Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, rendendole un'eccellente fonte alternativa di cellule β pancreatiche umane. Le hPSC possono essere cellule staminali embrionali (hESC) derivate dalla blastocisti o cellule pluripotenti indotte (hiPSC) generate direttamente da cellule somatiche utilizzando un processo di riprogrammazione. Qui viene presentato un protocollo basato su video per delineare le condizioni ottimali di coltura e passaggio per le hPSC, prima della loro differenziazione e della successiva generazione di cellule pancreatiche produttrici di insulina. Questa metodologia segue il processo in sei fasi per la differenziazione diretta a β cellule, in cui le hPSC si differenziano in endoderma definitivo (DE), tubo intestinale primitivo, destino dell'intestino anteriore posteriore, progenitori pancreatici, progenitori endocrini pancreatici e, infine, cellule β pancreatiche. È interessante notare che questa metodologia di differenziazione impiega un periodo di 27 giorni per generare cellule β pancreatiche umane. Il potenziale della secrezione di insulina è stato valutato attraverso due esperimenti, che includevano l'immunocolorazione e la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) hanno la capacità unica di differenziarsi in vari tipi di cellule, il che le rende una valida alternativa alle cellule β pancreatiche umane¹. Queste hPSC sono classificate in due tipi: cellule staminali embrionali (hESCs), derivate dalla blastocisti², e cellule pluripotenti indotte (hiPSCs), generate dalla riprogrammazione diretta delle cellule somatiche³. Lo sviluppo di tecniche per differenziare le hPSC in cellule β ha importanti implicazioni sia per la ricerca di base che per la pratica clinica ^1,4. Il diabete mellito è una malattia cronica che colpisce >400 milioni di persone in tutto il mondo e deriva dall'incapacità dell'organismo di regolare la glicemia a causa di un malfunzionamento o della perdita di cellule β pancreatiche⁵. La limitata disponibilità di cellule delle isole pancreatiche per il trapianto ha ostacolato lo sviluppo di terapie di sostituzione cellulare per il diabete 2,4,6,7. La capacità di generare cellule che secernono insulina sensibili al glucosio utilizzando hPSC funge da modello cellulare utile per studiare lo sviluppo e la funzione delle isole umane. Può anche essere utilizzato per testare potenziali candidati terapeutici per il trattamento del diabete in un ambiente controllato. Inoltre, le hPSC hanno il potenziale per produrre cellule delle isole pancreatiche geneticamente identiche al paziente, riducendo il rischio di rigetto immunitario dopo il trapianto ^2,4,7.

Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nel perfezionamento dei protocolli di coltura e differenziazione delle hPSC, con conseguente aumento dell'efficienza e della riproducibilità del processo di differenziazione verso la generazione di cellule β pancreatiche ^8,9.

Il seguente protocollo delinea le fasi essenziali della differenziazione diretta delle cellule β pancreatiche. Implica la regolazione di specifiche vie di segnalazione cellulare in punti temporali distinti. Si basa sul protocollo sviluppato da Sui L. et ^al.10 (2018) per la generazione di hPSC in cellule β pancreatiche. Il protocollo è stato adattato ai recenti aggiornamenti di Sui L. et ^al.11 (2021), poiché le ultime ricerche sottolineano l'importanza dell'utilizzo del trattamento con afidicolina (APH) per migliorare la differenziazione delle cellule β. L'attuale protocollo prevede l'aggiunta di APH al mezzo durante le fasi successive del processo. Inoltre, sono state apportate modifiche alla composizione del terreno durante le prime fasi di differenziazione rispetto al protocollo iniziale. Un cambiamento notevole è l'aggiunta del fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) il giorno 6 e continuando fino al giorno 8. Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) viene introdotto dal giorno 6 al giorno 8, che differisce leggermente dal protocollo iniziale¹⁰, in cui KGF non era incluso nel terreno di stadio 4.

Il primo ed essenziale passo nella generazione di cellule simili a cellule β è la differenziazione diretta delle hPSC nell'endoderma definitivo (DE), uno strato germinale primitivo che dà origine al rivestimento epiteliale di vari organi, incluso il pancreas. Dopo la formazione di DE, le cellule subiscono la differenziazione nel tubo intestinale primitivo, a cui segue la specificazione del destino dell'intestino anteriore posteriore. L'intestino anteriore posteriore si sviluppa quindi in cellule progenitrici pancreatiche, che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule del pancreas, comprese le cellule endocrine ed esocrine. La fase successiva del processo coinvolge i progenitori endocrini pancreatici che danno origine alle cellule che secernono ormoni che si trovano nelle isole di Langerhans. Alla fine, il processo di differenziazione raggiunge la sua fase finale producendo cellule pancreatiche simili a cellule β pancreatiche^{completamente} funzionali ^9,10. È importante notare che questo processo è complesso e spesso richiede l'ottimizzazione delle condizioni di coltura, come fattori di crescita specifici e componenti della matrice extracellulare, per migliorare l'efficienza e la specificità del differenziamento ^9,10. Inoltre, la generazione di cellule β simili a cellule funzionali da hPSC in vitro è ancora una sfida importante. La ricerca in corso si concentra sul miglioramento dei protocolli di differenziamento e sul miglioramento della maturazione e della funzione delle cellule β risultanti⁹.

In questo protocollo, l'uso della dissociazione cellulare delicata durante la coltura e il passaggio delle hPSC è essenziale per mantenere la vitalità e la pluripotenza cellulare, migliorando significativamente l'efficienza del differenziamento in cellule β pancreatiche. Inoltre, ogni terreno specifico per stadio è stato meticolosamente ottimizzato seguendo il protocollo sviluppato da Sui L. et ^al.10 per promuovere un'elevata resa di cellule che secernono insulina in cluster che assomigliano molto all'isolotto umano.

Prima di iniziare la differenziazione, si raccomanda di determinare il numero richiesto di organoidi simili a isole per scopi sperimentali. In una piastra a 6 pozzetti, un singolo pozzetto con una confluenza superiore all'80% è in genere costituito da 2-2,3 milioni di hPSC. Mentre una previsione accurata è difficile a causa delle variazioni nelle linee hPSC e nell'efficienza di differenziazione, una stima approssimativa è 1,5 volte il numero di pozzi iniziali. Una differenziazione diretta in modo efficace di solito produce da 1,6 a 2 milioni di cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti, comprendendo tutte le cellule all'interno dei cluster piuttosto che esclusivamente le cellule produttrici di insulina. Per un cluster di 50 μm, si può approssimare che contenga circa 10.000 cellule. La Tabella 1 fornisce un riepilogo della composizione del terreno utilizzato per ogni giorno/fase di differenziazione diretta sulla matrice e sul terreno di coltura delle cellule staminali, insieme al tampone di secrezione di insulina stimolato dal glucosio.

1. Differenziazione preventiva di cellule staminali pluripotenti umane passate in piastre a 6 pozzetti

NOTA: L'appropriato passaggio di cellule staminali umane prima di differenziarsi in cellule simili a cellule β è un passo cruciale nello stabilire il processo sperimentale. Una diluizione errata del passaggio o un numero di celle di attacco errato possono compromettere l'efficienza e la fedeltà del differenziamento.

1. Preparare il terreno di coltura delle cellule staminali, il rivestimento e le soluzioni di dissociazione (come specificato nella Tabella 1).
2. 1-2 ore prima del passaggio, rivestire una piastra a sei pozzetti con una soluzione di rivestimento a freddo (1 mL per pozzetto) e incubare a 37 °C, 5% CO₂ .
3. Riscaldare un'aliquota di terreno di coltura di cellule staminali a temperatura ambiente (15 -25 °C) per 20 minuti.
4. Aspirare il terreno di coltura staminale e aggiungere 1 mL di D-PBS privo di calcio/magnesio.
5. Ripetere il passaggio 1.4. due volte.
   NOTA: D-PBS viene aggiunto per lavare le cellule e rimuovere il terreno e i composti precedenti. È importante notare che non è richiesto alcun periodo di tempo specifico per le fasi di lavaggio, poiché l'esposizione al D-PBS non danneggia le hPSC, prevenendo la rottura o il restringimento cellulare causato dall'osmosi.
6. Aspirare il D-PBS, aggiungere 500 μL di soluzione di dissociazione per ogni pozzetto e lasciare riposare per 2-5 minuti a temperatura ambiente (15 - 25 °C).
7. Mentre le cellule si dissociano, aspirare la soluzione di rivestimento della nuova piastra a 6 pozzetti e aggiungere 1-2 mL di D-PBS privo di calcio/magnesio a ciascun pozzetto.
8. Controllare regolarmente il processo di dissociazione al microscopio invertito.
9. Aspirare la soluzione di dissociazione quando l'80-90% delle cellule si è arrotondato ma è ancora aderente.
10. Aggiungere 1 mL di terreno per cellule staminali contenente 10 μM di inibitore ROCK.
11. Raccogliere le cellule dissociate in una provetta conica da 15 mL utilizzando puntali per pipette sterili filtrati da 1.000 μL e una pipetta P1000.
12. Triturare lentamente la sospensione cellulare su e giù nella pipetta con un puntale filtrato per pipetta sterile da 1.000 μL per rompere le colonie, ma non superare le 10 volte.
13. Aggiungere 1 mL del terreno di coltura contenente l'inibitore di ROCK per aiutare a staccare le hPSC rimanenti e trasferire la sospensione cellulare nella stessa provetta conica da 15 mL (1.10).
14. Aspirare il D-PBS dalla piastra appena rivestita e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare dalla provetta conica da 15 mL. Per garantire una crescita cellulare ottimale, seminare un intervallo di 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ cellule vitali per pozzetto quando si utilizza una piastra a 6 pozzetti (da 1 su 10 a 1 su 50 spaccate).
    NOTA: Per il calcolo del volume, ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti deve contenere 2 mL di terreno di coltura con cellule staminali con inibitore ROCK.
15. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro 5 - 10 volte.
16. Posizionare la piastra a 37 °C, incubatrice al 5% di CO₂ per 24 ore.
17. Sostituire con terreno di coltura staminale fresco senza inibitore di ROCK il giorno successivo, e poi ogni 2 giorni fino a quando la confluenza delle hPSC non ha raggiunto l'80-95%.

2. Differenziazione diretta delle cellule β derivate da cellule staminali umane

NOTA: Le hPSC possono essere utilizzate per il processo di differenziazione diretta in cellule β pancreatiche quando viene raggiunta una confluenza dell'80-95%.

1. Giorno -1: Passaggio delle cellule Giorno -1 di differenziazione:
   1. 1-2 ore prima del passaggio, rivestire una piastra a 6 pozzetti con una soluzione di rivestimento a freddo in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora.
   2. Seguire i passaggi da 1.1 a 1.10 e procedere al conteggio delle celle.
   3. Caricare 10 μL della miscela cellulare, aggiungere un volume uguale di Trypan Blue e mescolare delicatamente.
   4. Calcola la concentrazione cellulare. Utilizzare 0,8 × 10⁶ cellule/mL - 1,0 x 10⁶ cellule/mL di terreno di coltura contenente 10 μM di inibitore ROCK per placcare la piastra rivestita a 6 pozzetti con 2 mL di terreno per pozzetto.
   5. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all'altro tre volte.
   6. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% di CO₂ . Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro e di nuovo da un lato all'altro 10 volte. Quindi incubare la piastra per 4 ore.
      NOTA: Assicurarsi che l'attacco massimo e la distribuzione uniforme delle cellule non disturbino le cellule spostando la piastra una volta posizionata nell'incubatrice. Aprire e chiudere l'incubatrice con molta attenzione.
   7. Posizionare il flacone di terreno basale per i giorni da 0 a 4 a 4 °C per scongelarlo durante la notte.
2. Giorno 0
   NOTA: Le hPSC devono essere confluenti all'80 - 95%, non iniziare il processo di differenziazione all'endoderma definitivo sotto tale confluenza.
   1. Sul ghiaccio, scongelare sia il terreno basale per i giorni da 0 a 4 che gli integratori (vedere la tabella dei materiali).
   2. Preparare in due provette coniche solo il volume necessario da utilizzare il giorno 1 (2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e, in una provetta separata, raddoppiare il volume per il giorno da 2,5 a 4 (2 x 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti). Conservare il giorno dal giorno 2.5 al giorno 4 medio a 4 °C.
   3. Scaldare un'aliquota del volume necessario del mezzo Giorno 1 e del mezzo di lavaggio 1 a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
   4. Aspirare il terreno di trattamento delle cellule staminali e aggiungere 2 ml di terreno di lavaggio 1.
      NOTA: Il mezzo di lavaggio utilizzato nel protocollo è costituito dal terreno basale specifico per ogni giorno/fase, integrato con antibiotici all'1%. Le fasi di lavaggio del protocollo di differenziazione diretta prevedono solo l'aggiunta del mezzo di lavaggio designato (denominato "mezzo di lavaggio 1 o 2", Tabella dei materiali) e la successiva aspirazione, seguendo la procedura descritta al punto 2.2.4. È importante ricordare che non esiste un periodo di tempo specifico indicato per queste fasi di lavaggio.
   5. Aspirare il terreno di lavaggio 1 e aggiungere immediatamente 2 ml del terreno del giorno 1 a lato del pozzetto.
   6. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Giorno 1
   1. Preriscaldare un'aliquota del volume necessario di Giorni da 2,5 a 4 medio a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
   2. Aspirare il terreno del giorno 1 e aggiungere immediatamente 2 ml del terreno del giorno da 2,5 a 4 a lato del pozzetto. Non lavare le celle.
   3. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ per 36 ore.
4. Giorni da 2.5 a 4
   1. Preriscaldare un'aliquota del volume rimanente del Day 2,5-4 medium a bagnomaria a 37 °C per 5 min.
   2. Aspirare il terreno e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno appena preparato da Days 2.5 a 4 a lato del pozzetto.
   3. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ per 36 ore.
5. Giorno 4
   NOTA: In questa fase, l'espressione dei marcatori endodermici definitivi è al suo massimo e le cellule possono avviare la differenziazione primitiva del tubo intestinale.
   1. Preparare un'aliquota del volume necessario del terreno di trattamento per lo stadio intestinale primitivo del giorno 4 (2 mL per pozzetto di una piastra a sei pozzetti) e riscaldarlo a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 min.
   2. Aspirare i giorni da 2,5 a 4 medium e aggiungere 2 mL di medium 1.
   3. Aspirare il mezzo di lavaggio 1 e aggiungere immediatamente 2 ml di stadio intestinale primitivo del giorno 4 sul lato del pozzetto.
   4. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ per 48 ore.
6. Giorni da 6 a 8
   NOTA: In questa fase, le cellule iniziano un'ulteriore differenziazione sul destino dell'intestino anteriore posteriore.
   1. Preparare il volume necessario di terreno di s. intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 (2 mL per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e riscaldare il terreno a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 minuti.
   2. Aspirare il terreno del giorno 4 e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno dell'intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 a lato del pozzetto.
   3. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C contenente il 5% di CO₂ per 48 ore.
7. Giorni da 8 a 12
   NOTA: Le cellule sono pronte per essere differenziate dai progenitori pancreatici.
   1. Preparare il volume necessario di terreno di stoccaggio dei progenitori pancreatici da 8 a 12 giorni (2 mL per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e riscaldare il terreno a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 minuti.
   2. Aspirare il terreno da 6 a 8 giorni e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno dell'intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 a lato del pozzetto.
   3. Porre la piastra in un'incubatrice a 37 °C contenente il 5% di CO₂ per 48 ore.
8. Giorno 12: Esecuzione del passaggio di clustering
   NOTA: In questa fase, le cellule formano un monostrato denso e verranno trasferite alla coltura cellulare 3D per formare cluster. Questo passaggio è cruciale per la differenziazione per migliorare la somiglianza strutturale delle cellule simili a β con le isole umane native, ma migliora anche la loro somiglianza funzionale sia a livello cellulare che a livello di cluster¹¹ (Figura 1).
   1. Trattare una piastra a 6 pozzetti contenente micropozzetti da 400 μm (come specificato nella tabella dei materiali: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, Day 12) con 2 mL di soluzione di risciacquo antiaderente a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C).
      NOTA: Il micropozzetto impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzetto e facilita la formazione meccanica di cluster 3D.
   2. Piastra da centrifugare a 1.300 x g per 5 min.
   3. Verificare la presenza di eventuali bolle al microscopio invertito. Se non si osservano bolle, aspirare la soluzione di risciacquo antiaderente e aggiungere immediatamente 2 mL di mezzo di lavaggio 2 (Tabella dei materiali).
   4. Ripetere il passaggio 1.8.3. due volte.
   5. Preparare il volume necessario del terreno di coltura e riscaldarlo a temperatura ambiente (15 -25 °C) per 20 min. Assicurarsi che due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti entrino in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti da 400 μm con 4 mL del terreno di grappolo.
   6. Aspirare il terreno progenitore pancreatico e aggiungere tampone di dissociazione (0,5 mL per pozzetto).
   7. Incubare a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C) per 2-5 min. Controllare regolarmente il processo di dissociazione al microscopio invertito e aspirare il tampone di dissociazione quando la maggior parte delle cellule si è arrotondata ma è ancora aderente.
   8. Aspirare il tampone di dissociazione e aggiungere immediatamente 1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto.
   9. Dissociare le cellule pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso sei volte utilizzando una pipetta P1000 e puntali filtranti da 1.000 μL.
   10. Trasferire le cellule e la miscela di terreno di coltura in una provetta conica da 50 ml.
   11. Aggiungere 1 mL del terreno di raccolta per raccogliere tutte le cellule rimanenti.
   12. Aggiungere il terreno di coltura al volume totale necessario in modo che ogni pozzetto della piastra per micropozzetti contenga 4 mL di terreno di miscelazione/cellule.
   13. Aspirare il mezzo di lavaggio 2 dalla piastra a 6 pozzetti per micropozzetti e trasferire la sospensione cellulare. Incubare la piastra a 37 °C per 24 ore.
9. Giorno 13: Manipolazione delle cellule dopo il clustering e cambio dei loro terreni dal giorno 13 in poi.
   NOTA: i cluster sono altamente sensibili e richiedono un'attenta manipolazione per garantirne l'integrità e la vitalità nei giorni successivi. Pertanto, è fondamentale monitorare attentamente i cluster durante il periodo post-clustering dopo il giorno 12. La valutazione e gli aggiustamenti regolari sono essenziali per promuovere risultati positivi nel processo sperimentale.
   1. Preparare il volume necessario del terreno del giorno 13 (2 ml per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e in una provetta conica separata da 50 ml per il terreno progenitore endocrino pancreatico del giorno 15-20.
   2. Raccogliere lentamente i cluster dalla piastra a 6 pozzetti in una provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta p1000 e puntali filtrati da 1.000 μL.
   3. Aggiungere 1 mL di terreno del giorno 13 per raccogliere i cluster rimanenti e trasferire i cluster nella provetta.
   4. Lasciare che le cellule si solidifichino naturalmente per gravità sul fondo del tubo conico per 5 minuti.
   5. Aspirare quanto più surnatante possibile dalla provetta senza disturbare i cluster cellulari. I puntali delle pipette non devono toccare né aspirare i cluster, ma solo il surnatante.
   6. Aggiungere il volume necessario del terreno del giorno 13 in base a quanto segue: 1 pozzetto di micropozzetti La piastra a 6 pozzetti va in tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti a basso attacco (2 mL di terreno per pozzetto).
   7. Pipettare delicatamente verso l'alto e verso il basso, evitando di aspirare i cluster.
   8. Trasferire la sospensione su una piastra a 6 pozzetti a bassissima aderenza.
   9. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all'altro sei volte.
   10. Incubare la piastra a 37 °C per 48 ore.
   11. Eseguire le modifiche del fluido in tutte le fasi successive fino alla fine della differenziazione come descritto in questa sezione 2.9.
10. Giorni da 15 a 20
    1. Passare al terreno di coltura dello stadio di progenitore endocrino pancreatico ogni 48 ore fino al giorno 21 di differenziazione raccogliendo la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e seguendo i passaggi da 2.9.4 a 2.9.10 per il giorno 13.
11. Giorni da 21 a 27
    NOTA: In questa fase, i cluster si differenziano in cellule β pancreatiche.
    1. Preparare il terreno pancreatico per lo stadio β cellulare.
    2. Cambiare il mezzo a giorni alterni come descritto per i giorni da 15 a 21.
       NOTA: Dopo il giorno 25, gli organoidi simili a isole possono essere sottoposti ad analisi per confermare che sono completamente funzionali.

3. Colorazione dei cluster di cellule β pancreatiche

NOTA: Eseguire questo passaggio per studiare la valutazione funzionale dei cluster dopo la differenziazione

1. Raccogliere da cinque a dieci cluster in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL al termine della differenziazione.
2. Fissare i cluster di cellule con 200 μL di PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 1 mL di PBS ai cluster e rimuovere il PBS con un puntale per pipette da 1.000 μL senza disturbare i cluster.
4. Aggiungere 200 μL di saccarosio al 30% ai grappoli e incubare per una notte a 4 °C.
5. Trasferire i grappoli in un criostampo, rimuovere il saccarosio in eccesso, aggiungere una goccia di terreno O.C.T. e mescolare i grappoli con il terreno OCT.
6. Congelare il criostampo su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
7. Tagliare sezioni di 5 μm dal blocco congelato su vetrini da microscopio utilizzando un microtomo/criostato.
8. Conservare i vetrini a -80 °C in congelatore fino alla colorazione.
9. Il giorno della colorazione, estrarre i vetrini dal congelatore a -80 °C.
10. Rimuovere con cautela il ghiaccio intorno alle sezioni del criostampo.
11. Cluster di cellule circolari su vetrini con una penna idrofobica.
12. Reidratare i vetrini in un barattolo colorante contenente PBS per 15 minuti.
13. Aggiungere metanolo freddo nel barattolo per colorare i vetrini e posizionare il barattolo con i vetrini a -20 °C per 10 min.
14. Immergere i vetrini in un barattolo di PBS.
15. Ripetere il passaggio 3.14 tre volte.
    NOTA: Utilizzare questo metodo per tutte le seguenti fasi di lavaggio.
16. Rimuovere il PBS dai vetrini e coprire immediatamente con 100 μL di soluzione bloccante con il 2-5% di BSA in PBS-T.
17. Aggiungere la soluzione bloccante a ciascun vetrino e coprire con pellicola di paraffina.
18. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (15 -25 °C).
19. Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante utilizzando i rapporti forniti nella sezione Reagenti e soluzioni.
20. Rimuovere la soluzione bloccante dai vetrini.
21. Aggiungere immediatamente gli anticorpi diluiti e coprire i vetrini con parafilm per evitare che il vetrino si asciughi.
22. Incubare una notte a 4 °C.
23. Il giorno seguente lavare i vetrini 3 - 5 volte con PBS-T.
24. Preparare gli anticorpi secondari diluiti e la colorazione del DNA.
25. Rimuovere il PBS-T in eccesso dai vetrini.
26. Aggiungere gli anticorpi secondari diluiti e la colorazione del DNA. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente (15 -25 °C).
27. Lavare i vetrini 3 - 5 volte con PBS-T.
28. Rimuovere l'eventuale liquido dai vetrini.
29. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio istologico a ciascuna sezione.
30. Coprire il vetrino con una copertura di vetro.
31. Scatta foto di vetrini colorati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

4. GSIS (test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio)

1. Preparare tre diverse soluzioni: soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio, soluzione KREBS ad alto contenuto di glucosio e soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio con KCl.
2. Riscaldare tutte le soluzioni a bagnomaria a 37 °C.
3. Selezionare con cura circa 10-15 cluster di dimensioni simili utilizzando un puntale per pipette da 1000 μL e trasferirli in una provetta da 1,5 mL insieme a una piccola quantità di terreno differenziato per evitare che i cluster si secchino.
   NOTA: I cluster devono essere visibili ad occhio nudo, ma in caso contrario, posizionare la piastra contenente i cluster differenziati sotto un microscopio invertito per selezionare i cluster e trasferirli in una provetta da 1,5 mL.
4. Posizionare la provetta con i grappoli e il terreno su una griglia per provette e attendere che le provette affondino sul fondo della provetta.
5. Aspirare lentamente il surnatante utilizzando una pipetta da 200 μL e aggiungere 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio.
6. Incubare le isole nella soluzione a basso contenuto di glucosio per 1 ora a 37 °C.
   NOTA: Per garantire una valutazione accurata del numero di cluster e della coerenza negli esperimenti, si consiglia di verificare la presenza di tutti i cluster nella soluzione durante il trasferimento, poiché tendono ad aderire alla provetta.
7. Rimuovere la provetta dall'incubatore e aspirare lentamente 200 μL di soluzione KREBS senza aspirare alcun cluster.
8. Aggiungere 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio e incubare per 30 minuti a 37 °C.
9. Aspirare il volume di 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per le misurazioni dell'insulina. Ripetere l'operazione per trattamenti separati.
10. Per lavare i cluster, aggiungere 200 μL di soluzione di KREBS senza glucosio nella provetta contenente i cluster. Lasciare che i grappoli si depositino sul fondo della provetta e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare i grappoli.
11. Aggiungere 200 μL di soluzione KREBS ad alto contenuto di glucosio e incubare per 30 minuti a 37 °C.
12. Aspirare 200 μL di KREBS ad alto contenuto di glucosio in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per la misurazione dell'insulina. Ripetere l'operazione per trattamenti separati.
13. Per lavare i cluster, aggiungere 200 μL di soluzione di KREBS senza glucosio nella provetta contenente i cluster. Lasciare che i grappoli si depositino sul fondo della provetta e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare i grappoli.
14. Aggiungere 200 μL di soluzione di KCl KREBS e ripetere per trattamenti separati.
15. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
16. Aspirare 200 μL di soluzione di KCl KREBS in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per le misurazioni dell'insulina. Ripetere l'operazione per altri trattamenti.
17. Aggiungere 50 μL di acqua ultrapura e procedere alla misurazione del contenuto totale di insulina.
18. Aggiungere 150 μL di soluzione di etanolo acido alla provetta con isole e acqua ultrapura.
19. Conservare i campioni a 4 °C per una notte (12 - 15 h).
20. Il giorno seguente, vorticare ogni campione.
21. Eseguire la sonicazione con un sonicatore elettrico impostato al 20% di potenza per 1 s per garantire la lisi completa del tessuto dell'isolotto.
    NOTA: Ripetere il passaggio 4.21 fino a quando non sono visibili cluster rimanenti.
22. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 × g per 10 minuti e conservare il surnatante.
23. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a nanogocce, che può quindi essere utilizzato per normalizzare le misurazioni dell'insulina.

Il protocollo descritto in questo articolo offre un approccio altamente efficiente per differenziare le cellule β-like dalle hPSC¹⁰. Questo processo utilizza un sistema di coltura 2D facilmente scalabile, che ne consente l'uso in vari contesti sperimentali, come la differenziazione dell'apprendimento, progetti e laboratori più piccoli e test pilota per valutare il potenziale di una linea di iPSC per la differenziazione.

È essenziale caratterizzare le proprietà funzionali delle cellule β differenziate nelle isole per ottenere informazioni sull'omeostasi del glucosio. Ciò si ottiene in genere attraverso vari esperimenti come l'immunocolorazione per i marcatori delle cellule β e l'espressione dell'insulina, nonché i saggi di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS), che testano la funzione delle isole in risposta a basse e alte concentrazioni di glucosio^12,13. Le cellule β possiedono geni firma, tra cui Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 e Neurod1, che sono fondamentali per stabilire e mantenere l'identità delle cellule β⁹. Le tecniche di immunocolorazione sono preziose per studiare l'espressione e la localizzazione delle proteine all'interno delle sezioni di tessuto. L'immunocolorazione per marcatori a cellule β può valutare i livelli di espressione dei principali marcatori del lignaggio pancreatico, fornendo informazioni sulla fedeltà e l'ottimizzazione del processo di differenziamento per applicazioni specifiche ^9,12.

In questo studio, la linea reporter Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC è stata utilizzata per differenziare cluster comprendenti diversi tipi di cellule, comprese le cellule β simili a quelle che si trovano nelle isole native umane. La Figura 2 di questo documento offre risultati significativi per quanto riguarda l'efficienza e l'accuratezza del processo di differenziazione. I risultati dimostrano un elevato arricchimento di cellule che esprimono insulina all'interno della linea pancreatica e queste cellule mostrano una secrezione di insulina stimolata dal glucosio. Ciò indica il successo della generazione di cellule funzionali simili al β attraverso il processo di differenziazione.

Le cellule differenziate sono state stimolate con concentrazioni di glucosio basse e alte e i risultati di GSIS hanno mostrato che i cluster derivati dalle cellule Mel1 funzionavano in modo simile alle isole nella loro risposta di secrezione di insulina al glucosio. È stato scoperto che i cluster derivati da Mel1 secernono 100 volte più insulina in risposta ad alte concentrazioni di glucosio rispetto a basse concentrazioni di glucosio. In particolare, il contenuto di insulina era di 0,003 ± 0,002% a 3,3 mM di glucosio basso e 0,236 ± 0,197% a 16,7 mM di glucosio alto.

I cluster derivati dalle hESC Mel1 INS-GFP sono stati sottoposti ad ulteriori analisi per determinarne la composizione e la funzionalità, oltre al saggio GSIS. In particolare, è stata studiata l'espressione dei geni della firma delle cellule β e la presenza di diversi tipi di cellule all'interno dei cluster. I risultati hanno mostrato che la linea pancreatica ottenuta da questo processo è altamente arricchita in cellule insulino-positive, indicando un alto livello di successo nel processo di differenziazione delle hESC in cellule simili a cellule β. Inoltre, è stata esaminata l'espressione di geni di firma, come Nkx6.1 e Pdx1, importanti per l'instaurazione e il mantenimento dell'identità delle cellule β. L'analisi ha rivelato che circa il 25% e il 40% delle cellule esprimevano rispettivamente Nkx6.1 e Pdx1, fornendo ulteriori prove che i cluster contenevano cellule β-like differenziate (cellule medie Nkx6.1+ per cluster 24,9% ± 6,2%, n=9 cluster, cellule Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, SEM, Figura 2). Inoltre, i cluster contenevano altri tipi di cellule, come le cellule glucagone-positive, che rappresentavano circa il 15% della popolazione cellulare totale. Queste cellule si trovano tipicamente nelle cellule alfa delle isole native di Langerhans, suggerendo che gli ammassi assomigliano molto alle isole umane in termini di composizione cellulare.

Figura 1: Differenziazione delle hPSC verso le cellule β pancreatiche. (A) Rappresentazione schematica del differenziamento diretto in vitro delle hPSCs in cellule β pancreatiche, che coinvolge sei fasi successive: induzione definitiva dell'endoderma, formazione primitiva del tubo intestinale, specificazione del destino dell'intestino anteriore posteriore, generazione del progenitore pancreatico, formazione del progenitore endocrino pancreatico e, infine, differenziazione delle cellule β pancreatiche. La differenziazione delle cellule pancreatiche β utilizza le fasi chiave dello sviluppo delle isole umane, con la regolazione di specifiche vie di segnalazione cellulare in momenti specifici. B27: Supplemento B-27; Ri: inibitore della protein-chinasi rho-associata o inibitore di ROCK; T3: ormone tiroideo; KGF: proteina umana KGF / FGF-7; RepSox: inibitore della via Activina/Nodale/TGF-β; Inibisce ALK5; RA: Acido retinoico; ZS: solfato di zinco; UFH: eparina non frazionata; XX: inibitore della gamma-secretasi XX; APH: afidicolina; EGF: fattore di crescita epidermico; LDN: Inibitore BMP III, LDN-212854; Ciclo: Ciclopamina- KAAD. (B) Immagini della morfologia cellulare catturate a vari stadi di differenziamento da cellule staminali pluripotenti a cellule β pancreatiche. La prima immagine mostra cellule staminali pluripotenti umane il primo giorno di differenziazione (monostrato di HPSC). (C) Il giorno 11, le cellule sono nello stadio di progenitore pancreatico. Barra di scala di 100 μm. (D) Il giorno 12, si formano cluster nei micropozzetti della piastra a 6 pozzetti dopo la dissociazione delle cellule allo stadio di progenitore pancreatico. (E) Il giorno 13, i cluster si trovano in una piastra a 6 pozzetti a basso attacco. Barra di scala di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: I cluster ottenuti dalla linea^{reporter 14} differenziata di Mel1 InsGFP/w hESC sono stati valutati per la presenza di cellule produttrici di insulina che esprimono marcatori di maturità delle cellule β. (A) Le immagini di immunofluorescenza dei cluster sono state catturate da sezioni di criostampaggio (5 μm) utilizzando la microscopia confocale a disco rotante, che ha rivelato la predominanza di cellule produttrici di insulina (circa il 60%) rispetto alle cellule produttrici di glucagone (circa il 15%) (n=9 cluster, circa 18.000 celle, SEM). (B) Le immagini di immunofluorescenza dei cluster sono state ottenute da sezioni di criostampaggio (5 μm) utilizzando la microscopia confocale a disco rotante, che ha mostrato la predominanza di cellule produttrici di insulina che co-esprimono i marcatori pancreatici a β cellule Nkx6.1 (n = 9 cluster, circa 18.000 cellule). (C) Il contatore di cellule ImageJ, specificamente progettato per l'immunocolorazione dei marcatori, è stato impiegato per determinare la percentuale di cellule positive all'insulina, glucagone e β marcatori a cellule Nkx6.1 positive e di cellule β marcatori Pdx1 positive. (D) È stata valutata la secrezione di insulina stimolata dal glucosio dei cluster derivati da Mel1 InsGFP/w hESC, che ha mostrato un aumento di 100 volte in risposta a un'elevata stimolazione del glucosio (16,7 mM di glucosio) nei cluster differenziati (n = 9, SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Riepilogo della composizione dei mezzi per la differenziazione diretta. Questa tabella fornisce un riepilogo della composizione del terreno utilizzato per ogni giorno/fase di differenziazione diretta sulla matrice e sul terreno di coltura delle cellule staminali, insieme al tampone di secrezione di insulina stimolato dal glucosio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Il successo della differenziazione delle hPSC in cellule β pancreatiche dipende dall'ottimizzazione di tutti gli aspetti della coltura e del passaggio di routine delle hPSC selezionate. Ciò include la garanzia che la linea cellulare abbia un cariotipo normale, sia negativa per l'infezione da micoplasma e sia priva di genomi plasmidici o vettori virali. Inoltre, quando si utilizzano le hiPSC, è importante evitare di utilizzare i primi passaggi, che sono ancora in fase di riprogrammazione, per esperimenti pilota. Questi esperimenti dovrebbero essere condotti su piccola scala per identificare la linea hPSC con il miglior potenziale di differenziazione e il numero ottimale di passaggi.

Altri parametri che possono influenzare l'efficienza di differenziazione includono la qualità del terreno di coltura staminale utilizzato, la densità del rivestimento e il numero di passaggi^10,12. Questo protocollo è stato ottimizzato per massimizzare l'efficienza della differenziazione, garantendo che tutti i parametri rilevanti siano ottimizzati¹⁰.

In ogni fase vengono utilizzati terreni di differenziazione con formulazioni specifiche per supportare la differenziazione delle hPSC in cellule β. L'activina A e un agonista Wnt vengono utilizzati nel mezzo di differenziazione per avviare la transizione verso le cellule endodermiche definitive. Durante la fase primitiva del tubo intestinale, KGF viene aggiunto al terreno per promuovere un'ulteriore differenziazione in cellule β¹⁵ e questa inclusione di KGF viene mantenuta dal giorno 6 all'8, a differenza del protocollo originale di Sui, Egli, et ^al.10. Durante la fase di progenitore pancreatico, la composizione specifica del terreno è ottimizzata per migliorare l'espressione del fattore di trascrizione Pdx1. Ciò si ottiene utilizzando un'alta concentrazione di acido retinoico (RA), KGF e LDN193189, che inibisce la via della proteina morfogenetica ossea (BMP)⁸. Man mano che la differenziazione progredisce verso la fase endocrina, il terreno di coltura viene modificato per sottoregolare la segnalazione di Notch. Ciò si ottiene incorporando XXI, un inibitore della γ-secretasi, insieme a T3 (ormone tiroideo), RA e RepSox, un inibitore della via Activina/BMP/TGF-β⁸. Questa specifica combinazione di composti viene utilizzata per promuovere la differenziazione dei progenitori pancreatici in progenitori endocrini. Infine, per ottimizzare il processo di differenziazione diretta, l'afidicolina (APH) viene introdotta durante la differenziazione da progenitori pancreatici in progenitori endocrini. Questa aggiunta di APH mira a migliorare ulteriormente la differenziazione delle cellule β e rappresenta una modifica distinta rispetto al protocollo iniziale proposto da Sui, Egli, et ^al.10,11.

Durante il processo di differenziazione, è fondamentale monitorare la densità cellulare e prevenire l'eccessiva confluenza, in quanto ciò può ostacolare la corretta differenziazione. Le colture ad alta densità possono mantenere un'elevata espressione di Oct4, inibendo la differenziazione nell'endoderma definitivo. La rimozione dell'inibitore ROCK durante la prima fase di lavaggio è essenziale per avviare la differenziazione e consentire l'alterazione dello stato pluripotente delle hPSC. L'uso di un marcatore di fluorescenza, come Mel1 INS-GFP con una GFP integrata nel locus dell'insulina, facilita la valutazione del progresso del differenziamento negli stadi del progenitore pancreatico e delle cellule β, aiutando gli esperimenti a valle¹⁴.

L'attuale protocollo per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in cellule pancreatiche simili al β ha dimostrato variabilità nell'efficienza tra le diverse linee di hPSC¹⁰. Inoltre, le cellule simili a β risultanti mostrano immaturità funzionale rispetto alle isole pancreatiche umane, mostrando una minore secrezione di insulina per cellula. Per ovviare ulteriormente a questa limitazione, la maturazione in vivo di cellule β-like può essere ottenuta mediante trapianto di organoidi insulari in modelli animali durante le fasi finali del differenziamento ^6,7.

Nonostante queste limitazioni, la differenziazione delle hPSC in cellule β pancreatiche ha un potenziale significativo rispetto ai metodi esistenti ^8,9,10. Questa tecnica permette di produrre un gran numero di cellule simili a cellule β che rispondono al glucosio ed esprimono marcatori di cellule β (Pdx1 e Nkx6.1, vedi Figura 2). Questo viene fatto senza le limitazioni etiche, tecniche e di fonte associate all'uso di isole pancreatiche umane. Inoltre, questa tecnica ha il potenziale per essere applicata alla medicina personalizzata, poiché è possibile generare cellule β specifiche per il paziente per i test farmacologici e la modellazione della malattia ^4,6,7. La tecnica può anche avere applicazioni future nel trattamento del diabete che comporta la perdita o la disfunzione delle cellule β pancreatiche ^4,6,7.

Ines Cherkaoui è stata sostenuta da una borsa di studio di Diabetes UK (BDA 18/0005934) a GAR, che ringrazia anche il Wellcome Trust for an Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC per una sovvenzione del programma (MR/R022259/1), Diabetes UK per la sovvenzione del progetto (BDA16/0005485), CRCHUM per i fondi di start-up, Innovation Canada per un John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) per una sovvenzione per un progetto e CIHR, JDRF per una sovvenzione di gruppo (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion e il dottor Harry Leitch per il loro aiuto nella generazione e nella cultura delle hiPSC umane, presso la struttura di organoidi NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londra.