Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se diferenciar em qualquer tipo de célula, tornando-as uma excelente fonte alternativa de células-β pancreáticas humanas. As hPSCs podem ser células-tronco embrionárias (hESCs) derivadas do blastocisto ou células pluripotentes induzidas (hiPSCs) geradas diretamente de células somáticas usando um processo de reprogramação. Aqui um protocolo baseado em vídeo é apresentado para delinear as condições ideais de cultura e passagem para hPSCs, antes de sua diferenciação e subsequente geração de células pancreáticas produtoras de insulina. Essa metodologia segue o processo de seis estágios para diferenciação dirigida a células β, em que as hPSCs se diferenciam em endoderme (DE) definitiva, tubo intestinal primitivo, destino do intestino anterior, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, células β pancreáticas. Vale ressaltar que essa metodologia de diferenciação leva um período de 27 dias para gerar as células-β pancreáticas humanas. O potencial de secreção de insulina foi avaliado através de dois experimentos, que incluíram imunomarcação e secreção de insulina estimulada por glicose.

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade única de se diferenciar em vários tipos celulares, tornando-as uma alternativa viável às células-β pancreáticas humanas¹. Essas hPSCs são categorizadas em dois tipos: células-tronco embrionárias (hESCs), derivadas do blastocisto², e células pluripotentes induzidas (hiPSCs), geradas pela reprogramação direta de células^somáticas3. O desenvolvimento de técnicas para diferenciar hPSCs em células-β tem implicações importantes tanto para a pesquisa fundamental quanto para a prática clínica ^1,4. O diabetes mellitus é uma doença crônica que afeta >400 milhões de pessoas em todo o mundo e resulta da incapacidade do organismo de regular a glicemia devido ao mau funcionamento ou perda^{de células β} pancreáticas5. A disponibilidade limitada de células das ilhotas pancreáticas para transplante tem dificultado o desenvolvimento de terapias de substituição celular para o diabetes 2,4,6,7. A capacidade de gerar células secretoras de insulina responsivas à glicose usando hPSCs serve como um modelo celular útil para estudar o desenvolvimento e a função das ilhotas humanas. Ele também pode ser usado para testar potenciais candidatos terapêuticos para o tratamento do diabetes em um ambiente controlado. Além disso, as hPSCs têm o potencial de produzir células das ilhotas pancreáticas geneticamente idênticas ao paciente, reduzindo o risco de rejeição imunológica após o transplante ^2,4,7.

Nos últimos anos, houve avanços significativos no refinamento dos protocolos de cultura e diferenciação de hPSC, resultando em aumento da eficiência e reprodutibilidade do processo de diferenciação no sentido de^{gerar células β} pancreáticas8,9.

O protocolo a seguir descreve os estágios essenciais da diferenciação dirigida das células β pancreáticas. Envolve a regulação de vias de sinalização celular específicas em momentos distintos. Baseia-se no protocolo desenvolvido por Sui L. et ^al.10 (2018) para a geração de hPSCs em células β pancreáticas. O protocolo foi ajustado às atualizações recentes de Sui L. et ^al.11 (2021), já que a pesquisa mais recente enfatiza a importância do uso do tratamento com afidicolina (APH) para aumentar a diferenciação de células β. O protocolo atual inclui a adição de HPA ao meio durante as etapas posteriores do processo. Além disso, modificações foram feitas na composição do meio durante os estágios iniciais de diferenciação em relação ao protocolo inicial. Uma mudança notável é a adição do Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF) no Dia 6 e continuando até o Dia 8. O fator de crescimento de queratinócitos (KGF) é introduzido do 6º ao 8º dia, o que difere ligeiramente do protocolo inicial¹⁰, onde o KGF não foi incluído no meio estágio 4.

O primeiro e essencial passo na geração de células semelhantes a células β é a diferenciação direta das hPSCs em endoderme definitivo (DE), uma camada germinativa primitiva que dá origem ao revestimento epitelial de vários órgãos, incluindo o pâncreas. Após a formação do ED, as células sofrem diferenciação no tubo intestinal primitivo, que é seguido pela especificação do destino posterior do intestino anterior. O intestino anterior posterior então se desenvolve em células progenitoras pancreáticas, que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos celulares do pâncreas, incluindo as células endócrinas e exócrinas. A etapa subsequente do processo envolve progenitores endócrinos pancreáticos dando origem às células secretoras de hormônios encontradas nas ilhotas de Langerhans. Ao final, o processo de diferenciação atinge seu estágio final produzindo células pancreáticas β tipo células pancreáticas totalmente ^{funcionais9,10}. É importante ressaltar que esse processo é complexo e muitas vezes requer otimização das condições de cultura, como fatores específicos de crescimento e componentes da matriz extracelular, para melhorar a eficiência e a especificidade da^{diferenciação9,10}. Além disso, a geração de células funcionais semelhantes a células β a partir de hPSCs in vitro ainda é um grande desafio. A pesquisa em andamento concentra-se em melhorar os protocolos de diferenciação e melhorar a maturação e a função das células-β^resultantes9.

Neste protocolo, o uso de dissociação celular suave durante a cultura e passagem de hPSCs é essencial para manter a viabilidade e pluripotência celular, melhorando significativamente a eficiência da diferenciação em células-β pancreáticas. Além disso, cada meio específico de estágio foi meticulosamente otimizado seguindo o protocolo desenvolvido por Sui L. et ^al.10 para promover um alto rendimento de células secretoras de insulina em grupos que se assemelham muito à ilhota humana.

Antes de iniciar a diferenciação, recomenda-se determinar o número necessário de organoides semelhantes a ilhotas para fins experimentais. Em uma placa de 6 poços, um único poço com mais de 80% de confluência normalmente consiste de 2-2,3 milhões de hPSCs. Enquanto uma previsão precisa é desafiadora devido a variações nas linhas de hPSC e eficiência de diferenciação, uma estimativa aproximada é 1,5 vezes o número de poços iniciais. Uma diferenciação efetivamente dirigida geralmente produz 1,6 a 2 milhões de células por poço em placas de seis poços, abrangendo todas as células dentro dos aglomerados em vez de exclusivamente células produtoras de insulina. Para um aglomerado de 50 μm, pode ser aproximado para conter cerca de 10.000 células. A Tabela 1 fornece um resumo da composição do meio utilizado para cada dia/estágio de diferenciação dirigida sobre a matriz e o meio de células-tronco, juntamente com o tampão de secreção de insulina estimulada por glicose.

1. Passagem de células-tronco pluripotentes humanas prévia diferenciação em placas de 6 poços

NOTA: A passagem apropriada de células-tronco humanas antes da diferenciação em células semelhantes a células β é um passo crucial para estabelecer o processo experimental. A diluição incorreta da passagem ou o número de células de fixação podem comprometer a eficiência e a fidelidade da diferenciação.

1. Preparar meio de cultura de células-tronco, revestimento e soluções de dissociação (conforme especificado na Tabela 1).
2. 1-2 h antes da passagem, revestir uma placa de seis poços com solução de revestimento a frio (1 mL por poço) e incubar a 37 °C, 5% CO₂.
3. Aquecer uma alíquota de meio de cultura de células estaminais à temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 minutos.
4. Aspirar o meio de células-tronco e adicionar 1 mL de D-PBS sem cálcio/magnésio.
5. Repita a etapa 1.4. duas vezes.
   NOTA: D-PBS é adicionado para lavar as células e remover o meio anterior e compostos. É importante ressaltar que não é necessário um prazo específico para as etapas de lavagem, pois a exposição ao D-PBS não prejudica as hPSCs, evitando a ruptura ou retração celular causada por osmose.
6. Aspirar D-PBS, adicionar 500 μL de solução de dissociação para cada poço e deixá-lo descansar por 2-5 min à temperatura ambiente (15 - 25 °C).
7. Enquanto as células estão se dissociando, aspirar a solução de revestimento da nova placa de 6 poços e adicionar 1-2 mL de D-PBS livre de cálcio/magnésio a cada poço.
8. Verifique regularmente o processo de dissociação sob o microscópio invertido.
9. Aspirar a solução de dissociação quando 80 - 90% das células tiverem arredondado, mas ainda estiverem aderentes.
10. Adicionar 1 mL do meio de células-tronco contendo 10 μM de inibidor de ROCK.
11. Coletar as células dissociadas em um tubo cônico de 15 mL usando pontas de pipeta filtrada estéreis de 1.000 μL e uma pipeta P1000.
12. Triturar lentamente a suspensão celular para cima e para baixo na pipeta com uma pipeta estéril de 1.000 μL de ponta filtrada para quebrar as colônias, mas não exceda 10 vezes.
13. Adicionar 1 ml do meio de células estaminais contendo inibidor de ROCK para ajudar a separar as hPSC restantes e transferir a suspensão celular para o mesmo tubo cónico de 15 ml (1,10).
14. Aspirar o D-PBS da placa recém-revestida e adicionar imediatamente a suspensão celular do tubo cônico de 15 mL. Para garantir o crescimento celular ideal, semeie uma faixa de 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ células viáveis por poço ao usar uma placa de 6 poços (1 em 10 a 1 em 50 splits).
    NOTA: Para o cálculo do volume, cada poço de uma placa de 6 poços deve conter 2 mL de meio de células-tronco com inibidor de ROCK.
15. Mova a placa rapidamente para frente e para trás, e de um lado para o outro 5 a 10 vezes.
16. Colocar a placa a 37 °C, 5% CO₂ incubadora por 24 h.
17. Substitua por meio de células-tronco frescas sem inibidor de ROCK no dia seguinte e, em seguida, a cada 2 dias até que a confluência de hPSCs tenha atingido 80 - 95%.

2. Diferenciação dirigida de células β derivadas de células-tronco humanas

NOTA: As hPSCs podem ser usadas para o processo de diferenciação direta em células β pancreáticas quando 80-95% de confluência é alcançada.

1. Dia -1: Passagem das células Dia -1 de diferenciação:
   1. 1-2 h antes da passagem, revestir uma placa de 6 poços com solução de revestimento a frio em uma incubadora de 37 °C, 5% CO₂ por 1 h.
   2. Siga as etapas 1.1 a 1.10 e prossiga para a contagem de células.
   3. Carregue 10 μL da mistura celular, adicione um volume igual de Azul de Trypan e misture suavemente.
   4. Calcule a concentração celular. Use 0,8 × 10⁶ células/mL - 1,0 x 10⁶ células/mL de meio de células-tronco contendo 10 μM inibidor de ROCK para plaquear a placa revestida de 6 poços com 2 mL de meio por poço.
   5. Mova a placa rapidamente para frente e para trás, de um lado para o outro três vezes.
   6. Coloque a placa numa incubadora a 37 °C, 5% CO₂ . Mova rapidamente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro novamente 10 vezes. Em seguida, incube a placa por 4 h.
      NOTA: Certifique-se de que a fixação máxima e a distribuição uniforme das células não perturbem as células, movendo a placa uma vez colocada na incubadora. Abra e feche a incubadora com muito cuidado.
   7. Coloque o frasco de meio basal durante os dias 0 a 4 °C para descongelá-lo durante a noite.
2. Dia 0
   NOTA: As hPSCs devem ser 80 - 95% confluentes, não iniciam o processo de diferenciação para endoderme definitivo sob essa confluência.
   1. No gelo, descongelar o meio basal durante os dias 0 a 4 e suplementos (ver Tabela de Materiais).
   2. Preparar em dois tubos cônicos apenas o volume necessário a ser usado no Dia 1 (2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e, em um tubo separado, dobrar o volume para o Dia 2,5 a 4 (2 x 2 mL por poço de uma placa de 6 poços). Conservar o dia 2,5 a dia 4 médio a 4 °C.
   3. Aqueça uma alíquota do volume necessário do meio Dia 1 e lave meio 1 em banho-maria a 37 °C por 5 min.
   4. Aspirar o meio de células-tronco e adicionar 2 mL de meio de lavagem 1.
      OBS: O meio de lavagem utilizado no protocolo consiste no meio basal específico para cada dia/estágio, suplementado com antibiótico a 1%. As etapas de lavagem do protocolo de diferenciação direta envolvem apenas a adição do meio de lavagem designado (referido como "meio de lavagem 1 ou 2", Tabela de Materiais) e posterior aspiração, seguindo o procedimento descrito 2.2.4. É importante mencionar que não há um prazo específico indicado para essas etapas de lavagem.
   5. Aspirar o meio de lavagem 1 e adicionar imediatamente 2 mL do meio Dia 1 ao lado do poço.
   6. Incubar as células a 37 °C e 5% CO₂ durante 24 horas.
3. Dia 1
   1. Pré-aqueça uma alíquota do volume necessário de Dias 2,5 a 4 em meio em banho-maria a 37 °C por 5 min.
   2. Aspirar o meio Dia 1 e adicionar imediatamente 2 mL do meio Dia 2,5 a 4 ao lado do poço. Não lave as celas.
   3. Colocar a placa novamente a 37 °C e 5% CO₂ durante 36 h.
4. Dias 2.5 a 4
   1. Pré-aqueça uma alíquota do volume restante do Dia 2,5 a 4 em média em banho-maria a 37 °C por 5 min.
   2. Aspirar o meio e adicionar imediatamente 2 mL de Dias 2,5 a 4 médios recém-preparados ao lado do poço.
   3. Colocar a placa novamente a 37 °C e 5% CO₂ durante 36 h.
5. Dia 4
   NOTA: Nesta fase, a expressão dos marcadores definitivos da endoderme está em seu máximo, e as células podem iniciar a diferenciação primitiva do tubo intestinal.
   1. Preparar uma alíquota do volume necessário do meio de estágio intestinal primitivo do Dia 4 (2 mL por poço de uma placa de seis poços) e aquecê-lo à temperatura ambiente (15 °C -25 °C) por 20 min.
   2. Aspirar Dias 2,5 a 4 meio e adicionar 2 mL de meio de lavagem 1.
   3. Aspirar o meio de lavagem 1 e adicionar imediatamente 2 mL do estágio intestinal primitivo do Dia 4 ao lado do poço.
   4. Colocar a placa novamente a 37 °C e 5% CO₂ durante 48 h.
6. Dias 6 a 8
   NOTA: Nesta fase, as células iniciam uma diferenciação adicional para o destino posterior do intestino anterior.
   1. Preparar o volume necessário dos Dias 6 a 8 do meio do intestino anterior posterior (2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e aquecer o meio à temperatura ambiente (15 °C -25 °C) por 20 min.
   2. Aspirar o meio do Dia 4 e adicionar imediatamente 2 mL do meio do intestino anterior posterior dos Dias 6 a 8 ao lado do poço.
   3. Colocar a placa na estufa a 37 °C contendo 5% de CO₂ durante 48 horas.
7. Dias 8 a 12
   NOTA: As células estão prontas para serem submetidas à diferenciação dos progenitores pancreáticos.
   1. Preparar o volume necessário dos dias 8 a 12 do meio estágio de progenitores pancreáticos (2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e aquecer o meio à temperatura ambiente (15 °C -25 °C) por 20 min.
   2. Aspirar os dias 6 a 8 médio e adicionar imediatamente 2 mL dos dias 6 a 8 do intestino anterior posterior ao lado do poço.
   3. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C contendo 5% de CO₂ durante 48 horas.
8. Dia 12: Executando a etapa de clustering
   NOTA: Nesta fase, as células formam uma monocamada densa e serão transferidas para a cultura de células 3D para formar clusters. Essa etapa é crucial para a diferenciação, a fim de aumentar a semelhança estrutural de células semelhantes a β com ilhotas humanas nativas, mas também melhorar sua semelhança funcional em nível celular e de aglomerados¹¹ (Figura 1).
   1. Tratar uma placa de 6 poços contendo micropoços de 400 μm (conforme especificado na Tabela de materiais: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, Dia 12) com 2 mL de solução de enxágue antiaderente à temperatura ambiente (15 °C - 25 °C).
      NOTA: O micropoço impede que as células se fixem ao fundo do poço e facilita a formação mecânica de clusters 3D.
   2. Placa centrífuga a 1.300 x g por 5 min.
   3. Verifique a presença de bolhas sob um microscópio invertido. Se não forem observadas bolhas, aspirar a solução de enxágue antiaderente e adicionar imediatamente 2 mL de meio de lavagem 2 (Tabela de materiais).
   4. Repita a etapa 1.8.3. duas vezes.
   5. Preparar o volume necessário do meio de agrupamento e aquecê-lo à temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 minutos. Certifique-se de que dois poços de uma placa de 6 poços entrem em um poço da placa de 6 poços de micropoços de 400 μm com 4 mL do meio de agrupamento.
   6. Aspirar meio progenitor pancreático e adicionar tampão de dissociação (0,5 mL por poço).
   7. Incubar à temperatura ambiente (15 °C - 25 °C) durante 2-5 min. Verifique regularmente o processo de dissociação em um microscópio invertido e aspirar tampão de dissociação quando a maioria das células tiver arredondado, mas ainda estiver aderente.
   8. Aspirar o tampão de dissociação e adicionar imediatamente 1 mL de meio de agrupamento a cada poço.
   9. Dissociar as células pipetando suavemente para cima e para baixo seis vezes usando uma pipeta P1000 e pontas de filtro de 1.000 μL.
   10. Transfira as células e a mistura do meio de agrupamento para um tubo cônico de 50 mL.
   11. Adicionar 1 mL do meio de agrupamento para coletar todas as células restantes.
   12. Adicione o meio de agrupamento ao volume total necessário para que cada poço da placa de micropoços tenha 4 mL de meio de aglomerado/células de mistura.
   13. Aspirar o meio de lavagem 2 da placa de micropoços de 6 poços e transferir a suspensão celular. Incubar a placa a 37 °C durante 24 horas.
9. Dia 13: Manipulação das células pós-agrupamento e mudança de mídia a partir do Dia 13.
   NOTA: Os clusters são altamente sensíveis e requerem um tratamento cuidadoso para garantir a sua integridade e viabilidade nos dias seguintes. Portanto, é crucial monitorar de perto os agrupamentos durante o período pós-aglomeração após o Dia 12. Avaliações e ajustes regulares são essenciais para promover resultados bem-sucedidos no processo experimental.
   1. Preparar o volume necessário do meio Dias 13 (2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e em um tubo cônico separado de 50 mL para o meio progenitor endócrino pancreático Dia 15 a 20.
   2. Coletar lentamente os cachos da placa de 6 poços dos micropoços em um tubo cônico de 50 mL usando uma pipeta p1000 e pontas filtradas de 1.000 μL.
   3. Adicionar 1 mL do meio Dia 13 para coletar os cachos restantes e transferir os cachos para o tubo.
   4. Deixe as células fixadas naturalmente sob gravidade para o fundo do tubo cônico por 5 min.
   5. Aspirar o máximo de sobrenadante possível do tubo sem perturbar os aglomerados celulares. As pontas da pipeta não devem tocar nem aspirar os cachos, mas apenas o sobrenadante.
   6. Adicione o volume necessário do meio Dia 13 de acordo com o seguinte: 1 poço de micropoços 6 placa de poço vai em três poços de uma placa de 6 poços de baixa fixação (2 mL de meio por poço).
   7. Pipetar suavemente para cima e para baixo, evitando aglomerados aspiradores.
   8. Transfira a suspensão para uma placa de 6 poços de baixa aderência.
   9. Mova a placa rapidamente para frente e para trás, de um lado para o outro seis vezes.
   10. Incubar a placa a 37 °C durante 48 horas.
   11. Efectuar as alterações do meio em todos os passos seguintes até ao final da diferenciação, conforme descrito nesta secção 2.9.
10. Dias 15 a 20
    1. Mudar para o estágio de progenitor endócrino pancreático a cada 48 h até o dia 21 de diferenciação, coletando a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e seguindo os passos 2.9.4 a 2.9.10 para o Dia 13.
11. Dias 21 a 27
    NOTA: Nesta fase, os agrupamentos diferenciam-se em células β pancreáticas.
    1. Preparar o meio pancreático de estágio de β células.
    2. Troque o meio a cada dois dias, conforme descrito nos dias 15 a 21.
       NOTA: Após o dia 25, os organoides semelhantes a ilhotas podem passar por análises para confirmar que estão totalmente funcionais.

3. Coloração de aglomerados pancreáticos de células β

NOTA: Execute esta etapa para estudar a avaliação funcional de clusters pós-diferenciação

1. Coletar de cinco a dez cachos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ao final da diferenciação.
2. Fixar os aglomerados celulares com 200 μL de PFA a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Adicione 1 mL de PBS aos clusters e remova o PBS com uma ponta de pipeta de 1.000 μL sem perturbar os clusters.
4. Adicionar 200 μL de sacarose a 30% aos cachos e incubar durante a noite a 4 °C.
5. Transfira os cachos para um criomold, remova a sacarose extra, adicione uma gota de meio O.C.T. e misture os cachos com o meio O.C.T.
6. Congelar o criomold em gelo seco e armazenar a -80 °C.
7. Cortar cortes de 5 μm do bloco congelado em lâminas de microscópio usando micrótomo/criostato.
8. Conservar as lâminas ao congelador a -80 °C até manchar.
9. No dia da coloração, retire as lâminas do congelador a -80 °C.
10. Remova cuidadosamente o gelo ao redor das seções do criomold.
11. Agrupamentos de células circulares em lâminas com uma caneta hidrofóbica.
12. Hidrate as lâminas em um frasco de coloração de lâmina contendo PBS por 15 min.
13. Adicione metanol frio ao frasco de coloração da lâmina e coloque o frasco com lâminas a -20 °C por 10 min.
14. Mergulhe os slides em um frasco PBS.
15. Repita a etapa 3.14 três vezes.
    Observação : use esse método para todas as etapas de lavagem a seguir.
16. Retire o PBS das lâminas e cubra imediatamente com 100 μL de solução de bloqueio com BSA a 2-5% em PBS-T.
17. Adicione solução de bloqueio a cada lâmina e cubra com filme de parafina.
18. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente (15 -25 °C).
19. Diluir os anticorpos primários na solução de bloqueio utilizando as proporções fornecidas na secção Reagentes e Soluções.
20. Remova a solução de bloqueio das lâminas.
21. Adicione imediatamente anticorpos diluídos e cubra as lâminas com parafilme para evitar que a lâmina seque.
22. Incubar durante a noite a 4 °C.
23. No dia seguinte, lave as lâminas de 3 a 5 vezes com PBS-T.
24. Preparar anticorpos secundários diluídos e coloração de DNA.
25. Remova o excesso de PBS-T dos slides.
26. Adicionar anticorpos secundários diluídos e coloração de DNA. Incubar durante 45 minutos à temperatura ambiente (15 -25 °C).
27. Lave as lâminas 3 a 5 vezes com PBS-T.
28. Retire qualquer líquido das lâminas.
29. Adicione uma gota de meio de montagem histológica a cada seção.
30. Cubra a lâmina com uma tampa de vidro.
31. Tire fotos de lâminas manchadas usando um microscópio fluorescente.

4. GSIS (ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose)

1. Prepare três soluções diferentes: solução KREBS de baixa glicose, solução de KREBS de alta glicose e solução de KREBS de baixa glicose com KCl.
2. Aqueça todas as soluções a 37 °C em banho-maria.
3. Selecione cuidadosamente cerca de 10 a 15 cachos de tamanho semelhante usando uma ponta de pipeta de 1000 μL e transfira-os para um tubo de 1,5 mL juntamente com uma pequena quantidade de meio diferenciado para evitar o ressecamento dos cachos.
   NOTA: Os aglomerados devem ser visíveis a olho nu, mas caso contrário, coloque a placa contendo aglomerados diferenciados sob um microscópio invertido para selecionar os aglomerados e transferi-los para um tubo de 1,5 mL.
4. Coloque o tubo com cachos e meio em um rack de tubo e espere que os cachos afundem no fundo do tubo.
5. Aspirar lentamente o sobrenadante usando uma pipeta de 200 μL e adicionar 200 μL de solução de KREBS com baixo teor de glicose.
6. Incubar as ilhotas na solução de glicose baixa durante 1 h a 37 °C.
   NOTA: Para garantir a avaliação precisa do número de clusters e da consistência nos experimentos, é aconselhável verificar a presença de todos os clusters na solução durante a transferência, pois eles tendem a aderir ao tubo.
7. Retire o tubo da incubadora e aspirar lentamente 200 μL de solução de KREBS sem aspirar aglomerados.
8. Adicionar 200 μL de solução de KREBS com baixo teor de glicose e incubar durante 30 minutos a 37 °C.
9. Aspirar o volume de 200 μL de solução KREBS com baixo teor de glicose para um tubo de 500 μL e armazená-lo imediatamente a -80 °C para medições de insulina. Repita para tratamentos separados.
10. Para lavar os cachos, adicionar 200 μL de solução de KREBS sem glicose ao tubo que contém os cachos. Deixe os cachos se acomodarem no fundo do tubo e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os aglomerados.
11. Adicionar 200 μL de solução de KREBS com alto teor de glicose e incubar durante 30 minutos a 37 °C.
12. Aspirar 200 μL de KREBS com alto teor de glicose em um tubo de 500 μL e armazená-lo imediatamente a -80 °C para dosagem de insulina. Repita para tratamentos separados.
13. Para lavar os cachos, adicionar 200 μL de solução de KREBS sem glicose ao tubo que contém os cachos. Deixe os cachos se acomodarem no fundo do tubo e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os aglomerados.
14. Adicionar 200 μL de solução de KCl KREBS e repetir para tratamentos separados.
15. Incubar durante 30 min a 37 °C.
16. Aspirar 200 μL da solução KCl KREBS para um tubo de 500 μL e armazená-la imediatamente a -80 °C para medições de insulina. Repita para outros tratamentos.
17. Adicionar 50 μL de água ultrapura e proceder à medição do teor total de insulina.
18. Adicionar 150 μL de solução ácida de etanol ao tubo com ilhotas e água ultrapura.
19. Armazenar amostras a 4 °C durante a noite (12 - 15 h).
20. No dia seguinte, vórtice cada amostra.
21. Execute a sonicação com um sonicador elétrico ajustado para 20% de potência por 1 s para garantir a lise completa do tecido da ilhota.
    Observação : repita a etapa 4.21 até que não haja clusters restantes visíveis.
22. Centrifugar todas as amostras a 10.000 × g por 10 min e manter o sobrenadante.
23. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro de nanogotas, que pode então ser usado para normalizar as medições de insulina.

O protocolo descrito neste trabalho oferece uma abordagem altamente eficiente para diferenciar células β do tipo^{hPSCs 10}. Esse processo utiliza um sistema de cultura 2D que é facilmente escalável, possibilitando seu uso em diversos cenários experimentais, como diferenciação de aprendizagem, projetos e laboratórios menores e testes-piloto para avaliar o potencial de diferenciação de uma linha iPSC.

É essencial caracterizar as propriedades funcionais de células β diferenciadas em ilhotas para obter informações sobre a homeostase da glicose. Isso é tipicamente obtido por meio de vários experimentos, como imunomarcação para marcadores de células β e expressão de insulina, bem como ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), que testam a função das ilhotas em resposta a baixas e altas concentrações de glicose^12,13. As células-β possuem genes de assinatura, incluindo Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 e Neurod1, que são críticos para estabelecer e manter a identidade β-célula⁹. Técnicas de imunomarcação são valiosas para investigar a expressão e localização de proteínas dentro de cortes teciduais. A imunomarcação para marcadores de células β pode avaliar os níveis de expressão dos principais marcadores de linhagem pancreática, fornecendo informações sobre a fidelidade e otimização do processo de diferenciação para aplicações específicas ^9,12.

Neste estudo, a linha de repórteres Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC foi usada para diferenciar clusters compreendendo diferentes tipos celulares, incluindo células β semelhantes àquelas encontradas em ilhotas nativas humanas. A Figura 2 deste trabalho apresenta achados significativos quanto à eficiência e acurácia do processo de diferenciação. Os resultados demonstram um alto enriquecimento de células que expressam insulina dentro da linhagem pancreática, e essas células exibem secreção de insulina estimulada por glicose. Isso indica a geração bem-sucedida de células funcionais do tipo β através do processo de diferenciação.

As células diferenciadas foram estimuladas com baixas e altas concentrações de glicose, e os resultados do GSIS mostraram que os aglomerados derivados das células Mel1 funcionaram de forma semelhante às ilhotas em sua resposta de secreção de insulina à glicose. Os clusters derivados de Mel1 foram encontrados para secretar 100 vezes mais insulina em resposta a altas concentrações de glicose em comparação com baixas concentrações de glicose. Especificamente, o conteúdo de insulina foi de 0,003 ± 0,002% a 3,3 mM de glicose baixa e de 0,236 ± 0,197% a 16,7 mM de glicose alta.

Os clusters derivados das hESCs Mel1 INS-GFP foram submetidos a análises adicionais para determinar sua composição e funcionalidade, além do ensaio GSIS. Especificamente, a expressão de genes de assinatura de células β e a presença de diferentes tipos celulares dentro dos clusters foram investigadas. Os resultados mostraram que a linhagem pancreática obtida a partir desse processo é altamente enriquecida em células insulino-positivas, indicando um alto nível de sucesso no processo de diferenciação das hESCs em células β-like. Além disso, a expressão de genes de assinatura, como Nkx6.1 e Pdx1, importantes para o estabelecimento e manutenção de identidades de células β, foi examinada. A análise revelou que aproximadamente 25% e 40% das células expressaram Nkx6.1 e Pdx1, respectivamente, fornecendo evidências adicionais de que os clusters continham células diferenciadas semelhantes a β (média de células Nkx6.1+ por cluster 24,9% ± 6,2%, n=9 clusters, células Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, MEV, Figura 2). Além disso, os clusters continham outros tipos celulares, como células positivas para glucagon, que representavam cerca de 15% da população celular total. Essas células são tipicamente encontradas em células alfa de ilhotas nativas de Langerhans, sugerindo que os aglomerados se assemelham muito às ilhotas humanas em termos de composição celular.

Figura 1: Diferenciação das hPSCs em relação às células β pancreáticas. (A) Representação esquemática da diferenciação dirigida in vitro de hPSCs em células-β pancreáticas, que envolve seis estágios sucessivos: indução definitiva da endoderme, formação primitiva do tubo intestinal, especificação do destino posterior do intestino anterior, geração de progenitores pancreáticos, formação de progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, diferenciação de células β pancreáticas. A diferenciação pancreática de células β utiliza etapas-chave do desenvolvimento das ilhotas humanas, com a regulação de vias de sinalização celular específicas em momentos específicos. B27: Suplemento B-27; Ri: inibidor de proteína quinase associado ao rho ou inibidor de ROCK; T3: hormônio tireoidiano; KGF: proteína humana KGF / FGF-7; RepSox: inibidor da via Activina/Nodal/TGF-β; Inibe a ALK5; AR: Ácido retinóico; ZS: sulfato de zinco; HNF: heparina não fracionada; XX: inibidor da gama-secretase XX; APH: afidicolina; EGF: fator de crescimento epidérmico; LDN: Inibidor de BMP III, LDN-212854; Ciclo: Ciclopamina- KAAD. (B) Imagens da morfologia celular captadas em vários estágios de diferenciação de células-tronco pluripotentes para células-β pancreáticas. A primeira imagem mostra células-tronco pluripotentes humanas no primeiro dia de diferenciação (monocamada de HPSCs). (C) No 11º dia, as células encontram-se na fase progenitora pancreática. Barra de escala de 100 μm. (D) No dia 12, formam-se aglomerados nos micropoços da placa de 6 poços após a dissociação das células na fase progenitora pancreática. (E) No dia 13, os cachos estão em uma placa de 6 poços de baixa fixação. Barra de escala de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Clusters obtidos a partir de relatórios diferenciados Mel1 InsGFP/w hESC linha¹⁴ foram avaliados para a presença de células produtoras de insulina expressando marcadores de maturidade de células β. (A) Imagens de imunofluorescência dos aglomerados foram capturadas de cortes criomold (5 μm) usando microscopia confocal de disco giratório, que revelou a predominância de células produtoras de insulina (aproximadamente 60%) em relação às células produtoras de glucagon (aproximadamente 15%) (n=9 clusters, aproximadamente 18.000 células, MEV). (B) Imagens de imunofluorescência dos aglomerados foram obtidas a partir de cortes criômold (5 μm) usando microscopia confocal de disco giratório, que mostrou o predomínio de células produtoras de insulina co-expressando os marcadores pancreáticos de células β Nkx6.1 (n=9 clusters, aproximadamente 18.000 células). (C) O contador de células ImageJ macro, projetado especificamente para a imunomarcação de marcadores, foi empregado para determinar a porcentagem de células positivas para insulina, glucagon e células β positivas para células Nkx6.1 e células positivas para marcadores de células β Pdx1. (D) Avaliou-se a secreção de insulina estimulada por glicose dos clusters derivados de Mel1 InsGFP/w hESC, que exibiu um aumento de 100 vezes em resposta à estimulação de glicose elevada (glicose 16,7mM) nos clusters diferenciados (n=9, EPM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Resumo da composição da mídia para diferenciação direcionada. Esta tabela fornece um resumo da composição do meio usado para cada dia/estágio de diferenciação dirigida sobre a matriz e o meio de células-tronco, juntamente com o tampão de secreção de insulina estimulado por glicose. Clique aqui para baixar esta tabela.

O sucesso da diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas depende da otimização de todos os aspectos da cultura de rotina e da passagem das hPSCs selecionadas. Isso inclui garantir que a linhagem celular tenha cariótipo normal, seja negativa para infecção por micoplasma e esteja livre de genomas de plasmídeos ou vetores virais. Além disso, ao usar hiPSCs, é importante evitar o uso da passagem mais antiga, que ainda está passando por reprogramação, para experimentos piloto. Esses experimentos devem ser conduzidos em pequena escala para identificar a linha hPSC com melhor potencial de diferenciação e o número ótimo de passagens.

Outros parâmetros que podem influenciar a eficiência da diferenciação incluem a qualidade do meio de células-tronco utilizado, a densidade de revestimento e o número de passagens ^10,12. Esse protocolo foi otimizado para maximizar a eficiência da diferenciação, garantindo que todos os parâmetros relevantes sejam otimizados¹⁰.

Meios de diferenciação com formulações específicas são usados em cada estágio para apoiar a diferenciação de hPSCs em células-β. A activina A e um agonista Wnt são usados no meio de diferenciação para iniciar a transição para as células definitivas da endoderme. Durante a fase primitiva do tubo intestinal, o KGF é adicionado ao meio para promover maior diferenciação em células β¹⁵, e essa inclusão de KGF é mantida do 6º ao 8º dia, diferindo do protocolo original de Sui, Egli, et ^al.10. Durante a fase de progenitor pancreático, a composição específica do meio é otimizada para aumentar a expressão do fator de transcrição Pdx1. Isso é obtido com o uso de uma alta concentração de ácido retinóico (AR), KGF e LDN193189, que inibe a via da proteína morfogenética óssea (BMP)⁸. À medida que a diferenciação progride para o estágio endócrino, o meio de cultura é modificado para regular negativamente a sinalização de Notch. Isso é conseguido incorporando-se XXI, um inibidor da γ-secretase, juntamente com T3 (hormônio tireoidiano), AR e RepSox, um inibidor da via Activin/BMP/TGF-β⁸. Esta combinação específica de compostos é usada para promover a diferenciação de progenitores pancreáticos em progenitores endócrinos. Finalmente, para otimizar o processo de diferenciação direta, a afidicolina (APH) é introduzida durante a diferenciação de progenitores pancreáticos em progenitores endócrinos. Essa adição de HAP visa aumentar ainda mais a diferenciação β-célula, e representa uma modificação distinta do protocolo inicial proposto por Sui, Egli, et ^al.10,11.

Durante o processo de diferenciação, é crucial monitorar a densidade celular e evitar a sobreconfluência, pois isso pode dificultar a diferenciação adequada. Culturas de alta densidade podem manter alta expressão de Oct4, inibindo a diferenciação para endoderme definitivo. A remoção do inibidor de ROCK durante a primeira etapa de lavagem é essencial para iniciar a diferenciação e permitir que o estado pluripotente das hPSCs seja alterado. O uso de um marcador de fluorescência, como o Mel1 INS-GFP com GFP integrado ao locus da insulina, facilita a avaliação do progresso da diferenciação nos estágios progenitor pancreático e β-célula, auxiliando experimentos a jusante¹⁴.

O protocolo atual de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em células pancreáticas β semelhantes tem demonstrado variabilidade na eficiência entre diferentes linhagens de hPSC¹⁰. Além disso, as células semelhantes a β resultantes exibem imaturidade funcional em comparação com ilhotas pancreáticas humanas, mostrando menor secreção de insulina por célula. Para resolver melhor essa limitação, a maturação in vivo de células semelhantes à β pode ser alcançada pelo transplante de organoides das ilhotas em modelos animais durante os estágios finais de diferenciação ^6,7.

Apesar dessas limitações, a diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas tem potencial significativo em relação aos métodos existentes ^8,9,10. Esta técnica permite produzir um grande número de células semelhantes a células β que respondem à glicose e expressam marcadores de células β (Pdx1 e Nkx6.1, ver Figura 2). Isso é feito sem as limitações éticas, técnicas e de origem associadas ao uso de ilhotas pancreáticas humanas. Além disso, essa técnica tem potencial para ser aplicada à medicina personalizada, uma vez que células β específicas do paciente podem ser geradas para testes de drogas e modelagem de^{doenças4,6,7}. A técnica também pode ter aplicações futuras no tratamento do diabetes que envolva a perda ou disfunção^{das células β} pancreáticas4,6,7.

Ines Cherkaoui foi apoiada por uma bolsa de estudos da Diabetes UK (BDA 18/0005934) para a GAR, que também agradece ao Wellcome Trust for an Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC por uma bolsa do Programa (MR/R022259/1), Diabetes UK for Project grant (BDA16/0005485), CRCHUM para fundos de start-up, Innovation Canada por um John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) para uma subvenção de projeto, e CIHR, JDRF para uma concessão de equipe (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion e Dr. Harry Leitch por sua ajuda com a geração e cultura de hiPSCs humanos, a instalação de organoides do NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londres.