 בינוני לצד הבאר. אין לשטוף את התאים.
   3. החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך 36 שעות.
4. ימים 2.5 עד 4
   1. מראש לחמם aliquot של נפח הנותר של היום 2.5 עד 4 בינוני ב 37 ° C אמבט מים במשך 5 דקות.
   2. שואפים את המדיום ומיד מוסיפים 2 מ"ל של ימים טריים מוכנים 2.5 עד 4 בינוניים לצד הבאר.
   3. החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך 36 שעות.
5. יום 4
   הערה: בשלב זה, הביטוי של סמני האנדודרם הסופיים הוא במקסימום, ותאים יכולים ליזום התמיינות פרימיטיבית של צינור המעי.
   1. הכינו אליציטוט של הנפח הדרוש של יום 4 שלב מעיים פרימיטיבי בינוני (2 מ"ל לכל באר של צלחת שש בארות) וחממו אותו בטמפרטורת החדר (15 ° C -25 ° C) במשך 20 דקות.
   2. לשאוף ימים 2.5 עד 4 בינוני ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום כביסה 1.
   3. שואפים את מדיום הכביסה 1, ומיד מוסיפים 2 מ"ל של שלב המעיים הפרימיטיבי של יום 4 לצד הבאר.
   4. החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך 48 שעות.
6. ימים 6 עד 8
   הערה: בשלב זה, התאים מתחילים התמיינות נוספת לגורל המעי הקדמי האחורי.
   1. מכינים את הנפח הדרוש של ימים 6 עד 8 תווך המעי הקדמי האחורי (2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר) ומחממים את המדיום בטמפרטורת החדר (15 ° C -25 ° C) במשך 20 דקות.
   2. שואפים את יום 4 בינוני ומיד מוסיפים 2 מ"ל של ימים 6 עד 8 תווך המעי הקדמי האחורי לצד הבאר.
   3. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37°C המכיל 5% CO₂ למשך 48 שעות.
7. ימים 8 עד 12
   הערה: התאים מוכנים לעבור התמיינות אבות הלבלב.
   1. מכינים את הנפח הדרוש של ימים 8 עד 12 אבות הלבלב שלב בינוני (2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר) ולחמם את המדיום בטמפרטורת החדר (15 ° C -25 ° C) במשך 20 דקות.
   2. שואפים ימים 6 עד 8 בינוניים ומיד מוסיפים 2 מ"ל של ימים 6 עד 8 תווך קדמי אחורי לצד הבאר.
   3. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C המכיל 5% CO₂ למשך 48 שעות.
8. יום 12: ביצוע שלב האשכולות
   הערה: בשלב זה, התאים יוצרים חד-שכבה צפופה, ויועברו לתרבית תאים תלת-ממדית ליצירת אשכולות. שלב זה חיוני עבור ההתמיינות כדי לשפר את הדמיון המבני של תאים דמויי β לאיים אנושיים מקומיים, אולם גם לשפר את הדמיון התפקודי שלהם הן ברמת התא והן ברמת הצביר¹¹ (איור 1).
   1. יש לטפל בצלחת בת 6 בארות המכילה מיקרו-בארות בגודל 400 מיקרומטר (כמפורט בטבלת החומרים: התמיינות מכוונת של תאי גזע אנושיים β תאים, יום 12) עם 2 מ"ל של תמיסת שטיפה נגד היצמדות בטמפרטורת החדר (15°C – 25°C).
      הערה: המיקרווול מונע מהתאים להיצמד לקרקעית הבאר ומקל על היווצרות מכנית של אשכולות תלת-ממדיים.
   2. צלחת צנטריפוגה ב 1,300 x גרם במשך 5 דקות.
   3. בדוק את נוכחותן של בועות תחת מיקרוסקופ הפוך. אם לא נצפו בועות, יש לשאוף לתמיסת שטיפה נגד היצמדות ולהוסיף מיד 2 מ"ל מדיום כביסה 2 (טבלת חומרים).
   4. חזור על שלב 1.8.3. פעמיים.
   5. מכינים את הנפח הדרוש של מדיום האשכול ומחממים אותו בטמפרטורת החדר (15 -25 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות. ודא כי שתי בארות של צלחת 6 בארות להיכנס לבאר אחת של 400 מיקרו בארות 6 צלחת באר עם 4 מ"ל של תווך אשכול.
   6. לשאוף מדיום אב הלבלב ולהוסיף חיץ דיסוציאציה (0.5 מ"ל לכל באר).
   7. יש לדגור בטמפרטורת החדר (15°C - 25°C) למשך 2-5 דקות. בדוק באופן קבוע את תהליך הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ הפוך ושאפו חיץ דיסוציאציה כאשר רוב התאים התעגלו אך עדיין דבקים.
   8. שאפו את חיץ הדיסוציאציה והוסיפו מיד 1 מ"ל מדיום אשכול לכל באר.
   9. נתק תאים על-ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה שש פעמים באמצעות פיפטה P1000 וקצות מסנן של 1,000 מיקרוליטר.
   10. מעבירים את התאים ואת תערובת אשכול בינוני לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
   11. הוסף 1 מ"ל של מדיום האשכול כדי לאסוף את כל התאים הנותרים.
   12. הוסף את תווך האשכול לנפח הכולל הדרוש כך שלכל באר של צלחת microwells יש 4 מ"ל של תערובת אשכול בינוני / תאים.
   13. שואפים את מדיום הכביסה 2 מ microwells צלחת 6-באר ולהעביר את השעיית התא. לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 24 שעות.
9. יום 13: טיפול בתאים לאחר קיבוץ באשכולות ושינוי המדיה שלהם מהיום ה-13 ואילך.
   הערה: אשכולות רגישים מאוד ודורשים טיפול זהיר כדי להבטיח את שלמותם ואת כדאיותם בימים הבאים. לכן, חיוני לעקוב מקרוב אחר האשכולות בתקופה שלאחר הקיבוץ שלאחר היום ה-12. הערכה והתאמות סדירות חיוניות לקידום תוצאות מוצלחות בתהליך הניסוי.
   1. הכינו את הנפח הדרוש של ימים 13 בינוניים (2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר), ובצינור חרוטי נפרד של 50 מ"ל ליום 15 עד 20 מדיום אב אנדוקריני הלבלב.
   2. אספו באיטיות אשכולות מצלחת הבאר microwells 6 לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות פיפטה p1000 וקצוות מסוננים של 1,000 μL.
   3. הוסף 1 מ"ל של יום 13 בינוני כדי לאסוף את האשכולות הנותרים ולהעביר את האשכולות לתוך הצינור.
   4. תנו לתאים להתמקם באופן טבעי תחת כוח הכבידה לתחתית הצינור החרוטי למשך 5 דקות.
   5. שאפו כמה שיותר סופרנאטנט מהצינור מבלי להפריע לצברי התאים. קצות הפיפטה לא צריכים לגעת ולא לשאוף את האשכולות אלא את הסופרנאטנט בלבד.
   6. הוסף את הנפח הדרוש של יום 13 בינוני על פי הדברים הבאים: 1 באר של microwells 6 צלחת באר נכנס לתוך שלוש בארות של צלחת 6 חיבור נמוך (2 מ"ל של מדיה לכל באר).
   7. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה, הימנעות אשכולות שאיפה.
   8. מעבירים את המתלים לצלחת 6 בארות נמוכה מאוד.
   9. הזיזו את הצלחת במהירות קדימה ואחורה, מצד לצד שש פעמים.
   10. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 48 שעות.
   11. בצע את השינויים הבינוניים בכל השלבים הבאים עד לסיום ההבחנה כמתואר בסעיף 2.9 זה.
10. ימים 15 עד 20
    1. שינוי לשלב האב האנדוקריני של הלבלב כל 48 שעות עד יום 21 של התמיינות על ידי איסוף תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל וביצוע שלבים 2.9.4 עד 2.9.10 ליום 13.
11. ימים 21 עד 27
    הערה: בשלב זה, צבירים מתמיינים לתאי β של הלבלב.
    1. הכן לבלב β תאים שלב מדיום.
    2. שנה את המדיום כל יומיים כמתואר עבור ימים 15 עד 21.
       הערה: לאחר היום ה-25, אורגנואידים דמויי איון יכולים לעבור ניתוח כדי לאשר שהם מתפקדים באופן מלא.

3. צביעה של אשכולות β תאי הלבלב

הערה: בצע שלב זה כדי ללמוד את ההערכה התפקודית של אשכולות לאחר דיפרנציאציה

1. לאסוף חמישה עד עשרה אשכולות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל בסוף ההבחנה.
2. תקן את אשכולות התאים עם 200 μL של 4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הוסף 1 מ"ל PBS לאשכולות והסר את PBS עם קצה פיפטה של 1,000 μL מבלי להפריע לאשכולות.
4. הוסיפו 200 μL של 30% סוכרוז לאשכולות ודגרו למשך הלילה ב-4°C.
5. מעבירים את האשכולות לקריומולד, מסירים סוכרוז עודף, מוסיפים טיפה של מדיום O.C.T. ומערבבים את האשכולות עם מדיום O.C.T.
6. מקפיאים את הקריומולד על קרח יבש ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C.
7. חתכו מקטעים של 5 מיקרומטר מהבלוק הקפוא בשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מיקרוטום/או קריוסטט.
8. יש לאחסן את המגלשות במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד להכתמה.
9. ביום הצביעה, הוציאו את המגלשות מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C.
10. בזהירות להסיר את הקרח סביב חלקים של cryomold.
11. הקף אשכולות תאים בשקופיות בעזרת עט הידרופובי.
12. התייבשו שקופיות בצנצנת מכתימת שקופיות המכילה PBS למשך 15 דקות.
13. מוסיפים מתנול קר לצנצנת מכתימת המגלשה ומניחים את הצנצנת עם המגלשות בטמפרטורה של -20°C למשך 10 דקות.
14. ניתן לטבול שקופיות בצנצנת PBS.
15. חזור על שלב 3.14 שלוש פעמים.
    הערה: השתמשו בשיטה זו לכל שלבי הכביסה הבאים.
16. הסר PBS מהשקופיות וכסה מיד עם 100 μL של פתרון חסימה עם 2-5% BSA ב- PBS-T.
17. הוסף פתרון חסימה לכל שקופית וכסה בסרט פרפין.
18. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס).
19. דלל את הנוגדנים העיקריים בתמיסת החסימה באמצעות היחסים המסופקים בסעיף ריאגנטים ופתרונות.
20. הסר את פתרון החסימה מהשקופיות.
21. הוסיפו מיד נוגדנים מדוללים וכסו שקופיות בפרפילם כדי למנוע מהמגלשה להתייבש.
22. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
23. למחרת שטפו את המגלשות 3 - 5 פעמים עם PBS-T.
24. הכינו נוגדנים משניים מדוללים וכתם DNA.
25. הסר עודפי PBS-T מהשקפים.
26. הוסף נוגדנים משניים מדוללים וכתם DNA. יש לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (15-25°C).
27. שטפו את המגלשות 3-5 פעמים עם PBS-T.
28. הסר את כל הנוזלים מהשקופיות.
29. הוסף טיפה של מדיום הרכבה היסטולוגיה לכל קטע.
30. כסו את המגלשה בכיסוי זכוכית.
31. צלמו שקופיות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. GSIS (בדיקת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז)

1. הכינו שלושה פתרונות שונים: תמיסת KREBS עם גלוקוז נמוך, תמיסת KREBS עם גלוקוז גבוה ותמיסת KREBS עם KCl.
2. חממו את כל הפתרונות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
3. בחר בזהירות סביב 10 - 15 אשכולות בגודל דומה באמצעות קצה פיפטה 1000 μL ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מ"ל יחד עם כמות קטנה של מדיום מובחן כדי למנוע ייבוש האשכולות.
   הערה: הצבירים צריכים להיות גלויים לעין בלתי, אך אם לא, הניחו את הצלחת המכילה אשכולות מובחנים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבחור את הצבירים ולהעביר אותם לצינור של 1.5 מ"ל.
4. הניחו את הצינור עם אשכולות ומדיום על מדף צינורות והמתינו עד שהאשכולות ישקעו לתחתית הצינור.
5. שאפו לאט את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת KREBS דלת גלוקוז.
6. לדגור על האיים בתמיסת גלוקוז נמוכה במשך 1 שעה ב 37 °C (77 °F).
   הערה: כדי להבטיח הערכה מדויקת של מספרי אשכולות ועקביות בניסויים, מומלץ לבדוק את נוכחותם של כל הצבירים בתמיסה במהלך ההעברה, מכיוון שהם נוטים להיצמד לצינור.
7. מוציאים את הצינור מהאינקובטור ושואבים לאט לאט 200 מיקרוליטר של תמיסת KREBS מבלי לשאוף אשכולות.
8. הוסף 200 μL של תמיסת KREBS דלת גלוקוז ודגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
9. שאפו נפח של 200 μL של תמיסת KREBS דלת גלוקוז לתוך צינור 500 μL ואחסנו אותו מיד ב -80 °C למדידות אינסולין. חזור על הפעולה לטיפולים נפרדים.
10. כדי לשטוף את האשכולות, הוסף 200 μL של תמיסת KREBS ללא גלוקוז לצינור המכיל את האשכולות. הניחו לצבירים לשקוע לתחתית הצינור, והוציאו בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לאשכולות.
11. הוסף 200 μL של תמיסת KREBS גלוקוז גבוהה ודגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
12. יש לשאוף 200 μL של KREBS עתיר גלוקוז לתוך צינור של 500 μL ולאחסן אותו מיד בטמפרטורה של -80°C למדידת אינסולין. חזור על הפעולה לטיפולים נפרדים.
13. כדי לשטוף את האשכולות, הוסף 200 μL של תמיסת KREBS ללא גלוקוז לצינור המכיל את האשכולות. הניחו לצבירים לשקוע לתחתית הצינור, והוציאו בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לאשכולות.
14. הוסף 200 μL של תמיסת KCl KREBS וחזור על הפעולה לקבלת טיפולים נפרדים.
15. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
16. יש לשאוף 200 μL של תמיסת KCl KREBS לתוך צינור של 500 μL ולאחסן אותו מיד בטמפרטורה של -80°C לצורך מדידות אינסולין. חזור על הפעולה לטיפולים אחרים.
17. הוסף 50 μL של מים טהורים במיוחד ולהמשיך למדוד את תכולת האינסולין הכוללת.
18. הוסף 150 μL של תמיסת אתנול חומצה לצינור עם איים ומים טהורים במיוחד.
19. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה (12 - 15 שעות).
20. למחרת, מערבלים כל דגימה.
21. בצע סוניקציה עם סוניק חשמלי המוגדר לעוצמה של 20% למשך שנייה אחת כדי להבטיח ליזה מלאה של רקמת האיון.
    הערה: חזור על שלב 4.21 עד שלא יהיו אשכולות נותרים גלויים.
22. צנטריפוגה את כל הדגימות ב 10,000 × גרם במשך 10 דקות ולשמור את supernatant.
23. מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפתי, אשר לאחר מכן יכול לשמש לנרמול מדידות אינסולין.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציע גישה יעילה ביותר להבחנה בין תאים דמויי β לבין hPSCs¹⁰. תהליך זה משתמש במערכת תרבות דו-ממדית הניתנת להרחבה בקלות, ומאפשרת את השימוש בה בסביבות ניסוי שונות, כגון בידול למידה, פרויקטים קטנים יותר ומעבדות, ובדיקות פיילוט להערכת הפוטנציאל של קו iPSC לבידול.

חיוני לאפיין את התכונות הפונקציונליות של תאי β ממוינים באיים כדי לקבל תובנה לגבי הומאוסטזיס גלוקוז. זה מושג בדרך כלל באמצעות ניסויים שונים כגון immunostaining עבור סמנים β תאים ביטוי אינסולין, כמו גם בדיקות הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS), אשר בודקים תפקוד איון בתגובה ריכוזי גלוקוז נמוכים וגבוהים^12,13. לתאי β יש גנים ייחודיים, כולל Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 ו-Neurod1, שהם קריטיים לביסוס ושמירה על זהות תאי β⁹. טכניקות אימונוסטיין הן בעלות ערך לחקר ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. Immunostaining עבור סמנים של β תאים יכול להעריך את רמות הביטוי של סמני שושלת לבלב מרכזיים, ומספק תובנות לגבי הנאמנות והאופטימיזציה של תהליך ההתמיינות עבור יישומים ספציפיים ^9,12.

במחקר זה, קו הכתבים Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC שימש כדי להבדיל בין צבירים המרכיבים סוגי תאים שונים, כולל תאי β הדומים לאלה הנמצאים באיים אנושיים מקומיים. איור 2 במאמר זה מציג ממצאים משמעותיים לגבי היעילות והדיוק של תהליך הבידול. התוצאות מראות העשרה גבוהה של תאים מבטאי אינסולין בתוך שושלת הלבלב, ותאים אלה מפגינים הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז. זה מצביע על הדור המוצלח של תאים פונקציונליים דמויי β באמצעות תהליך ההתמיינות.

התאים המתמיינים עוררו עם ריכוזי גלוקוז נמוכים וגבוהים, ותוצאות GSIS הראו כי הצבירים שמקורם בתאי Mel1 תפקדו באופן דומה לאיונים בתגובת הפרשת האינסולין שלהם לגלוקוז. הצבירים שמקורם ב-Mel1 נמצאו מפרישים פי 100 יותר אינסולין בתגובה לריכוזי גלוקוז גבוהים בהשוואה לריכוזי גלוקוז נמוכים. באופן ספציפי, תכולת האינסולין הייתה 0.003 ± 0.002% ב 3.3 mM גלוקוז נמוך ו 0.236 ± 0.197% ב 16.7 mM גלוקוז גבוה.

האשכולות שנגזרו מתאי ESC מסוג Mel1 INS-GFP עברו ניתוחים נוספים כדי לקבוע את הרכבם ותפקודם, בנוסף לבדיקת GSIS. באופן ספציפי, נחקרו הביטוי של גנים בעלי חתימת β תאים ונוכחותם של סוגי תאים שונים בתוך האשכולות. התוצאות הראו כי שושלת הלבלב המתקבלת מתהליך זה מועשרת מאוד בתאים חיוביים לאינסולין, מה שמצביע על רמה גבוהה של הצלחה בתהליך ההתמיינות של תאי גזע עובריים עובריים עובריים לתאים דמויי תאי β. כמו כן, נבדק ביטוי של גנים חתימה, כגון Nkx6.1 ו-Pdx1, החשובים לביסוס ותחזוקה של זהויות β-תאים. הניתוח גילה שכ-25% ו-40% מהתאים ביטאו Nkx6.1 ו-Pdx1, בהתאמה, מה שסיפק ראיות נוספות לכך שהצבירים הכילו תאים דמויי β ממוינים (ממוצע Nkx6.1+ תאים לצביר 24.9% ± 6.2%, n=9 אשכולות, תאי Pdx1+ 40.2% ± 6.2%, n=9, SEM, איור 2). בנוסף, הצבירים הכילו סוגי תאים אחרים, כגון תאים חיוביים לגלוקגון, שהיוו כ-15% מכלל אוכלוסיית התאים. תאים אלה נמצאים בדרך כלל בתאי אלפא של איים מקומיים של לנגרהנס, דבר המצביע על כך שהצבירים דומים מאוד לאיים אנושיים מבחינת הרכב התא.

איור 1: התמיינות של hPSCs לכיוון תאי β בלבלב. (A) ייצוג סכמטי של התמיינות מכוונת במבחנה של hPSCs לתאי β של הלבלב, הכולל שישה שלבים עוקבים: אינדוקציה אנדודרם סופית, היווצרות צינור מעי פרימיטיבי, מפרט גורל המעי הקדמי האחורי, יצירת אב לבלב, יצירת אב אנדוקריני של הלבלב, ובסופו של דבר, התמיינות תאי β של הלבלב. התמיינות תאי β הלבלב משתמשת בשלבי מפתח של התפתחות איים אנושיים, עם ויסות מסלולי איתות תאים ספציפיים בזמנים ספציפיים. B27: תוספת B-27; Ri: מעכב קינאז חלבון הקשור ל- rho או מעכב ROCK; T3: הורמון בלוטת התריס; KGF: חלבון KGF / FGF-7 אנושי; RepSox: מעכב מסלול Activin/Nodal/TGF-β; מעכב ALK5; RA: חומצה רטינואית; ZS: אבץ גופרתי; UFH: הפרין בלתי מקוטע; XX: מעכב גמא-Secretase XX; APH: aphidicolin; EGF: גורם גדילה אפידרמיס; LDN: מעכב BMP III, LDN-212854; ציקלו: ציקלופמין- KAAD. (B) תמונות של מורפולוגיה תאית שצולמו בשלבים שונים של התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי β של הלבלב. התמונה הראשונה מראה תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ביום הראשון של התמיינות (monolayer של HPSCs). (C) ביום ה-11, התאים נמצאים בשלב האב של הלבלב. סרגל קנה מידה של 100 מיקרומטר. (D) ביום ה -12, אשכולות נוצרים במיקרו-בארות של צלחת 6 בארות לאחר דיסוציאציה של תאים בשלב האב הלבלב. (E) ביום ה-13, האשכולות נמצאים בצלחת בעלת 6 בארות בעלת חיבור נמוך. סרגל קנה מידה של 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אשכולות שהתקבלו מ-Mel1 InsGFP/w hESC ממוין שורה¹⁴ הוערכו עבור נוכחות של תאים מייצרי אינסולין המבטאים סמני בשלות של β תאים. (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות של הצבירים צולמו מקטעי קריומולד (5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, אשר חשף את הדומיננטיות של תאים מייצרי אינסולין (כ-60%) בהשוואה לתאים מייצרי גלוקגון (כ-15%) (n=9 אשכולות, כ-18,000 תאים, SEM). (B) תמונות אימונופלואורסצנטיות של הצבירים התקבלו מקטעי קריומולד (5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, שהראו את הדומיננטיות של תאים מייצרי אינסולין המבטאים במשותף את סמני תאי β הלבלב Nkx6.1 (n=9 אשכולות, כ-18,000 תאים). (C) מאקרו מונה תאי ImageJ, שתוכנן במיוחד עבור צביעה חיסונית של סמנים, שימש כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים לאינסולין, גלוקגון חיובי ותאי β Nkx6.1 תאים חיוביים, וסמנים של β תאים Pdx1 חיוביים. (D) הוערכה הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז של אשכולות Mel1 InsGFP/w hESC, אשר הציגה עלייה של פי 100 בתגובה לגירוי גלוקוז גבוה (16.7mM גלוקוז) בצבירים המובחנים (n=9, SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: סיכום הרכב המדיה לבידול מכוון. טבלה זו מספקת סיכום של הרכב המדיה המשמש לכל יום/שלב של התמיינות מכוונת על גבי מטריצת תאי גזע ומדיום, יחד עם מאגר הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

ההתמיינות המוצלחת של hPSCs לתאי β בלבלב תלויה במיטוב כל ההיבטים של תרבית שגרתית ומעבר של hPSCs שנבחרו. זה כולל להבטיח כי קו התא יש קריוטיפ נורמלי, הוא שלילי עבור זיהום מיקופלסמה, והוא ללא פלזמה או גנום וקטורי ויראלי. יתר על כן, בעת שימוש ב- hiPSCs, חשוב להימנע משימוש במעבר המוקדם ביותר שעדיין עובר תכנות מחדש, לניסויי פיילוט. ניסויים אלה צריכים להתבצע בקנה מידה קטן כדי לזהות את קו hPSC עם פוטנציאל ההתמיינות הטוב ביותר ואת מספר המעברים האופטימלי.

פרמטרים נוספים שיכולים להשפיע על יעילות ההתמיינות כוללים את איכות מדיום תאי הגזע בו נעשה שימוש, צפיפות הציפוי ומספר המעברים^10,12. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כדי למקסם את יעילות הבידול על ידי הבטחת אופטימיזציה של כל הפרמטרים הרלוונטיים¹⁰.

מדיית התמיינות עם פורמולציות ספציפיות משמשת בכל שלב לתמיכה בהתמיינות של hPSCs לתאי β. Activin A ואגוניסט Wnt משמשים בתווך ההתמיינות כדי להתחיל את המעבר לתאי אנדודרם סופיים. במהלך שלב צינור המעי הפרימיטיבי, KGF מתווסף למדיום כדי לקדם התמיינות נוספת לתאי β¹⁵, והכללה זו של KGF נשמרת מהיום 6 עד 8, שונה מהפרוטוקול המקורי של Sui, Egli, et ^al.10. במהלך שלב האב הלבלב, הרכב המדיה הספציפי מותאם לשיפור הביטוי של גורם התמלול Pdx1. זה מושג על ידי שימוש בריכוז גבוה של חומצה רטינואית (RA), KGF ו- LDN193189, המעכב את מסלול החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP)⁸. ככל שההתמיינות מתקדמת לשלב האנדוקריני, מדיום התרבית משתנה כדי להפחית את הרגולציה של איתות Notch. זה מושג על ידי שילוב XXI, מעכב γ-secretase, יחד עם T3 (הורמון בלוטת התריס), RA, ו RepSox, מעכב של Activin/BMP/TGF-β מסלול⁸. שילוב ספציפי זה של תרכובות משמש לקידום ההבחנה של אבות הלבלב לאבות אנדוקריניים. לבסוף, כדי לייעל את תהליך ההתמיינות הישיר, אפידיקולין (APH) מוצג במהלך ההבחנה מאבות הלבלב לאבות אנדוקריניים. תוספת זו של APH נועדה לשפר עוד יותר את התמיינות תאי β, והיא מייצגת שינוי שונה מהפרוטוקול הראשוני שהוצע על ידי Sui, Egli, et ^al.10,11.

במהלך תהליך ההתמיינות, חיוני לעקוב אחר צפיפות התאים ולמנוע מפגש יתר, שכן זה יכול לעכב התמיינות נכונה. תרביות בצפיפות גבוהה יכולות לשמור על ביטוי גבוה של Oct4, מה שמעכב התמיינות לאנדודרם סופי. הסרת מעכב ROCK במהלך שלב השטיפה הראשון חיונית להתחלת התמיינות ומאפשרת לשנות את המצב הפלוריפוטנטי של hPSCs. שימוש בסמן פלואורסצנטי, כגון Mel1 INS-GFP עם GFP משולב בלוקוס האינסולין, מקל על הערכת התקדמות ההתמיינות בשלבי האב של הלבלב ותאי β, ומסייע לניסויים במורד הזרם¹⁴.

הפרוטוקול הנוכחי להתמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאים דמויי β לבלב הוכיח שונות ביעילות בין קווי hPSC שונים¹⁰. בנוסף, התאים דמויי β המתקבלים מפגינים חוסר בשלות תפקודית בהשוואה לאיי לבלב אנושיים, ומראים הפרשת אינסולין נמוכה יותר לכל תא. כדי להתמודד עם מגבלה זו עוד יותר, ניתן להשיג הבשלה in vivo של תאים דמויי β על ידי השתלת אורגנואידים של איונים במודלים של בעלי חיים בשלבים הסופיים של התמיינות ^6,7.

למרות מגבלות אלה, התמיינות של hPSCs לתאי β בלבלב היא בעלת פוטנציאל משמעותי ביחס לשיטות^{הקיימות 8,9,10}. שיטה זו מאפשרת לייצר מספר גדול של תאים דמויי תאי β שמגיבים לגלוקוז ומבטאים סמנים של β תאים (Pdx1 ו-Nkx6.1, ראו איור 2). זה נעשה ללא המגבלות האתיות, הטכניות והמקור הקשורות לשימוש באיי לבלב אנושיים. בנוסף, לטכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושמת ברפואה מותאמת אישית, שכן ניתן ליצור תאי β ספציפיים למטופל לצורך בדיקת תרופות ומידול מחלות ^4,6,7. לטכניקה עשויים להיות גם יישומים עתידיים בטיפול בסוכרת הכרוכים באובדן או תפקוד לקוי של תאי β הלבלב ^4,6,7.

אינס צ'רקאווי נתמכה על ידי מלגת סוכרת בריטניה (BDA 18/0005934) ל- GAR, שגם מודה לקרן Wellcome עבור פרס חוקר (212625/Z/18/Z), UKRI MRC עבור מענק תוכנית (MR/R022259/1), סוכרת בריטניה עבור מענק פרויקט (BDA16/0005485), CRCHUM עבור קרנות הזנק, חדשנות קנדה עבור פרס מנהיג ג'ון ר. אוונס (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) עבור מענק פרויקט, ו-CIHR, JDRF עבור מענק צוות (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). קמיל דיון וד"ר הארי ליטץ' על עזרתם ביצירת תאי גזע גזעיים אנושיים ובתרבותם, מתקן האורגנואידים NIHR Imperial BRC (מרכז המחקר הביו-רפואי), לונדון.