인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있어 인간 췌장 β 세포의 훌륭한 대체 공급원입니다. hPSC는 배반포에서 유래한 배아 줄기 세포(hESC) 또는 재프로그래밍 과정을 사용하여 체세포에서 직접 생성된 유도 만능 세포(hiPSC)일 수 있습니다. 여기에서는 hPSC의 분화 및 인슐린 생산 췌장 세포의 후속 생성 전에 hPSC에 대한 최적의 배양 및 통과 조건을 설명하기 위해 비디오 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 hPSC가 최종 내배엽(DE), 원시 장관, 후장 운명, 췌장 전구 세포, 췌장 내분비 전구 세포, 궁극적으로 췌장 β 세포로 분화하는 β세포 유도 분화를 위한 6단계 과정을 따릅니다. 이 분화 방법론은 인간 췌장 β 세포를 생성하는 데 27일이 걸린다는 점은 주목할 만합니다. 인슐린 분비의 잠재력은 면역염색과 포도당 자극 인슐린 분비를 포함한 두 가지 실험을 통해 평가되었습니다.

인간 만능 줄기세포(hPSC)는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있어 인간 췌장 β세포의 유력한 대안이 될 수 있습니다¹. 이러한 hPSC는 배반포에서 유래한 배아줄기세포(hESC)로 분류된다^.2 체세포^{를 직접 재}프로그래밍하여 생성된 유도만능세포(hiPSC)3. hPSC를 β세포로 분화하는 기술의 개발은 기초 연구와 임상 실습 모두에 중요한 영향을 미칩니다 ^1,4. 진성 당뇨병은 전 세계적으로 4억 > 사람들에게 영향을 미치는 만성 질환으로, 췌장 β세포의 기능 장애 또는 손실로 인해 신체가 혈당을 조절하지 못해 발생합니다⁵. 이식을 위한 췌장 섬 세포의 제한된 가용성은 당뇨병에 대한 세포 대체 요법의 개발을 방해했습니다 2,4,6,7. hPSC를 사용하여 포도당 반응성 인슐린 분비 세포를 생성하는 능력은 인간 섬 발달 및 기능을 연구하는 데 유용한 세포 모델 역할을 합니다. 또한 통제된 환경에서 당뇨병 치료를 위한 잠재적인 치료 후보를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 hPSC는 환자와 유전적으로 동일한 췌장 섬 세포를 생산할 수 있는 잠재력이 있어 이식 후 면역 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다 ^2,4,7.

최근 몇 년 동안 hPSC 배양 및 분화 프로토콜의 정교화가 크게 발전하여 췌장 β 세포 생성을 위한 분화 과정의 효율성과 재현성이 향상되었습니다 ^8,9.

다음 프로토콜은 췌장 β 세포의 직접 분화의 필수 단계를 간략하게 설명합니다. 여기에는 뚜렷한 시점에서 특정 세포 신호 전달 경로의 조절이 포함됩니다. 이는 Sui L. et ^al.10 (2018)이 췌장 β세포로 hPSC를 생성하기 위해 개발한 프로토콜을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 Sui L. et ^al.11 (2021)의 최신 업데이트에 따라 조정되었으며, 최신 연구는 β 세포의 분화를 향상시키기 위해 아피디콜린(APH) 치료를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 현재 프로토콜에는 프로세스의 후반 단계에서 매체에 APH를 추가하는 것이 포함됩니다. 또한, 초기 프로토콜과 비교하여 분화의 초기 단계에서 배지의 구성에 수정이 이루어졌습니다. 주목할 만한 변화는 6일째에 각질세포 성장인자(KGF)가 추가되어 8일째까지 지속된다는 것입니다. 각질세포 성장인자(KGF)는 6일째에서 8일째까지 도입되는데, 이는 KGF가 4기 배지에 포함되지 않았던 초기 프로토콜¹⁰과 약간 다릅니다.

β세포 유사 세포 생성의 첫 번째이자 필수적인 단계는 hPSC를 췌장을 포함한 다양한 장기의 상피 내벽을 형성하는 원시 생식층인 최종 내배엽(DE)으로 직접 분화하는 것입니다. DE가 형성된 후, 세포는 원시적인 장관으로 분화되고, 그 후 후장 운명의 사양이 뒤따릅니다. 그런 다음 후방 전창자는 췌장 전구 세포로 발달하며, 내분비 및 외분비 세포를 포함한 췌장의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 과정의 후속 단계는 랑게르한스 섬에서 발견되는 호르몬 분비 세포를 생성하는 췌장 내분비 전구 세포와 관련이 있습니다. 결국, 분화 과정은 완전히 기능하는 췌장 β 세포와 같은 세포 ^9,10을 생성함으로써 최종 단계에 도달합니다. 이 과정은 복잡하고 분화의 효율성과 특이성을 향상시키기 위해 특정 성장 인자 및 세포외 기질 성분과 같은 배양 조건의 최적화가 필요한 경우가 많다는 점에 유의하는 것이 중요합니다 ^9,10. 또한, 체외에서 hPSC로부터 기능성 β-세포와 유사한 세포를 생성하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 진행 중인 연구는 분화 프로토콜을 개선하고 그 결과로 생성된 β-세포의 성숙과 기능을 향상시키는 데 초점을 맞추고^{있다 9}.

이 프로토콜에서는 hPSC의 배양 및 통과 과정에서 부드러운 세포 해리를 사용하는 것이 세포 생존력과 다능성을 유지하는 데 필수적이며, 췌장 β 세포로의 분화 효율성을 크게 향상시킵니다. 또한, 각 병기 특이적 배지는 Sui L. et ^al.10 이 개발한 프로토콜에 따라 세심하게 최적화되어 인간 섬과 매우 유사한 클러스터에서 인슐린 분비 세포의 높은 수율을 촉진합니다.

분화를 시작하기 전에 실험 목적으로 필요한 섬 모양의 오가노이드 수를 결정하는 것이 좋습니다. 6웰 플레이트에서 밀도가 80% 이상인 단일 웰은 일반적으로 2-230만 hPSC로 구성됩니다. hPSC 라인과 분화 효율의 차이로 인해 정확한 예측이 어렵지만, 대략적인 추정치는 초기 웰 수의 1.5배입니다. 효과적으로 유도된 분화는 일반적으로 6웰 플레이트에서 웰당 160만 개에서 200만 개의 세포를 생성하며, 인슐린을 생산하는 세포만 생산하는 것이 아니라 클러스터 내의 모든 세포를 포함합니다. 50μm 클러스터의 경우 약 10,000개의 세포를 포함하는 것으로 추정할 수 있습니다. 표 1 은 포도당 자극 인슐린 분비 완충액과 함께 줄기세포 기질 및 배지 상에 직접 분화의 각 일/단계에 사용되는 배지 조성을 요약한 것입니다.

1. 6 웰 플레이트에서 인간 만능 줄기 세포 사전 분화 통과

참고: β 세포와 유사한 세포로 분화하기 전에 인간 줄기 세포의 적절한 패시징은 실험 과정을 확립하는 데 중요한 단계입니다. 잘못된 통로 희석 또는 부착 세포 수는 분화 효율성과 충실도를 저하시킬 수 있습니다.

1. 줄기 세포 배양 배지, 코팅 및 해리 용액을 준비합니다( 표 1에 지정됨).
2. 통과하기 1-2시간 전에 6웰 플레이트에 콜드 코팅 용액(웰당 1mL)을 코팅하고 37°C, 5%_CO2에서 배양합니다.
3. 줄기 세포 배양 배지의 부분 표본을 실온(15-25°C)에서 20분 동안 데웁니다.
4. 줄기 세포 배지를 흡인하고 칼슘/마그네슘이 없는 D-PBS 1mL를 추가합니다.
5. 1.4단계를 반복합니다. 두번.
   참고 : D-PBS는 세포를 세척하고 이전 배지 및 화합물을 제거하기 위해 첨가됩니다. D-PBS에 노출되어도 hPSC에 해를 끼치지 않아 삼투압으로 인한 세포 파열 또는 수축을 방지할 수 있으므로 세척 단계에 특정 시간 프레임이 필요하지 않다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
6. D-PBS를 흡입하고 각 웰에 500 μL의 해리 용액을 추가하고 실온(15 - 25 °C)에서 2-5분 동안 그대로 둡니다.
7. 세포가 해리되는 동안 새로운 6웰 플레이트의 코팅 용액을 흡인하고 각 웰에 1-2mL의 칼슘/마그네슘이 없는 D-PBS를 추가합니다.
8. 도립 현미경으로 해리 과정을 정기적으로 확인하십시오.
9. 세포의 80 - 90%가 둥글지만 여전히 부착되어 있을 때 해리 용액을 흡인합니다.
10. 10μM ROCK 억제제를 함유한 줄기세포 배지 1mL를 추가합니다.
11. 1,000 μL 멸균 필터 피펫 팁과 P1000 피펫을 사용하여 해리된 세포를 15 mL 코니컬 튜브에 수집합니다.
12. 1,000μL 멸균 피펫 필터 팁으로 피펫에서 세포 현탁액을 위아래로 천천히 삼중 처리하여 콜로니를 분리하되 10회를 초과하지 마십시오.
13. ROCK 억제제가 함유된 줄기세포 배지 1mL를 첨가하여 나머지 hPSC를 분리하고 세포 현탁액을 동일한 15mL 코니컬 튜브(1.10)로 옮깁니다.
14. 새로 코팅된 플레이트에서 D-PBS를 흡입하고 즉시 15mL 코니컬 튜브에서 세포 현탁액을 추가합니다. 최적의 세포 성장을 보장하려면 6 웰 플레이트를 사용할 때 웰 당 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ 생존 가능한 세포를 파종합니다 (10 분의 1에서 50 분할 중 1 개).
    참고: 부피 계산을 위해 6웰 플레이트의 각 웰에는 ROCK 억제제가 포함된 줄기 세포 배지 2mL가 포함되어야 합니다.
15. 접시를 앞뒤로 빠르게 움직이고 좌우로 5 - 10회 움직입니다.
16. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.
17. 다음날 ROCK 억제제가 없는 신선한 줄기세포 배지로 교체한 후 hPSC의 밀도가 80 - 95%에 도달할 때까지 2일마다 교체합니다.

2. 인간 줄기세포 유래 β세포 유도 분화

참고: hPSC는 80-95%의 합류가 달성될 때 췌장 β 세포로의 직접 분화 과정에 사용할 수 있습니다.

1. -1일차: 세포의 패시징 분화의 -1일차:
   1. 통과 1-2시간 전에 6웰 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 저온 코팅 용액으로 코팅합니다.
   2. 1.1에서 1.10 단계를 수행하고 셀 계산을 진행합니다.
   3. 세포 혼합물 10μL를 넣고 동일한 부피의 트리판 블루를 첨가한 다음 부드럽게 혼합합니다.
   4. 세포 농도를 계산합니다. 10μM ROCK 억제제가 포함된 줄기 세포 배지의 0.8 × 10⁶ cells/mL - 1.0 x 10⁶ cells/mL를 사용하여 웰당 2mL의 배지로 코팅된 6웰 플레이트를 플레이팅합니다.
   5. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 세 번 움직입니다.
   6. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣습니다. 접시를 앞뒤로 빠르게 움직이고 다시 좌우로 10회 움직입니다. 그런 다음 플레이트를 4시간 동안 배양합니다.
      알림: 최대한의 부착과 세포의 균일한 분포가 인큐베이터에 놓인 플레이트를 움직여 세포를 방해하지 않도록 하십시오. 인큐베이터를 매우 조심스럽게 열고 닫으십시오.
   7. 0-4일 동안 기초 배지 병을 4°C에 놓고 밤새 해동합니다.
2. 0일차
   참고: hPSC는 80 - 95% 합류해야 하며, 해당 밀도 하에서 최종 내배엽에 대한 분화 과정을 시작하지 마십시오.
   1. 얼음 위에서, 0일에서 4일 사이의 기초 배지와 보충제를 모두 해동합니다( 재료 표 참조).
   2. 두 개의 원뿔형 튜브에 1일차에 필요한 용량(6웰 플레이트의 웰당 2mL)만 준비하고, 별도의 튜브에서 2.5-4일차의 부피를 두 배로 늘립니다(6웰 플레이트의 웰당 2 x 2mL). Day 2.5 - Day 4 배지를 4 °C에서 보관합니다.
   3. Day 1 매체와 세척 매체 1의 필요한 부피의 부분 표본을 37°C 수조에서 5분 동안 데웁니다.
   4. 줄기 세포 배지를 흡인하고 세척 배지 1 2mL를 추가합니다.
      참고: 프로토콜에 사용된 세척 배지는 각 일/단계에 특정한 기초 배지로 구성되며 1% 항생제가 보충됩니다. 직접 분화 프로토콜의 세척 단계에는 설명된 절차 2.2.4에 따라 지정된 세척 매체("세척 매체 1 또는 2", 재료 표라고 함)의 추가 및 후속 흡인만 포함됩니다. 이러한 세탁 단계에 대한 특정 기간이 표시되지 않았다는 점을 언급하는 것이 중요합니다.
   5. 세척 배지 1을 흡입하고 즉시 1일차 배지 2mL를 웰 측면에 추가합니다.
   6. 세포를 37 °C 및 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다.
3. 1일차
   1. 필요한 양의 2.5-4일 분취액을 37°C 수조에서 5분 동안 예열합니다.
   2. Day 1 배지를 흡인하고 즉시 Day 2.5 - 4 배지 2mL를 웰 측면에 추가합니다. 세포를 씻지 마십시오.
   3. 플레이트를 37°C로 되돌리고 5% CO₂ 에서 36시간 동안 놓습니다.
4. 2.5 - 4일
   1. Day 2.5에서 4 매체의 남은 부피의 부분 표본을 37°C 수조에서 5분 동안 사전 데웁니다.
   2. 배지를 흡인하고 즉시 갓 준비한 Days 2.5 to 4 배지 2mL를 웰 측면에 추가합니다.
   3. 플레이트를 37°C로 되돌리고 5% CO₂ 에서 36시간 동안 놓습니다.
5. 4일차
   참고: 이 단계에서 최종 내배엽 마커의 발현은 최대이며 세포는 원시적인 장관 분화를 시작할 수 있습니다.
   1. Day 4 프리미티브 내장 단계 배지(6웰 플레이트의 웰당 2mL)의 필요한 부피의 부분 표본을 준비하고 실온(15°C -25°C)에서 20분 동안 데웁니다.
   2. Days 2.5-4 배지를 흡인하고 세척액 1 2mL를 추가합니다.
   3. 세척액 1을 흡인하고 즉시 2mL의 Day 4 원시 내장 단계를 웰 측면에 추가합니다.
   4. 플레이트를 37°C로 되돌리고 5% CO₂ 에서 48시간 동안 놓습니다.
6. 6-8일차
   참고: 이 단계에서 세포는 앞장 후(posterior foregut)의 운명에 대한 추가 분화를 시작합니다.
   1. 필요한 양의 6-8일 후방 앞장 배지(6웰 플레이트의 웰당 2mL)를 준비하고 배지를 실온(15°C -25°C)에서 20분 동안 예열합니다.
   2. 4일째 배지를 흡인하고 즉시 6-8일째 후방 앞장 배지 2mL를 웰 측면에 추가합니다.
   3. 플레이트를 37% CO₂ 가 포함된 5°C 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다.
7. 8-12일차
   참고: 세포는 췌장 전구세포의 분화를 겪을 준비가 되었습니다.
   1. 8-12일 췌장 전구 단계 배지(6웰 플레이트의 웰당 2mL)의 필요한 양을 준비하고 배지를 실온(15°C -25°C)에서 20분 동안 예열합니다.
   2. 6-8일째 배지를 흡인하고 즉시 6-8일째 후방 앞장 배지 2mL를 웰 측면에 추가합니다.
   3. 플레이트를 37 % CO₂ 가 포함 된 5 ° C의 인큐베이터에 48 시간 동안 놓습니다.
8. 12일차: 클러스터링 단계 수행
   참고: 이 단계에서 세포는 조밀한 단층을 형성하고 3D 세포 배양으로 전환되어 클러스터를 형성합니다. 이 단계는 분화가 β 유사 세포와 인간 고유 섬의 구조적 유사성을 향상시킬 뿐만 아니라 세포 및 클러스터 수준 모두에서 기능적 유사성을 향상시키는 데 중요합니다¹¹(그림 1).
   1. 400μm( 재료 표: 인간 줄기 세포 유래 β세포 유도 분화, 12일차에 지정됨)의 마이크로웰이 포함된 6웰 플레이트를 실온(15°C - 25°C)에서 2mL의 부착 방지 헹굼 용액으로 처리합니다.
      참고: 마이크로웰은 셀이 웰 바닥에 부착되는 것을 방지하고 3D 클러스터의 기계적 형성을 용이하게 합니다.
   2. 원심분리기 플레이트를 1,300 x g 에서 5분 동안 가열합니다.
   3. 도립 현미경으로 기포가 있는지 확인하십시오. 기포가 관찰되지 않으면 부착 방지 헹굼 용액을 흡입하고 즉시 세척제 2mL를 추가합니다(재료 표).
   4. 1.8.3단계를 반복합니다. 두번.
   5. 클러스터 매체의 필요한 부피를 준비하고 실온(15-25°C)에서 20분 동안 예열합니다. 6웰 플레이트의 웰 2개가 클러스터 배지 4mL가 있는 400μm 마이크로웰 6웰 플레이트의 웰 1개에 들어가도록 합니다.
   6. 췌장 전구 배지를 흡인하고 해리 완충액(웰당 0.5mL)을 추가합니다.
   7. 실온(15 °C - 25 °C)에서 2-5분 동안 배양합니다. 도립 현미경으로 해리 과정을 정기적으로 확인하고 대부분의 세포가 둥글지만 여전히 부착되어 있을 때 해리 완충액을 흡인합니다.
   8. 해리 완충액을 흡입하고 즉시 각 웰에 1mL 클러스터 배지를 추가합니다.
   9. P1000 피펫과 1,000 μL 필터 팁을 사용하여 위아래로 6회 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리합니다.
   10. 세포와 클러스터 배지 혼합물을 50mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
   11. 클러스터 배지 1mL를 추가하여 나머지 세포를 모두 수집합니다.
   12. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 4mL의 혼합물 클러스터 배지/세포가 있도록 필요한 총 부피에 클러스터 배지를 추가합니다.
   13. 마이크로웰 6-웰 플레이트로부터 세척 매체(2)를 흡인하고 셀 현탁액을 이송한다. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
9. 13일차: 13일차부터 세포 클러스터링 후 처리 및 배지 교체.
   참고: 클러스터는 매우 민감하며 다음 며칠 동안 무결성과 실행 가능성을 보장하기 위해 신중하게 처리해야 합니다. 따라서 12일 이후 클러스터링 후 기간 동안 클러스터를 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 정기적인 평가 및 조정은 실험 과정에서 성공적인 결과를 촉진하는 데 필수적입니다.
   1. 필요한 부피의 13일 배지(6웰 플레이트의 웰당 2mL)를 준비하고, 15-20일 췌장 내분비 전구 배지를 위해 50mL의 별도의 원뿔형 튜브에 준비합니다.
   2. p1000 피펫과 1,000μL 필터 팁을 사용하여 마이크로웰 6웰 플레이트에서 클러스터를 50mL 코니컬 튜브로 천천히 수집합니다.
   3. 13일차 배지 1mL를 추가하여 나머지 클러스터를 수집하고 클러스터를 튜브로 옮깁니다.
   4. 세포가 중력 하에서 원뿔형 튜브의 바닥에 5분 동안 자연스럽게 고정되도록 합니다.
   5. 세포 클러스터를 방해하지 않고 튜브에서 가능한 한 많은 상층액을 흡인합니다. 피펫 팁은 클러스터에 닿거나 흡입되어서는 안 되며 상층액에만 닿아야 합니다.
   6. 다음에 따라 필요한 부피의 13일 배지를 추가합니다: 마이크로웰 6웰 플레이트 1웰을 저부착 6웰 플레이트의 웰 3개(웰당 배지 2mL)에 넣습니다.
   7. 흡인 클러스터를 피하면서 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
   8. 서스펜션을 접착력이 매우 낮은 6웰 플레이트로 옮깁니다.
   9. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 6번 움직입니다.
   10. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   11. 이 섹션 2.9에 설명된 대로 차별화가 끝날 때까지 모든 다음 단계에서 매체 변경을 수행합니다.
10. 15-20일
    1. 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브에 모으고 13일째에 2.9.4-2.9.10단계를 따라 분화 21일까지 48시간마다 췌장 내분비 전구 단계 배지로 변경합니다.
11. 21-27일
    참고: 이 단계에서 클러스터는 췌장 β세포로 분화합니다.
    1. 췌장 β세포 단계 배지를 준비합니다.
    2. 15일에서 21일에 대해 설명된 대로 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오.
       참고: 25일 이후에는 섬과 같은 오가노이드가 완전히 작동하는지 확인하기 위해 분석을 받을 수 있습니다.

3. 췌장 β세포 클러스터의 염색

참고: 이 단계를 수행하여 분화 후 클러스터의 기능 평가를 연구합니다

1. 분화가 끝날 때 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 5-10개의 클러스터를 수집합니다.
2. 실온에서 15분 동안 200μL의 4% PFA로 세포 클러스터를 고정합니다.
3. 클러스터에 PBS 1mL를 추가하고 클러스터를 방해하지 않고 1,000μL 피펫 팁으로 PBS를 제거합니다.
4. 클러스터에 200μL의 30% 자당을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
5. 클러스터를 극저온 몰드로 옮기고, 여분의 자당을 제거하고, O.C.T. 배지 한 방울을 추가하고, 클러스터를 O.C.T. 배지와 혼합합니다.
6. 드라이아이스에 냉동 보관하고 -80°C에서 보관합니다.
7. 마이크로톰/또는 저온 유지 장치를 사용하여 현미경 슬라이드의 동결된 블록에서 5μm 절편을 절단합니다.
8. 슬라이드는 염색될 때까지 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
9. 염색 당일에는 -80°C 냉동실에서 슬라이드를 꺼냅니다.
10. 극저온 금형 섹션 주변의 얼음을 조심스럽게 제거합니다.
11. 소수성 펜으로 슬라이드에 원형 세포 클러스터.
12. PBS가 들어 있는 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 15분 동안 재수화합니다.
13. 슬라이드 염색 용기에 차가운 메탄올을 넣고 슬라이드가 있는 용기를 -20°C에서 10분 동안 놓습니다.
14. PBS 병에 슬라이드를 담그십시오.
15. 3.14단계를 세 번 반복합니다.
    알림: 다음 모든 세탁 단계에 이 방법을 사용하십시오.
16. 슬라이드에서 PBS를 제거하고 PBS-T에 2-5% BSA가 포함된 100μL의 차단 용액으로 즉시 덮습니다.
17. 각 슬라이드에 차단 용액을 추가하고 파라핀 필름으로 덮습니다.
18. 실온(15 -25 °C)에서 1시간 동안 배양합니다.
19. Reagents and Solutions(시약 및 용액) 섹션에 제공된 비율을 사용하여 차단 용액의 1차 항체를 희석합니다.
20. 슬라이드에서 차단 용액을 제거합니다.
21. 즉시 희석된 항체를 추가하고 슬라이드가 마르지 않도록 파라필름으로 슬라이드를 덮습니다.
22. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
23. 다음날 PBS-T로 슬라이드를 3-5회 세척합니다.
24. 희석된 2차 항체 및 DNA 염색을 준비합니다.
25. 슬라이드에서 여분의 PBS-T를 제거합니다.
26. 희석된 2차 항체와 DNA 염색을 추가합니다. 실온(15 -25 °C)에서 45분 동안 배양합니다.
27. PBS-T로 슬라이드를 3-5회 세척합니다.
28. 슬라이드에서 액체를 제거합니다.
29. 각 섹션에 조직학 장착 배지 한 방울을 추가합니다.
30. 유리 덮개로 슬라이드를 덮습니다.
31. 형광 현미경을 사용하여 염색된 슬라이드의 사진을 찍습니다.

4. GSIS(포도당 자극 인슐린 분비 분석)

1. KCl을 사용한 저포도당 KREBS 용액, 고포도당 KREBS 용액, 저포도당 KREBS 용액의 세 가지 용액을 준비합니다.
2. 모든 용액을 37°C 수조에서 데우십시오.
3. 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 비슷한 크기의 약 10 - 15개의 클러스터를 신중하게 선택하고 클러스터가 건조되지 않도록 소량의 차별화된 배지와 함께 1.5 mL 튜브에 옮깁니다.
   참고: 클러스터는 육안으로 볼 수 있어야 하지만, 그렇지 않은 경우 분화된 클러스터가 포함된 플레이트를 도립 현미경 아래에 놓고 클러스터를 선택하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
4. 클러스터와 배지가 있는 튜브를 튜브 랙에 놓고 클러스터가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다.
5. 200μL 피펫을 사용하여 상층액을 천천히 흡입하고 200μL의 저포도당 KREBS 용액을 추가합니다.
6. 섬을 저포도당 용액에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 클러스터 수와 실험의 일관성을 정확하게 평가하려면 튜브에 달라붙는 경향이 있으므로 이송 중에 용액에 모든 클러스터가 있는지 확인하는 것이 좋습니다.
7. 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 클러스터를 흡입하지 않고 200μL의 KREBS 용액을 천천히 흡입합니다.
8. 200μL의 저포도당 KREBS 용액을 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
9. 200μL의 저포도당 KREBS 용액을 500μL 튜브에 흡인하고 인슐린 측정을 위해 즉시 -80°C에서 보관합니다. 별도의 치료에 대해 반복합니다.
10. 클러스터를 세척하려면 클러스터가 포함된 튜브에 포도당이 없는 200μL의 KREBS 용액을 추가합니다. 클러스터가 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 클러스터를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
11. 200μL의 고포도당 KREBS 용액을 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
12. 200μL의 고포도당 KREBS를 500μL 튜브에 흡인하고 인슐린 측정을 위해 즉시 -80°C에서 보관합니다. 별도의 치료에 대해 반복합니다.
13. 클러스터를 세척하려면 클러스터가 포함된 튜브에 포도당이 없는 200μL의 KREBS 용액을 추가합니다. 클러스터가 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 클러스터를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
14. 200μL의 KCl KREBS 용액을 추가하고 별도의 처리를 반복합니다.
15. 37°C에서 30분간 배양합니다.
16. 200μL의 KCl KREBS 용액을 500μL 튜브에 흡인하고 인슐린 측정을 위해 즉시 -80°C에서 보관합니다. 다른 치료에 대해 반복하십시오.
17. 초순수 50μL를 넣고 총 인슐린 함량 측정을 진행합니다.
18. 150μL의 산성 에탄올 용액을 섬과 초순수가 있는 튜브에 추가합니다.
19. 시료를 4 °C에서 하룻밤 동안(12 - 15시간) 보관합니다.
20. 다음 날, 각 샘플을 소용돌이치게 합니다.
21. 섬 조직의 완전한 용해를 보장하기 위해 20 초 동안 1 % 전력으로 설정된 전기 초음파 발생기로 초음파 처리를 수행합니다.
    참고: 나머지 클러스터가 표시되지 않을 때까지 4.21단계를 반복합니다.
22. 모든 샘플을 10,000× g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 유지합니다.
23. 나노드롭 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정한 다음 인슐린 측정을 정규화하는 데 사용할 수 있습니다.

이 논문에 기술된 프로토콜은 hPSC에서 β-유사 세포를 구별하기 위한 매우 효율적인 접근법을 제공한다¹⁰. 이 공정은 쉽게 확장할 수 있는 2D 배양 시스템을 활용하여 차별화 학습, 소규모 프로젝트 및 실험실, 차별화를 위한 iPSC 라인의 잠재력을 평가하기 위한 파일럿 테스트와 같은 다양한 실험 환경에서 사용할 수 있습니다.

포도당 항상성에 대한 통찰력을 얻기 위해 섬에서 분화된 β세포의 기능적 특성을 특성화하는 것이 필수적입니다. 이는 일반적으로 β세포 마커 및 인슐린 발현에 대한 면역염색과 같은 다양한 실험과 저포도당 및 고포도당 농도에 반응하여 섬 기능을 검사하는 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석을 통해 달성됩니다^12,13. β세포는 Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1, Neurod1 등의 시그니처 유전자를 보유하고 있으며, 이는 β세포 정체성을 확립하고 유지하는 데 중요한 역할을 한다⁹. 면역염색 기법은 조직 절편 내에서 단백질 발현 및 국소화를 조사하는 데 유용합니다. β세포 마커에 대한 면역염색은 주요 췌장 계통 마커의 발현 수준을 평가하여 특정 응용 분야에 대한 분화 과정의 충실도 및 최적화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다 ^9,12.

이 연구에서 Mel1 InsGFP/w(Mel1 INS-GFP)¹⁴ hESC 리포터 라인은 인간의 토착 섬에서 발견되는 것과 유사한 β 세포를 포함하여 다양한 세포 유형을 포함하는 클러스터를 분화하는 데 사용되었습니다. 이 논문의 그림 2 는 차별화 프로세스의 효율성과 정확성에 관한 중요한 결과를 제공합니다. 결과는 췌장 계통 내에서 인슐린 발현 세포의 높은 농축을 보여주며, 이들 세포는 포도당 자극 인슐린 분비를 나타냅니다. 이는 분화 과정을 통해 기능성 β 유사 세포가 성공적으로 생성되었음을 나타냅니다.

분화된 세포는 낮은 포도당 농도와 높은 포도당 농도로 자극되었고, GSIS 결과는 Mel1 세포에서 유래한 클러스터가 포도당에 대한 인슐린 분비 반응에서 섬과 유사하게 기능한다는 것을 보여주었습니다. Mel1 유래 클러스터는 낮은 포도당 농도에 비해 높은 포도당 농도에 반응하여 100배 더 많은 인슐린을 분비하는 것으로 밝혀졌습니다. 구체적으로, 인슐린 함량은 3.3mM 저포도당에서 0.003 ± 0.002%, 16.7mM 고포도당에서 0.236 ± 0.197%였다.

Mel1 INS-GFP hESC에서 파생된 클러스터는 GSIS 분석 외에도 조성 및 기능을 결정하기 위해 추가 분석을 거쳤습니다. 특히, β세포 시그니처 유전자의 발현과 클러스터 내 다양한 세포 유형의 존재를 조사했습니다. 그 결과 이 과정에서 얻은 췌장 계통이 인슐린 양성 세포에서 매우 풍부하다는 것을 보여주었으며, 이는 hESC가 β 세포 유사 세포로 분화하는 과정에서 높은 수준의 성공을 거두었음을 나타냅니다. 또한, β세포 정체성의 확립 및 유지에 중요한 Nkx6.1 및 Pdx1과 같은 시그니처 유전자의 발현을 조사했습니다. 분석 결과, 약 25%와 40%의 세포가 각각 Nkx6.1과 Pdx1을 발현하는 것으로 나타났으며, 이는 클러스터가 분화된 β유사 세포를 포함하고 있다는 추가적인 증거를 제공했습니다(클러스터당 평균 Nkx6.1+ 세포는 24.9% ± 6.2%, n=9 클러스터, Pdx1+ 세포는 40.2% ± 6.2%, n=9, SEM, 그림 2). 또한 클러스터에는 글루카곤 양성 세포와 같은 다른 세포 유형이 포함되어 있으며, 이는 전체 세포 집단의 약 15%를 차지합니다. 이 세포는 일반적으로 랑게르한스(Langerhans)의 토착 섬의 알파 세포에서 발견되며, 이는 성단이 세포 구성 측면에서 인간 섬과 매우 유사하다는 것을 시사합니다.

그림 1: 췌장 β세포에 대한 hPSC의 분화. (A) hPSC를 췌장 β세포로 체 외 에서 직접 분화하는 개략적인 표현은 최종 내배엽 유도, 원시 장관 형성, 후방 앞장 운명 사양, 췌장 전구 세포 생성, 췌장 내분비 전구 형성, 그리고 궁극적으로 췌장 β 세포 분화의 6가지 연속적인 단계를 포함합니다. 췌장 β세포 분화는 특정 시간에 특정 세포 신호 전달 경로를 조절하는 인간 섬 발달의 주요 단계를 사용합니다. B27 : B-27 보충; Ri: rho-연관 단백질 키나아제 억제제 또는 ROCK 억제제; T3 : 갑상선 호르몬; KGF: 인간 KGF/FGF-7 단백질; RepSox: Activin/Nodal/TGF-β 경로 억제제; ALK5를 억제합니다. RA: 레티노산; ZS : 황산 아연; UFH: 미분획 헤파린; XX: 감마-세크레타제 억제제 XX; APH: 아피디콜린; EGF: 표피 성장 인자; LDN: BMP 억제제 III, LDN-212854; 씨클로 : 사이클로 파민 - KAAD. (B) 만능 줄기 세포에서 췌장 β 세포로의 다양한 분화 단계에서 캡처된 세포 형태 이미지. 첫 번째 이미지는 분화 첫날의 인간 만능 줄기세포(HPSC의 단층)를 보여줍니다. (C) 11일째, 세포는 췌장 전구 단계에 있습니다. 100 μm의 눈금 막대. (D) 12일째에 췌장 전구 단계에서 세포가 해리된 후 6웰 플레이트의 마이크로웰에 클러스터가 형성됩니다. (E) 13일째, 클러스터는 저부착 6웰 플레이트에 있습니다. 100 μm의 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 분화된 Mel1 InsGFP/w hESC 리포터 라인¹⁴에서 얻은 클러스터는 β세포 성숙 마커를 발현하는 인슐린 생산 세포의 존재에 대해 평가되었습니다. (A) 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 크라이오몰드 섹션(5μm)에서 클러스터의 면역형광 이미지를 캡처했으며, 이는 글루카곤 생성 세포(약 15%)(n=9 클러스터, 약 18,000개의 세포, SEM). (B) 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 크라이오몰드 절편(5μm)에서 클러스터의 면역형광 이미지를 획득했으며, 이는 췌장 β세포 마커 Nkx6.1(n=9 클러스터, 약 18,000개 세포)을 공동 발현하는 인슐린 생산 세포의 우세를 보여주었습니다. (C) 마커의 면역염색을 위해 특별히 설계된 ImageJ 세포 카운터 매크로를 사용하여 인슐린 양성, 글루카곤 양성 및 β세포 마커 Nkx6.1 양성 세포 및 β세포 마커 Pdx1 양성 세포의 비율을 측정했습니다. (D) Mel1 InsGFP/w hESC 유래 클러스터의 포도당 자극 인슐린 분비를 평가한 결과, 분화된 클러스터(n=9, SEM)에서 높은 포도당 자극(16.7mM 포도당)에 대한 반응으로 100배의 증가를 나타냈습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 방향성 분화를 위한 매체 조성 요약. 이 표는 포도당 자극 인슐린 분비 완충액과 함께 줄기세포 기질 및 배지 위에 지시된 분화의 각 일/단계에 사용되는 배지 조성에 대한 요약을 제공합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

hPSC를 췌장 β세포로 성공적으로 분화하는 것은 선택된 hPSC의 일상적인 배양 및 통과의 모든 측면을 최적화하는 데 달려 있습니다. 여기에는 세포주가 정상적인 핵형을 가지고 있는지, 마이코플라스마 감염에 대해 음성인지, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 게놈이 없는지 확인하는 것이 포함됩니다. 또한, hiPSC를 사용할 때는 파일럿 실험을 위해 아직 재프로그래밍이 진행 중인 가장 빠른 통로를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 이러한 실험은 최고의 분화 잠재력과 최적의 통과 횟수를 가진 hPSC 라인을 식별하기 위해 소규모로 수행되어야 합니다.

분화 효율에 영향을 미칠 수 있는 다른 파라미터로는 사용된 줄기 세포 배지의 품질, 코팅 밀도 및 통로 수^10,12가 있습니다. 이 프로토콜은 모든 관련 파라미터가 최적화되도록 보장함으로써 차별화의 효율성을 극대화하도록 최적화되었습니다¹⁰.

특정 제형을 가진 분화 배지는 hPSC를 β세포로 분화하는 것을 지원하기 위해 각 단계에서 사용됩니다. Activin A 및 Wnt 작용제는 최종 내배엽 세포로의 전이를 시작하기 위해 분화 배지에 사용됩니다. 원시적인 장관 단계 동안, KGF는 β-세포로의 추가적인 분화를 촉진하기 위해 배지에 첨가되며,^이러한 KGF의 포함은 Sui, Egli, et ^al.10의 원래 프로토콜과 달리 6일에서 8일까지 유지된다. 췌장 전구 단계에서 특정 배지 조성은 Pdx1 전사 인자의 발현을 향상시키도록 최적화됩니다. 이는 고농도의 레티노산(RA), KGF 및 LDN193189를 사용하여 달성되며, 이는 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 경로⁸을 억제합니다. 분화가 내분비 단계로 진행됨에 따라 배양 배지는 Notch 신호전달을 하향 조절하도록 변형됩니다. 이는 γ-세크레타제 억제제인 XXI와 T3(갑상선 호르몬), RA 및 Activin/BMP/TGF-β 경로⁸의 억제제인 RepSox를 통합함으로써 달성됩니다. 이 특정 화합물 조합은 췌장 전구 세포를 내분비 전구 세포로 분화시키는 데 사용됩니다. 마지막으로, 직접적인 분화 과정을 최적화하기 위해 췌장 전구 세포에서 내분비 전구 세포로 분화하는 동안 아피디콜린(APH)이 도입됩니다. 이러한 APH의 추가는 β-세포 분화를 더욱 향상시키는 것을 목표로 하며, Sui, Egli, et ^al.10,11에 의해 제안된 초기 프로토콜과 뚜렷한 변형을 나타냅니다.

분화 과정에서 세포 밀도를 모니터링하고 적절한 분화를 방해할 수 있는 과잉 합류를 방지하는 것이 중요합니다. 고밀도 배양은 높은 Oct4 발현을 유지하여 최종 내배엽으로의 분화를 억제할 수 있습니다. 첫 번째 세척 단계에서 ROCK 억제제를 제거하는 것은 분화를 시작하고 hPSC의 만능 상태를 변경하는 데 필수적입니다. 인슐린 유전자좌에 GFP가 통합된 Mel1 INS-GFP와 같은 형광 마커를 사용하면 췌장 전구 세포 및 β세포 단계에서 분화 진행 상황을 쉽게 평가할 수 있어 다운스트림 실험을 보조할 수 있다¹⁴.

인간 만능 줄기세포를 췌장 β-유사 세포로 분화시키기 위한 현재의 프로토콜은 상이한 hPSC 계통 간의 효율성의 가변성을 입증하였다¹⁰. 또한 그 결과 β 유사 세포는 인간 췌장 섬에 비해 기능적 미성숙을 보이며 세포당 인슐린 분비가 더 낮습니다. 이러한 한계를 더 해결하기 위해, β-유사 세포의 생체내 성숙은 분화의 최종 단계 동안 동물 모델에 islet 오가노이드를 이식함으로써 달성될 수 있다 ^6,7.

이러한 한계에도 불구하고, hPSC를 췌장 β세포로 분화하는 것은 기존 방법 ^8,9,10에 비해 상당한 잠재력을 가지고 있다. 이 기술을 사용하면 포도당에 반응하고 β 세포 마커를 발현하는 많은 수의 β 세포 유사 세포를 생성할 수 있습니다(Pdx1 및 Nkx6.1, 그림 2 참조). 이것은 인간 췌장 섬의 사용과 관련된 윤리적, 기술적, 원천적 제한 없이 수행됩니다. 또한 이 기술은 약물 테스트 및 질병 모델링을 위해 환자 특이적 β 세포를 생성할 수 있으므로 개인 맞춤형 의학에 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다 ^4,6,7. 이 기술은 또한 췌장 β 세포의 손실 또는 기능 장애를 포함하는 당뇨병 치료에 향후 적용될 수 있습니다 ^4,6,7.

Ines Cherkaoui는 Diabetes UK 학생(BDA 18/0005934)의 지원을 받아 GAR에 지원했으며, Wellcome Trust의 Investigator Award(212625/Z/18/Z), UKRI MRC의 프로그램 보조금(MR/R022259/1), Diabetes UK의 프로젝트 보조금(BDA16/0005485), 창업 자금의 CRCHUM, John R. Evans Leader Award(CFI 42649)의 Innovation Canada에도 감사를 표합니다. 프로젝트 보조금의 경우 NIH-NIDDK(R01DK135268), 팀 보조금의 경우 CIHR, JDRF(CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N)을 참조하십시오. 카밀 디온(Camille Dion)과 해리 리치(Harry Leitch) 박사는 런던의 NIHR Imperial BRC(Biomedical Research Centre) 오가노이드 시설에서 인간 hiPSC 생성 및 배양에 도움을 주었습니다.