Method Article
Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule, ce qui en fait une excellente source alternative de β-cellules pancréatiques humaines. Les CSPh peuvent être soit des cellules souches embryonnaires (CSEh) dérivées du blastocyste, soit des cellules pluripotentes induites (CSPh) générées directement à partir de cellules somatiques par un processus de reprogrammation. Ici, un protocole vidéo est présenté pour décrire les conditions optimales de culture et de passage des hPSC, avant leur différenciation et la génération ultérieure de cellules pancréatiques productrices d’insuline. Cette méthodologie suit le processus en six étapes de différenciation dirigée par les cellules β, dans lequel les hPSC se différencient en endoderme définitif (DE), tube intestinal primitif, destin de l’intestin antérieur postérieur, progéniteurs pancréatiques, progéniteurs endocriniens pancréatiques et finalement cellules β pancréatiques. Il convient de noter que cette méthodologie de différenciation prend une période de 27 jours pour générer des β-cellules pancréatiques humaines. Le potentiel de sécrétion d’insuline a été évalué par le biais de deux expériences, qui comprenaient l’immunomarquage et la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose.
Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) ont la capacité unique de se différencier en différents types de cellules, ce qui en fait une alternative viable aux cellules β pancréatiques humaines1. Ces hPSC sont classées en deux types : les cellules souches embryonnaires (hESC), dérivées du blastocyste2, et les cellules pluripotentes induites (hiPSC), générées par la reprogrammation directe des cellules somatiques3. Le développement de techniques permettant de différencier les CSPh en cellules β a des implications importantes pour la recherche fondamentale et la pratique clinique 1,4. Le diabète sucré est une maladie chronique qui touche > 400 millions de personnes dans le monde et résulte de l’incapacité de l’organisme à réguler la glycémie en raison d’un dysfonctionnement ou d’une perte de cellules β pancréatiques5. La disponibilité limitée de cellules d’îlots pancréatiques pour la transplantation a entravé le développement de thérapies de remplacement cellulaire pour le diabète 2,4,6,7. La capacité de générer des cellules sécrétant de l’insuline sensibles au glucose à l’aide de hPSC sert de modèle cellulaire utile pour étudier le développement et la fonction des îlots de Langerhans humains. Il peut également être utilisé pour tester des candidats thérapeutiques potentiels pour le traitement du diabète dans un environnement contrôlé. De plus, les CSPh ont le potentiel de produire des cellules d’îlots pancréatiques génétiquement identiques à celles du patient, réduisant ainsi le risque de rejet immunitaire après la transplantation 2,4,7.
Ces dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans le perfectionnement des protocoles de culture et de différenciation des CSPh, ce qui a permis d’accroître l’efficacité et la reproductibilité du processus de différenciation en vue de générer des cellules β pancréatiques 8,9.
Le protocole suivant décrit les étapes essentielles de la différenciation dirigée des β-cellules pancréatiques. Il implique la régulation de voies de signalisation cellulaire spécifiques à des moments distincts. Il est basé sur le protocole développé par Sui L. et al.10 (2018) pour la génération de CSPh dans les cellules β pancréatiques. Le protocole a été ajusté aux récentes mises à jour de Sui L. et al.11 (2021), car les dernières recherches soulignent l’importance de l’utilisation d’un traitement à l’aphidicoline (APH) pour améliorer la différenciation des β-cellules. Le protocole actuel comprend l’ajout d’APH au milieu au cours des étapes ultérieures du processus. De plus, des modifications ont été apportées à la composition du milieu au cours des premiers stades de différenciation par rapport au protocole initial. Un changement notable est l’ajout du facteur de croissance des kératinocytes (KGF) le jour 6 et se poursuit jusqu’au jour 8. Le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) est introduit du 6e au 8e jour, ce qui diffère légèrement du protocole10 initial, où le KGF n’était pas inclus dans le milieu de stade 4.
La première étape essentielle de la génération de cellules de type β est la différenciation dirigée des CSPh en endoderme définitif (DE), une couche germinale primitive qui donne naissance à la muqueuse épithéliale de divers organes, y compris le pancréas. Après la formation de DE, les cellules subissent une différenciation dans le tube intestinal primitif, qui est suivie de la spécification du destin postérieur de l’intestin antérieur. L’intestin antérieur postérieur se développe ensuite en cellules progénitrices pancréatiques, qui ont le potentiel de se différencier en tous les types de cellules du pancréas, y compris les cellules endocrines et exocrines. L’étape suivante du processus implique des progéniteurs endocriniens pancréatiques donnant naissance aux cellules sécrétant des hormones trouvées dans les îlots de Langerhans. En fin de compte, le processus de différenciation atteint son stade final en produisant des cellules pancréatiques de type β-cellules 9,10 entièrement fonctionnelles. Il est important de noter que ce processus est complexe et nécessite souvent une optimisation des conditions de culture, telles que des facteurs de croissance spécifiques et des composants de la matrice extracellulaire, pour améliorer l’efficacité et la spécificité de la différenciation 9,10. De plus, la génération de cellules fonctionnelles de type β-cellules à partir de hPSC in vitro reste un défi majeur. Les recherches en cours se concentrent sur l’amélioration des protocoles de différenciation et l’amélioration de la maturation et de la fonction des β-cellules résultantes9.
Dans ce protocole, l’utilisation de la dissociation cellulaire douce pendant la culture et le passage des hPSC est essentielle pour maintenir la viabilité et la pluripotence cellulaires, améliorant considérablement l’efficacité de la différenciation en β-cellules pancréatiques. De plus, chaque milieu spécifique à l’étape a été méticuleusement optimisé selon le protocole développé par Sui L. et al.10 pour favoriser un rendement élevé de cellules sécrétant de l’insuline en grappes qui ressemblent étroitement à l’îlot humain.
Avant d’amorcer la différenciation, il est recommandé de déterminer le nombre requis d’organoïdes en forme d’îlots à des fins expérimentales. Dans une plaque à 6 puits, un seul puits avec plus de 80 % de confluence se compose généralement de 2 à 2,3 millions de CSPh. Bien qu’une prédiction précise soit difficile en raison des variations des lignées de hPSC et de l’efficacité de la différenciation, une estimation approximative est 1,5 fois le nombre de puits initiaux. Une différenciation dirigée efficacement produit généralement 1,6 à 2 millions de cellules par puits dans des plaques à six puits, englobant toutes les cellules des grappes plutôt que exclusivement les cellules productrices d’insuline. Pour un amas de 50 μm, on peut estimer qu’il contient environ 10 000 cellules. Le tableau 1 fournit un résumé de la composition du milieu utilisé pour chaque jour/stade de différenciation dirigée sur la matrice et le milieu de cellules souches, ainsi que le tampon de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose.
1. Passage de cellules souches pluripotentes humaines avant différenciation dans des plaques à 6 puits
REMARQUE : Le passage approprié des cellules souches humaines avant la différenciation en cellules de type β est une étape cruciale dans l’établissement du processus expérimental. Un passage, une dilution ou un nombre de cellules d’attachement incorrects peuvent compromettre l’efficacité et la fidélité de la différenciation.
2. Différenciation dirigée par des β-cellules dérivées de cellules souches humaines
REMARQUE : Les hPSC peuvent être utilisées pour le processus de différenciation directe en cellules β pancréatiques lorsque 80 à 95 % de confluence est atteinte.
3. Coloration des amas de cellules β pancréatiques
REMARQUE : Effectuez cette étape pour étudier l’évaluation fonctionnelle des clusters après la différenciation
4. GSIS (test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose)
Le protocole décrit dans cet article offre une approche très efficace pour différencier les cellules de type β des hPSC10. Ce processus utilise un système de culture 2D facilement évolutif, permettant son utilisation dans divers contextes expérimentaux, tels que la différenciation de l’apprentissage, des projets et des laboratoires plus petits, et des tests pilotes pour évaluer le potentiel de différenciation d’une lignée iPSC.
Il est essentiel de caractériser les propriétés fonctionnelles des cellules β différenciées dans les îlots de Langerhans pour mieux comprendre l’homéostasie du glucose. Ceci est généralement réalisé grâce à diverses expériences telles que l’immunomarquage des marqueurs β-cellules et l’expression de l’insuline, ainsi que des tests de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS), qui testent la fonction des îlots en réponse à des concentrations de glucose faibles et élevées12,13. β-cellules possèdent des gènes de signature, notamment Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 et Neurod1, qui sont essentiels à l’établissement et au maintien de l’identité des cellules β9. Les techniques d’immunomarquage sont utiles pour étudier l’expression et la localisation des protéines dans les coupes de tissus. L’immunomarquage des marqueurs β-cellules peut évaluer les niveaux d’expression des principaux marqueurs de la lignée pancréatique, fournissant des informations sur la fidélité et l’optimisation du processus de différenciation pour des applications spécifiques 9,12.
Dans cette étude, la lignée rapporteure de CSEh Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 a été utilisée pour différencier des amas comprenant différents types de cellules, y compris des cellules β ressemblant à celles trouvées dans les îlots natifs humains. La figure 2 de cet article offre des résultats significatifs concernant l’efficacité et la précision du processus de différenciation. Les résultats démontrent un enrichissement élevé des cellules exprimant l’insuline au sein de la lignée pancréatique, et ces cellules présentent une sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Cela indique la génération réussie de cellules fonctionnelles de type β par le processus de différenciation.
Les cellules différenciées ont été stimulées avec des concentrations de glucose faibles et élevées, et les résultats du GSIS ont montré que les clusters dérivés des cellules Mel1 fonctionnaient de la même manière que les îlots dans leur réponse de sécrétion d’insuline au glucose. Il a été constaté que les grappes dérivées de Mel1 sécrètent 100 fois plus d’insuline en réponse à des concentrations élevées de glucose par rapport à de faibles concentrations de glucose. Plus précisément, la teneur en insuline était de 0,003 ± 0,002 % à 3,3 mM de glucose faible et de 0,236 ± 0,197 % à 16,7 mM de glucose élevé.
Les grappes dérivées des CSEh Mel1 INS-GFP ont été soumises à des analyses plus approfondies pour déterminer leur composition et leur fonctionnalité, en plus du test GSIS. Plus précisément, l’expression des gènes de signature β-cellules et la présence de différents types de cellules dans les grappes ont été étudiées. Les résultats ont montré que la lignée pancréatique obtenue à partir de ce processus est fortement enrichie en cellules insulino-positives, indiquant un haut niveau de succès dans le processus de différenciation des CSEh en cellules de type β. De plus, l’expression de gènes de signature, tels que Nkx6.1 et Pdx1, importants pour l’établissement et le maintien des identités β-cellules, a été examinée. L’analyse a révélé qu’environ 25 % et 40 % des cellules exprimaient Nkx6.1 et Pdx1, respectivement, ce qui prouve que les grappes contenaient des cellules différenciées de type β (moyenne des cellules Nkx6,1+ par grappe 24,9 % ± 6,2 %, n = 9 grappes, cellules Pdx1+ 40,2 % ± 6,2 %, n = 9, MEB, Figure 2). De plus, les grappes contenaient d’autres types de cellules, telles que des cellules positives au glucagon, qui représentaient environ 15 % de la population cellulaire totale. Ces cellules se trouvent généralement dans les cellules alpha des îlots natifs de Langerhans, ce qui suggère que les amas ressemblent étroitement aux îlots humains en termes de composition cellulaire.
Figure 1 : Différenciation des CSPh en cellules β pancréatiques. (A) Représentation schématique de la différenciation dirigée in vitro des CSPh en cellules β pancréatiques, qui implique six étapes successives : induction définitive de l’endoderme, formation du tube intestinal primitif, spécification du destin de l’intestin antérieur postérieur, génération de progéniteurs pancréatiques, formation des progéniteurs endocriniens pancréatiques et, finalement, différenciation des cellules β pancréatiques. La différenciation pancréatique β-cellules utilise des étapes clés du développement des îlots humains, avec la régulation de voies de signalisation cellulaires spécifiques à des moments spécifiques. B27 : Supplément B-27 ; Ri : inhibiteur de la protéine kinase rho-associée ou inhibiteur de ROCK ; T3 : hormone thyroïdienne ; KGF : protéine humaine KGF / FGF-7 ; RepSox : inhibiteur de la voie de l’activine/des ganglions/TGF-β ; Inhibe ALK5 ; RA : Acide rétinoïque ; ZS : sulfate de zinc ; HNF : héparine non fractionnée ; XX : inhibiteur de la gamma-sécrétase XX ; APH : aphidicoline ; EGF : facteur de croissance épidermique ; LDN : Inhibiteur de BMP III, LDN-212854 ; Cyclo : Cyclopamine - KAAD. (B) Images de la morphologie cellulaire capturées à différents stades de différenciation des cellules souches pluripotentes aux β-cellules pancréatiques. La première image montre des cellules souches pluripotentes humaines au premier jour de la différenciation (monocouche de HPSC). (C) Au jour 11, les cellules sont au stade progéniteur pancréatique. Barre d’échelle de 100 μm. (D) Au jour 12, des amas se forment dans les micropuits de la plaque à 6 puits après la dissociation des cellules au stade progéniteur pancréatique. (E) Au jour 13, les grappes sont dans une plaque à 6 puits à faible fixation. Barre d’échelle de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les clusters obtenus à partir de la lignée14 de rapporteurs différenciés Mel1 InsGFP/w hESC ont été évalués pour la présence de cellules productrices d’insuline exprimant des marqueurs de maturité β-cellules. (A) Des images d’immunofluorescence des clusters ont été capturées à partir de coupes de cryomoule (5 μm) à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif, qui a révélé la prédominance des cellules productrices d’insuline (environ 60 %) par rapport aux cellules productrices de glucagon (environ 15 %) (n = 9 clusters, environ 18 000 cellules, MEB). (B) Des images d’immunofluorescence des grappes ont été obtenues à partir de coupes cryomoulées (5 μm) par microscopie confocale à disque rotatif, qui ont montré la prédominance de cellules productrices d’insuline co-exprimant les marqueurs pancréatiques β-cellulaires Nkx6.1 (n = 9 grappes, environ 18 000 cellules). (C) La macro de compteur de cellules ImageJ, spécialement conçue pour l’immunomarquage des marqueurs, a été utilisée pour déterminer le pourcentage de cellules positives pour l’insuline, de glucagon positif et de β cellules Nkx6.1, et de marqueurs de cellules β Pdx1 positifs. (D) La sécrétion d’insuline stimulée par le glucose des clusters dérivés de Mel1 InsGFP/w hESC a été évaluée, qui a montré une augmentation de 100 fois en réponse à une stimulation élevée du glucose (16,7 mM de glucose) dans les clusters différenciés (n = 9, SEM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Résumé de la composition des milieux pour la différenciation dirigée. Ce tableau fournit un résumé de la composition du milieu utilisé pour chaque jour/stade de différenciation dirigée sur la matrice et le milieu de cellules souches, ainsi que le tampon de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
La différenciation réussie des CSPh en cellules β pancréatiques dépend de l’optimisation de tous les aspects de la culture de routine et du passage des CSPh sélectionnées. Il s’agit notamment de s’assurer que la lignée cellulaire a un caryotype normal, qu’elle est négative pour l’infection à mycoplasmes et qu’elle est exempte de génomes plasmidiques ou de vecteurs viraux. De plus, lors de l’utilisation de hiPSC, il est important d’éviter d’utiliser le passage le plus ancien qui est encore en cours de reprogrammation, pour des expériences pilotes. Ces expériences doivent être menées à petite échelle pour identifier la raie hPSC avec le meilleur potentiel de différenciation et le nombre optimal de passages.
D’autres paramètres peuvent influencer l’efficacité de la différenciation, notamment la qualité du milieu de cellules souches utilisé, la densité du revêtement et le nombre de passages10,12. Ce protocole a été optimisé pour maximiser l’efficacité de la différenciation en veillant à ce que tous les paramètres pertinents soient optimisés10.
Des milieux de différenciation avec des formulations spécifiques sont utilisés à chaque étape pour soutenir la différenciation des hPSC en cellules β. L’activine A et un agoniste Wnt sont utilisés dans le milieu de différenciation pour initier la transition vers les cellules endodermiques définitives. Au cours de la phase primitive du tube intestinal, le KGF est ajouté au milieu pour favoriser une différenciation ultérieure en cellules β15, et cette inclusion de KGF est maintenue du 6e au 8e jour, ce qui diffère du protocole original de Sui, Egli et al.10. Au cours de la phase progénitrice pancréatique, la composition spécifique du milieu est optimisée pour améliorer l’expression du facteur de transcription Pdx1. Ceci est réalisé en utilisant une concentration élevée d’acide rétinoïque (AR), de KGF et de LDN193189, qui inhibe la voie8 de la protéine morphogénétique osseuse (BMP). Au fur et à mesure que la différenciation progresse vers le stade endocrinien, le milieu de culture est modifié pour réguler à la baisse la signalisation Notch. Ceci est réalisé en incorporant XXI, un inhibiteur de la γ-sécrétase, ainsi que de la T3 (hormone thyroïdienne), de la PR et de RepSox, un inhibiteur de la voie8 de l’Activin/BMP/TGF-β. Cette combinaison spécifique de composés est utilisée pour favoriser la différenciation des progéniteurs pancréatiques en progéniteurs endocriniens. Enfin, pour optimiser le processus de différenciation directe, l’aphidicoline (APH) est introduite lors de la différenciation des progéniteurs pancréatiques en progéniteurs endocriniens. Cet ajout d’APH vise à améliorer encore la différenciation des cellules β, et il représente une modification distincte par rapport au protocole initial proposé par Sui, Egli et al.10,11.
Pendant le processus de différenciation, il est crucial de surveiller la densité cellulaire et d’éviter les confluences excessives, car cela peut entraver une différenciation correcte. Les cultures à haute densité peuvent maintenir une expression élevée d’Oct4, inhibant la différenciation en endoderme définitif. L’élimination de l’inhibiteur de ROCK lors de la première étape de lavage est essentielle pour initier la différenciation et permettre à l’état pluripotent des CSPh d’être modifié. L’utilisation d’un marqueur de fluorescence, tel que Mel1 INS-GFP avec une GFP intégrée au locus de l’insuline, facilite l’évaluation des progrès de la différenciation aux stades progéniteur pancréatique et β-cellules, facilitant les expériences en aval14.
Le protocole actuel de différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules pancréatiques de type β a démontré une variabilité de l’efficacité entre les différentes lignées deCSPh 10. De plus, les cellules de type β qui en résultent présentent une immaturité fonctionnelle par rapport aux îlots pancréatiques humains, montrant une sécrétion d’insuline plus faible par cellule. Pour remédier davantage à cette limitation, la maturation in vivo de cellules de type β peut être obtenue par transplantation d’organoïdes d’îlots dans des modèles animaux au cours des dernières étapes de la différenciation 6,7.
Malgré ces limites, la différenciation des CSPh en cellules β pancréatiques présente un potentiel important par rapport aux méthodes existantes 8,9,10. Cette technique permet de produire un grand nombre de cellules de type β qui sont sensibles au glucose et expriment des marqueurs β-cellules (Pdx1 et Nkx6.1, voir Figure 2). Cela se fait sans les limites éthiques, techniques et de source associées à l’utilisation des îlots pancréatiques humains. De plus, cette technique a le potentiel d’être appliquée à la médecine personnalisée, car des cellules β spécifiques au patient peuvent être générées pour les tests de médicaments et la modélisation de la maladie 4,6,7. La technique pourrait également avoir des applications futures dans le traitement du diabète qui implique la perte ou le dysfonctionnement des cellules β pancréatiques 4,6,7.
Ines Cherkaoui a bénéficié d’une bourse de recherche de Diabetes UK (BDA 18/0005934) à GAR, qui remercie également le Wellcome Trust pour une bourse de chercheur (212625/Z/18/Z), UKRI MRC pour une subvention de programme (MR/R022259/1), Diabetes UK pour une subvention de projet (BDA16/0005485), le CRCHUM pour des fonds de démarrage, Innovation Canada pour une bourse John R. Evans Leader (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) pour une subvention Projet, et IRSC, FRDJ pour une subvention d’équipe (IRSC-IRSC : 0682002550 ; FRDJ 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion et le Dr Harry Leitch pour leur aide à la génération et à la culture d’hiPSC humaines, l’installation d’organoïdes du NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londres.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Ethanol | VWR | 20821.33 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
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