Method Article
Biyosürfaktan üreten mikropların taranması ve tanımlanmasında yer alan yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan maddelerin kromatografik karakterizasyonu ve kimyasal olarak tanımlanması, biyosürfaktan kalıntı yağ geri kazanımının arttırılmasında endüstriyel uygulanabilirliğinin belirlenmesi için yöntemler de sunulmaktadır.
Biyosürfaktanlar, farklı polaritelerin iki fazı arasındaki yüzey gerilimini azaltabilen yüzey aktif bileşiklerdir. Biyoyüzey aktif maddeler, daha az toksisite, yüksek biyolojik parçalanabilirlik, çevresel uyumluluk ve aşırı çevre koşullarına tolerans nedeniyle kimyasal yüzey aktif maddelere umut verici alternatifler olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, biyosürfaktan üretebilen mikropların taranması için kullanılan yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan üreten mikroplar, damla çökmesi, yağ yayılması ve emülsiyon indeksi testleri kullanılarak tanımlanmıştır. Biyosürfaktan üretimi, mikrobiyal üyelerin büyümesi nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalmanın belirlenmesiyle doğrulanmıştır. Ayrıca biyosürfaktanların karakterizasyonu ve tanımlanmasında yer alan yöntemleri de açıklıyoruz. Ekstrakte edilen biyosürfaktan ince tabaka kromatografisi ve ardından plakların diferansiyel boyanması biyosürfaktan doğasını belirlemek için yapıldı. LCMS, 1H NMR ve FT-IR, biyosürfaktan kimyasal olarak tanımlamak için kullanıldı. Ayrıca, simüle edilmiş bir kum paketi sütununda artık yağ geri kazanımını arttırmak için üretilen biyosürfaktan kombinasyonunun uygulanmasını değerlendirme yöntemlerini de gösteriyoruz.
Biyosürfaktanlar, mikroorganizmalar tarafından üretilen ve yüzeyi ve iki faz arasındaki ara yüzey gerilimini azaltma kapasitesine sahip amfipatik yüzey aktif moleküllerdir1. Tipik bir biyosürfaktan genellikle bir şeker köstebeği veya bir peptit zinciri veya hidrofilik amino asitten oluşan hidrofilik bir kısım ve doymuş veya doymamış bir yağ asidi zincirinden oluşan hidrofobik bir kısım içerir2. Amfipatik doğaları nedeniyle, biyosürfaktanlar iki faz arasındaki arayüzde toplanır ve sınırdaki ara yüzey gerilimini azaltır, bu da bir fazın diğerine dağılmasını kolaylaştırır 1,3. Şimdiye kadar bildirilen çeşitli biyosürfaktan türleri arasında, karbonhidratların ester bağları (örneğin, rhamnolipidler, trehalolipidler ve soforolipidler) yoluyla uzun zincirli alifatik veya hidroksi-alifatik asitlere bağlandığı glikolipidler, lipitlerin polipeptit zincirlerine bağlandığı lipopeptitler (örneğin, yüzey aktif madde ve likenisin) ve genellikle polisakkarit-protein komplekslerinden oluşan polimerik biyosürfaktan maddeler (örneğin, emülsan, liposan, alasan ve lipomannan)4. Mikroorganizmalar tarafından üretilen diğer biyosürfaktan türleri arasında yağ asitleri, fosfolipitler, nötr lipitler ve partikül biyosürfaktanlarbulunur 5. En çok çalışılan biyosürfaktan sınıfı glikolipidlerdir ve bunların arasında çalışmaların çoğu rhamnolipidler üzerinde bildirilmiştir6. Rhamnolipidler, bir veya iki uzun zincirli yağ asidi molekülüne (genellikle hidroksi-dekanoik asit) bağlı bir veya iki ramnoz molekülü (hidrofilik kısmı oluşturan) içerir. Rhamnolipidler ilk olarak Pseudomonas aeruginosa7'den bildirilen primer glikolipidlerdir.
Biyosürfaktanlar, sundukları çeşitli benzersiz ve ayırt edici özellikler nedeniyle kimyasal muadillerine kıyasla artan bir odak noktası kazanmaktadır8. Bunlar arasında daha yüksek özgüllük, daha düşük toksisite, daha fazla çeşitlilik, hazırlama kolaylığı, daha yüksek biyolojik parçalanabilirlik, daha iyi köpüklenme, çevresel uyumluluk ve aşırı koşullar altında aktivite9 bulunur. Biyosürfaktan maddelerinin yapısal çeşitliliği (Şekil S1), onlara kimyasal muadillerine göre bir avantaj sağlayan bir başka avantajdır10. Kritik misel konsantrasyonları (CMC) genellikle kimyasal yüzey aktif maddelerden birkaç kat daha düşük olduğu için genellikle daha düşük konsantrasyonlarda daha etkili ve verimlidirler11. Yüksek oranda ısıl stabil oldukları (100 ° C'ye kadar) ve daha yüksek pH (9'a kadar) ve yüksek tuz konsantrasyonlarını (50 g / L'ye kadar) tolere edebildikleri bildirilmiştir12, böylece aşırı koşullara maruz kalmayı gerektiren endüstriyel proseslerde çeşitli avantajlar sunarlar13. Biyolojik olarak parçalanabilirlik ve daha düşük toksisite, onları biyoremediasyon gibi çevresel uygulamalar için uygun hale getirir. Sundukları avantajlar nedeniyle, gıda, tarım, deterjan, kozmetik ve petrol endüstrisi gibi çeşitli endüstrilerde artan ilgi görmektedirler11. Biyosürfaktanlar, petrol kirleticilerinin ve toksik kirleticilerin uzaklaştırılması için petrol ıslahında da çok dikkat çekmiştir14.
Burada Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108 tarafından üretilen biyosürfaktan maddelerinin üretimini, karakterizasyonunu ve uygulamasını sunuyoruz. Gelişmiş yağ geri kazanımı için biyosürfaktan bir kombinasyonunun taranması, karakterizasyonu ve uygulanmasında yer alan adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir.
Şekil 1: Biyosürfaktanların bir kombinasyonunu kullanarak gelişmiş yağ geri kazanımı için bir yöntem. Kademeli iş akışı gösterilir. Çalışma dört adımda gerçekleştirildi. İlk önce mikrobiyal suşlar kültürlendi ve damla çökme testi, yağ yayılma testi, emülsiyon indeksi testi ve yüzey gerilimi ölçümünü içeren çeşitli tahlillerle biyosürfaktan üretimi için tarandı. Daha sonra, biyosürfaktanlar hücresiz et suyundan ekstrakte edildi ve doğaları ince tabaka kromatografisi kullanılarak tanımlandı ve LCMS, NMR ve FT-IR kullanılarak daha da tanımlandı. Bir sonraki adımda, ekstrakte edilen biyosürfaktan maddeler birlikte karıştırıldı ve elde edilen karışımın gelişmiş yağ geri kazanımı için potansiyeli, kum paketi kolon tekniği kullanılarak belirlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Biyosürfaktan üretmek için bu mikrobiyal suşların taranması, damla çökmesi, yağ yayılımı, emülsiyon indeksi testi ve mikropların büyümesi nedeniyle hücresiz ortamın yüzey geriliminde azalmanın belirlenmesi ile yapıldı. Biyosürfaktanlar LCMS, 1H NMR ve FT-IR ile ekstrakte edildi, karakterize edildi ve kimyasal olarak tanımlandı. Son olarak, bu mikroplar tarafından üretilen biyosürfaktan bir karışımı hazırlandı ve simüle edilmiş bir kum paketi sütununda kalan yağı geri kazanmak için kullanıldı.
Bu çalışma sadece biyosürfaktan kombinasyonunun taranması, tanımlanması, yapısal karakterizasyonu ve artık yağ geri kazanımının arttırılması üzerine uygulanmasında yer alan yöntemleri göstermektedir. Mikrobiyal suşlar tarafından üretilen biyosürfaktan maddelerinin ayrıntılı bir fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamaz15,16. Herhangi bir biyosürfaktan ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için kritik misel tayini, termogravimetrik analiz, yüzey ıslanabilirliği ve biyolojik parçalanabilirlik gibi çeşitli deneyler gerçekleştirilir. Ancak bu makale bir yöntem makalesi olduğundan, odak noktası, artık yağ geri kazanımını arttırmak için biyosürfaktan kombinasyonunun taranması, tanımlanması, yapısal karakterizasyonu ve uygulanmasıdır; bu deneyler bu çalışmaya dahil edilmemiştir.
1. Mikrobiyal suşların büyümesi
2. Biyosürfaktan üretimi için tarama tahlilleri
NOT: Aşağıdaki bölümlerde, pozitif kontrol olarak ticari yüzey aktif madde (Saponin) kullanılırken, negatif kontrol olarak su ve aşılanmamış ortam kullanılmıştır.
3. Biyosürfaktan ekstraksiyonu
4. Emülsiyon stabilite çalışmaları
5. Biyosürfaktan niteliğinin belirlenmesi
6. Biyosürfaktan kimyasal olarak tanımlanması
7. Biyosürfaktan uygulaması (gelişmiş yağ geri kazanımı)
NOT: Bu deneyde negatif kontrol olarak çift damıtılmış su, pozitif kontrol olarak %10 SDS, %10 Tween 80 ve %10 ticari saponin kullanılmıştır.
Üç bakteri suşu (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108), düşme çökme testi, yağ yer değiştirme testi, emülsiyon indeksi testi ve yüzey gerilimi azaltmayı içeren çeşitli tahlillerle biyosürfaktan üretimi için taranmıştır. Her üç bakteri suşunun hücresiz süpernatantları ve bir kimyasal yüzey aktif madde çözeltisi bir damla çöküşe neden oldu ve bu nedenle biyosürfaktanların varlığı için pozitif puan aldı (Şekil 4a). Öte yandan, su damlacığı çökmedi ve bu nedenle biyosürfaktan varlığı için negatif puan aldı. Ticari yüzey aktif madde ve üç bakteri kültürünün hücresiz süpernatanları, yağ yayılma tahlilindeki yağ tabakasının yer değiştirmesinde de başarılı olmuş ve bu nedenle biyosürfaktan varlığı için pozitif puan almıştır (Şekil 4b). Öte yandan, su herhangi bir yağın yerini alamadı ve bu nedenle negatif puan aldı. Emülsiyon indeksi tahlillerinde, ticari yüzey aktif madde ve üç mikrobiyal suşun süpernatanlarını içeren test tüplerinde kararlı bir emülsiyon gözlenmiştir. Bununla birlikte, aşılanmamış kültür ortamı içeren test tüpünde emülsiyon gözlenmedi (Şekil 4c). Bu yine Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in biyosürfaktan maddeleri ürettiğini ileri sürdü. Biyosürfaktan üretiminin doğrulanması, hücresiz et suyunun yüzey geriliminin ölçülmesi ve aşılanmamış kontrol ile karşılaştırılmasıyla elde edildi. Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in biyosürfaktanlarının, ortamın yüzey gerilimini sırasıyla 58.89 mN / m'den 45.41 mN / m'ye, 45.82 mN / m'ye ve 28.43 mN / m'ye düşürdüğü bulunmuştur (Şekil 5).
IFT ölçümleri halka çekme yöntemi kullanılarak yapıldı. Her üç suştan gelen biyosürfaktanlar, çeşitli sulu ve organik fazlar arasındaki ara yüzey gerilimlerini önemli ölçüde azaltabilmiştir (Tablo S1). Yüzey gerilimi ve ara yüzey gerilimi ölçümleri, üç suşun da biyosürfaktan ürettiğini doğrulamaktadır.
Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in hücresiz kültürlerinden biyosürfaktanların çözücü ekstraksiyonu, sırasıyla 820 mg / L, 560 mg / L ve 480 mg / L'lik biyosürfaktan konsantrasyonları ile sonuçlandı.
Şekil 4C'de gözlemlendiği gibi, biyosürfaktan tarafından oluşturulan emülsiyon, yağ mikroemülsiyonundaki sudur. Emülsiyon stabilite testleri, biyosürfaktanların çeşitli çevresel koşullar altında iyi bir stabilite sergilediğini göstermiştir (Şekil 6). Üretilen emülsiyonlar, test edilen çeşitli sıcaklıklarda (Şekil 6a), pH değerlerinde (Şekil 6b) ve tuz konsantrasyonlarında (Şekil 6c) çok kararlıydı.
Biyosürfaktan maddelerin doğasını belirlemek için İnce Tabaka Kromatografisi yapıldı. Plakaların iyot buharı ile boyanması, tüm biyosürfaktanlarda ve kontrolde sarı lekelerin gelişmesine neden olmuştur ( Bacillus sp. IITD 106'dan Biyosürfaktan (Şekil 7a). Bu, biyosürfaktanların bir lipit köstebeği içerdiğini gösterdi. Ninhidrin ile boyandığında TLC plakalarının hiçbirinde mavi renkli lekeler elde edilmedi (Şekil 7b). Bu, biyosürfaktanların herhangi bir peptit köstebeği içermediğini gösterdi. Tüm TLC plakalarında anisaldehit lekesi ile boyandığında mavi ve yeşil lekeler gözlenmiştir (Şekil 7c). Bu, biyosürfaktanların bir karbonhidrat moiety içerdiğini gösterdi. TLC sonuçlarından tüm biyosürfaktanların glikolipid olduğu sonucuna varılmıştır.
LCMS kullanılarak biyosürfaktanların kimyasal olarak tanımlanması, Rhodococcus sp. IITD102 ve Lysinibacillus sp. IITD104'ün, 480.25 Da'lık bir kütleye sahip Di-rhamnopyranosic hidroksidekanoik asit olarak tanımlanan aynı tip biyosürfaktan ürettiğini ortaya koymuştur. Biyosürfaktan yapısı 1H NMR ve FT-IR verileri ile desteklenmiştir (Şekil 8).
1H NMR spektrumunda, 7.2'de elde edilen kimyasal kaymalar, karboksilik grupların protonlarını temsil ediyordu. Metil grubunun protonlarına karşılık gelen kimyasal kaymalar 1-2 ppm aralığında elde edildi. Alkil gruplarına bağlı protonlara karşılık gelen kaymalar 2.3 ppm'de elde edildi. Rhodococcus sp. IITD102 ve Lysinibacillus sp. IITD104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktanların FT-IR spektrumları, OH fonksiyonel grubunun varlığını doğrulayan 3.290 cm-1 dalga numarasında güçlü zirvelerin varlığını göstermiştir. 2.951 cm-1 dalga numarasındaki küçük bir tepe CH gerilmesine karşılık gelir. 1.620 cm-1'deki güçlü bir zirve, biyosürfaktanlarda karboksilik grubun varlığını temsil ediyordu. 1.530, 1.410, 1.200 ve 1.060'ta elde edilen diğer pikler, sırasıyla alkil, CH 3, C-O-C ve C-CH3 fonksiyonel gruplarının varlığını doğruladı. Hem NMR hem de FT-IR verileri, LCMS çalışmalarından belirlenen biyosürfaktan yapısını desteklemiştir. Paenibacillus sp. IITD108'den ham biyosürfaktan LCMS (Şekil 9), biyosürfaktan toplu hidrofobik çekirdeğini oluşturan üç lipit zinciri içeren bir rhamnolipid ürettiğini göstermiştir. Biyosürfaktan 802 Da kütleli 2dekanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hidroksidekanoik asit olarak tanımlandı. LCMS sonuçları 1H NMR ve FT-IR verileri ile desteklenmiştir.
Gelişmiş yağ geri kazanımı için kurulum Şekil 2'de gösterilmiştir.
Şekil 2: Kum paketi kolon tekniği kullanılarak geliştirilmiş yağ geri kazanımı için deneysel kurulum. Toprakla dolu sütun tutucuya monte edildi. Alt çıkış cam yünü ve cam boncuklarla kapatıldı. İkincil geri kazanımdan sonra, kolon içindeki artık yağ, biyosürfaktan karışımının eklenmesiyle gelişmiş yağ geri kazanımına tabi tutuldu. Kolonun dibine yerleştirilen tüp, salınan fraksiyonu toplamak için kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Simüle edilmiş geliştirilmiş yağ geri kazanım deneyinde, kolonun tepesine eklenen 50 mL tuzlu sudan, akışta 12 mL toplandı ve bu nedenle gözenek hacminin 38 mL olduğu tahmin edildi. Petrol kolondan geçirildiğinde, kolondan 33 mL tuzlu su salındı. Bu, başlangıçtaki yağ doygunluğu hacmini temsil ediyordu. 10 gözenek hacimli tuzlu su kullanılarak ikincil geri kazanım, 10 mL yağın elüsyonu ile sonuçlandı. Kolonda kalan kalan yağ 23 mL idi. Biyosürfaktan karışımını içeren su, kolondan 13 mL yağ geri kazanmayı başardı (Şekil 3).
Şekil 3: Bir kum paketi sütunu kullanılarak simüle edilmiş gelişmiş yağ geri kazanımı. Hem kontrol hem de test kolonunun ilk yağ doygunluk hacmi yaklaşık 33 mL idi. İkincil yağ geri kazanımı sırasında, hem kontrol hem de test kolonlarından yaklaşık 10 mL yağ geri kazanıldı. Testin geri kazanım profillerindeki ve kontrol kolonlarındaki farklılıklar sadece kolonda kalan artık yağın geri kazanımı sırasında gözlenmiştir. Biyosürfaktan karışımı, test kolonundan kalan 13 mL artık yağın daha fazla geri kazanılmasıyla sonuçlanırken, kontrol kolonunda bu adımda sadece 1.03 mL yağ geri kazanıldı. Bu, biyosürfaktan karışımının, rezervuarlardan kalan yağın geri kazanımını arttırmada büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu, gelişmiş petrol geri kazanımını temsil ediyordu. Bu nedenle, biyosürfaktan karışımını içeren su, artık yağın% 56.52'sini kolondan geri kazanabilmiştir (Tablo 1). Öte yandan,% 10 SDS,% 10 Ara% 80 ve% 10 saponin çözeltileri, kolondan% 85,% 68 ve% 73 artık yağ geri kazanımı sağlamıştır.
Parametre | Taşkınları kontrol edin | Kombine Biyosürfaktan Taşkınları | % 10 SDS | % 10 Ara | % 10 Saponin |
PV (mL) | 37 | 38 | 38 | 35 | 37 |
OOIP / IOSV (mL) | 33 | 33 | 33 | 29 | 33 |
POS (%) | 89.91 | 86.84 | 86.84 | 82.85 | 89.18 |
SV (ml) | 330 | 330 | 330 | 330 | 330 |
SOR (mL) | 9.77 | 10 | 11.5 | 9.2 | 10 |
ROC (mL) | 23.23 | 23 | 21.5 | 18.8 | 23 |
ROS (%) | 70.39 | 69.69 | 65.15 | 64.82 | 69.69 |
Rv (ml) | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 |
ROR (mL) | 1.03 | 13 | 18.5 | 12.8 | 16.8 |
AOR (%) | 4.43 | 56.5 | 85 | 68.08 | 73.04 |
PV = tuzlu su ile ilk kolon doygunluğundan sonra belirlenen gözenek hacmi, OOIP = yerinde orijinal yağ, IOSV = ilk yağ doygunluğu hacmi, POS = Yüzde yağ doygunluğu, Sv = ikincil geri kazanım için eklenen tuzlu su hacmi, SOR = tuzlu su basmasından sonra geri kazanılan ikincil yağ, ROC = ikincil geri kazanımdan sonra sütundaki artık yağ, ROS = artık yağ doygunluğu, ROR = Biyosürfaktan taşkınından sonra geri kazanılan artık yağ, AOR = geri kazanılan ek yağ
Tablo 1: Bir kum paketi sütununda simüle edilmiş gelişmiş yağ geri kazanımı.
Şekil 4: Biyosürfaktan üretimi için tarama tahlilleri (a) Damla çökme testi: Su damlası, yağ kaplı yüzeye eklendikten sonra çökmezken, üç bakteri suşunun kimyasal yüzey aktif maddesi ve hücresiz süpernatanları damla çökmesine neden oldu. (b) Yağ yer değiştirme testi: Suyun düşmesi yağın yer değiştirmesine neden olmazken, üç bakteri suşunun kimyasal yüzey aktif maddesi ve hücresiz süpernatanları yağ katmanlarının yerini almıştır (c) Emülsiyon indeksi testi: Hücresiz süpernatanlar ve ticari yüzey aktif madde çözeltisinin hepsi kararlı bir emülsiyon indeksinin oluşmasına neden olmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Biyosürfaktan üretimi nedeniyle yüzey geriliminin azaltılması. Mikrobiyal büyüme nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalmanın belirlenmesi, mikrobiyal üyeler tarafından biyosürfaktan üretimini doğrulamıştır. Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ün büyümesi nedeniyle, ortamın yüzey gerilimi 59 mN / m'den 45 mN / m'ye düşmüştür. Paenibacillus sp. IITD 108'in büyümesi nedeniyle, ortamın yüzey gerilimi 59 mN / m'den 28 mN / m'ye düşürülmüştür.
Şekil 6: Çeşitli (a) sıcaklıklarda, (b) pH değerlerinde ve (c) tuz konsantrasyonlarında emülsiyon kararlılığı. Üç mikrobiyal suşun süpernatantları ve ticari yüzey aktif madde karışımı kullanılarak üretilen tüm emülsiyonlar, farklı çevresel koşullar altında büyük stabilite göstermektedir. Test edilen sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonu aralıklarında, belirlenen emülsiyon indeksleri benzerdi ve biyosürfaktan aşırı çevresel koşullar altında kullanılabileceğini ima eden değişen faktörlerin daha yüksek değerlerinde EI'de önemli bir azalma gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Biyosürfaktanların TLC karakterizasyonu (a) İyot buharı ile boyanmış plakalar: TLC plakası üzerinde geliştirilen çeşitli noktalar, ekstrakte edilen biyosürfaktanların, bir lipit grubu içeren çeşitli bileşiklerin bir karışımı olduğunu göstermektedir. Mavi okla işaretlenmiş lekeler, lipit moiety varlığı için pozitif boyanmış biyosürfaktan maddeleri temsil eder. Diğer lekeler, ham biyosürfaktan karışımında bulunan bileşiklerin geri kalanını temsil eder. (b) Ninhidrin ile boyanmış plakalar: Plakalar ninhidrin ile boyandığında mor lekeler ortaya çıkmadı. Bu, biyosürfaktan karışımında herhangi bir amino asidin bulunmadığını ve (c) Anisaldehit ile boyanmış plakaları: TLC plakasında açık yeşil ve sarı lekeler ortaya çıktı ve bunlar şeker içeren bileşikleri temsil etti. Siyah oklarla işaretlenmiş lekeler, karbonhidrat moiety'nin varlığı için pozitif boyanmış biyosürfaktanları temsil eder. Hem iyot hem de anisaldehit ile boyanan lekeler, hem lipit hem de karbonhidrat moieties içeren bileşikleri temsil eder ve muhtemelen bir glikolipid biyosürfaktan olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonu. (a) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan elde edilen biyosürfaktan FT-IR spektrumlarını temsil eder, (b) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan elde edilen biyosürfaktan elde edilen H1 NMR spektrumlarını temsil eder ve (c) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen ham biyosürfaktan maddelerin yapısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonu. (a) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktanların FT-IR spektrumlarını temsil eder, (b) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktanların 1 H NMR spektrumunu temsil eder ve (c) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen ham biyosürfaktanların yapısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Farklı biyosürfaktan türlerinin yapısı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo S1: Biyosürfaktan maddelerinin su ve hidrokarbonlar arasındaki ara yüzey gerilimi (IFT) üzerine etkisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Biyoyüzey aktif maddeler, kimyasal yüzey aktif maddelere cazip alternatifler haline gelen biyolojik olarak aktif bileşenlerin en çok yönlü gruplarından biridir. Daha iyi ıslanabilirlikleri, düşük CMC'leri, çeşitlendirilmiş yapıları ve çevre dostu olmaları nedeniyle deterjan, boya, kozmetik, gıda, ilaç, tarım, petrol ve su arıtma gibi çok sayıda endüstride geniş bir uygulama alanına sahiptirler18. Bu, biyosürfaktan üretimi yapabilen daha fazla mikrobiyal suşun keşfedilmesine olan ilginin artmasına neden olmuştur. Burada, gelişmiş yağ geri kazanımı için Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktan karışımının taranması, tanımlanması ve uygulanması için yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan üretimi, damla çökmesi, yağ yayılımı, emülsiyon indeksi testi ile tarandı ve mikrobiyal büyüme nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalma ölçülerek doğrulandı. Rhodococcus'tan glikolipid biyosürfaktanlarının (rhamnolipidler ve trehalolipidler) üretimi hakkında çeşitli raporlar literatürde mevcuttur 19,20,21,22,23,24. Najafi ve ark., Paenibacillus sp. alvei ARN6325'ten bir lipopeptid biyosürfaktan üretimini ve optimizasyonunu bildirmişlerdir. Bezza ve ark. Paenibacillus dendritiformis CN526 tarafından üretilen bir lipopeptid biyosürfaktan ile pirenin biyolojik olarak parçalandığını bildirmişlerdir. Biyosürfaktan üretimi (Lipopeptitler ve glikolipidler) Paenibacillus27,28,29,30,31'in diğer suşları tarafından da bildirilmiştir. Çeşitli Lysinibacillus türlerinin biyosürfaktan32,33,34 ürettiği bildirilmiştir. Lysinibacillus sfaericus'un hidrofobik pestisitlerin çözünmesini sağlayabilen rhamnolipid ürettiği bildirilmiştir35.
Biyosürfaktan maddelerin kimyasal muadillerine göre sunduğu avantajlardan biri, aşırı çevre koşulları altında stabiliteleridir. Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktanlar, farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonları aralıkları altında stabiliteleri açısından test edildi ve bu parametrelerin aşırı değerleri altında stabil oldukları bulundu. Daha önce, Habib ve ark., farklı sıcaklık aralıklarında, pH değerlerinde ve tuz konsantrasyonlarında stabilite gösteren hidrokarbon bozunan Rhodococcus sp. tarafından üretilen bir lipopeptit bildirmiştir36. İnorganik tuzların konsantrasyonundaki artışın, emülsiyonun stabilitesini arttırdığı bildirilmiştir37. Kolloidlerin kümelenme veya ayrılma eğilimi, parçacık etkileşimi sırasında yer alan çekici (Van der Walls kuvvetleri) ve itici kuvvetlerin (elektrostatik kuvvetler) bir fonksiyonudur38. Suya çözünen tuz kristalleri kendi elektrik yüklerini oluşturur ve iyonlar emülsiyon damlacıkları üzerine adsorbe salınır. Tuz konsantrasyonunun arttırılmasında, ikinci katmanın genişlemesi ve itilmesi azalır. Ayrıca, bir iyonun yük yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, elektrik tabakasının uzunluğu o kadar düşük olur. Böylece, Na2 + gibi iki değerli katyonlar, monovalent katyonlara kıyasla daha kararlı emülsiyonların oluşumuna neden olur39.
Biyosürfaktanların kimyasal yüzey aktif maddelere göre sahip olduğu bir diğer avantaj, biyolojik olarak parçalanabilirolmaları 40. Zeng ve ark., sentetik yüzey aktif madde Triton X 100, lineer alkilbenzen sülfonatlar (LAS) ve rhamnolipidin bozunma kapasitelerini karşılaştırmış ve rhamnolipid biyosürfaktanının tamamen bozunduğunu, LAS ve Triton X 100'ün ise sadece kısmenparçalandığını bulmuşlardır. Liu ve ark. ayrıca sentetik yüzey aktif maddeler CTAB, Triton X 100 ve SDS'nin aksine, rhamnolipidin toksisite göstermediğini ve B. subtilis ve diğer kompost mikroorganizmaları42 tarafından kolayca parçalanabileceğini bildirmektedir.
Her üç mikrobiyal suş tarafından üretilen biyosürfaktanların glikolipidler olduğu bulunmuştur. Rhodococcus'un daha önce çeşitli araştırma grupları20,21,23 tarafından glikolipid ürettiği bildirilmiştir. Lysinibacillus ve Paenibacillus tarafından glikolipid biyosürfaktan üretimi ile ilgili benzer raporlar literatürde de mevcuttur31,32,35,43,44. Biyosürfaktan maddelerinin kimyasal olarak tanımlanması onların rhamnolipidler olduğunu ortaya koydu. Rhamnolipidler, bir lipit zincirine bağlı bir veya iki ramnoz ünitesi içeren glikolipid biyosürfaktanlar sınıfıdır45. Bunlar en çok çalışılan biyosürfaktan türüdür. Çeşitli mikrobiyal suşların rhamnolipidler 7,46,47,48,49 ürettiği bildirilmiştir. Rhamnolipidlerin, artık yağ 50,51,52,53'ün geri kazanımını arttırmak için yüksek potansiyel sergilediği bildirilmiştir. Çalışmamızda, Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktanların karışımının, simüle edilmiş bir kum paketi kolon testinde artık yağın yaklaşık% 56.52'sini başarıyla geri kazandığını bulduk. Bu, biyosürfaktan karışımının, toprak rezervuarlarından artık yağın geri kazanımı için kullanılabileceğini göstermiştir. Benzer bir kum paketi testinde, Sun ve ark. biyosürfaktan artık yağın% 50'sinin geri kazanılmasında başarılı olduğunu bildirmiştir54. Bacillus subtilis'in hücresiz suyunu içeren biyosürfaktanların da artık yağın% 33'ünün geri kazanılmasında etkili olduğu bildirilmiştir55. Darvishi ve ark. ve Wahabi ve ark.56,57 tarafından% 27 ve% 26 -% 36'lık artık petrol geri kazanımı da bildirilmiştir.
Rezervuarlardan kalan petrolün geri kazanımı için biyosürfaktanların ekonomik olarak değerlendirilmesi, EOR'da biyosürfaktan kullanımının ekonomik olarak uygulanabilir bir seçenek olduğunu göstermektedir. Moutinho ve ark., ticari bir biyosürfaktan (rhamnolipidler) tipik maliyetinin kg58 başına yaklaşık 59.6 USD olduğunu bildirmiştir. Başka bir çalışmada, 28 mg / L biyosürfaktan biyosürfaktan konsantrasyonunun, artık yağ geri kazanımını arttırdığı ve 52.5m3 ek yağ üretimine yol açtığı bildirilmiştir59. Çalışmalar, 10 mg / L'lik biyosürfaktan konsantrasyonunun yağ geri kazanımını harekete geçirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bildirilen verilere göre, 52.5m3 ek yağ üretmek için gereken biyosürfaktan miktarı 0.525 kg civarındadır. 52,5m3 petrolün toplam üretim maliyeti yaklaşık 21463 ABD Dolarıdır ve bunun sadece 30 ABD Doları, biyosürfaktan üretim maliyetidir. Veriler, biyosürfaktan maddenin varil başına petrol üretimindeki yüzde maliyetinin sadece% 0.0000139 olduğunu göstermektedir.
Sonuçlarımız, biyosürfaktanların kombinasyonunun, rezervuarlardan kalan yağı geri kazanmak için verimli bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Bildiğimiz kadarıyla, bu, farklı mikrobiyal suşlar tarafından üretilen biyosürfaktan bir karışım kullanarak rezervuardan kalan yağın geri kazanımını arttırmaya yönelik ilk rapordur. Çalışmamız, biyosürfaktanların taranması, yapısal karakterizasyonu ve gelişmiş yağ geri kazanımında uygulanmasında yer alan yöntemleri açıkça tanımlamasına rağmen, çalışma, çeşitli uygulamalarda verimliliklerini etkileyen biyosürfaktanların ayrıntılı bir fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamamaktadır. Herhangi bir yüzey aktif maddenin misellerin oluşturulmasındaki etkinliğinin ölçüsü olan ve sürfaktan anlamlı kullanımı için sınırlayıcı konsantrasyonunu belirleyen kritik misel konsantrasyonu, bu çalışmada60 belirlenmemiştir. Benzer şekilde, EOR için rezervuar koşullarında uygulanabilirliğini belirleyen biyosürfaktan termal stabilitesi de tanımlanmamıştır61. Bazı uygulamalarda biyosürfaktan maddeler antibiyofilm ajanları olarak da kullanılmaktadır. Yüzey ıslanabilirlikleri, antibiyofilm doğalarını belirlemede önemli bir rol oynar. Mevcut çalışmada yüzey ıslanabilirliği çalışmaları da yapılmamıştır62. Biyosürfaktanların çeşitli uygulamalarında önemli olan, biyolojik olarak parçalanabilirlikleri ve antimikrobiyal doğalarını içeren diğer fonksiyonel özellikler de bu çalışmada belirlenmemiştir63,64. Bu nedenle, biyosürfaktan maddelerin yapısal karakterizasyonuna odaklandık. Hedef uygulamaya bağlı olarak, stabilite, biyolojik parçalanabilirlik ve antimikrobiyal aktivite gibi fonksiyonel karakterizasyon gerçekleştirilebilir.
Damla çökme tahlilinde ve yağ yayılma tahlilinde, görünürlüğü arttırmak için, biraz renge sahip bir yağ kullanmak daha iyidir. Yağ yayılma testinde, emülsiyon 24 saat sonra gözlenmelidir. Hafif köpükler, eğer oluşursa, 24 saat içinde parçalanır. Tensiyometreler çok hassas aletlerdir, bu nedenle yüzey gerilimi ölçümleri sırasında, son ölçümlerin taşınmasından kaynaklanan hataları önlemek için her ölçümden önce kap ve prob düzgün bir şekilde temizlenmelidir. Biyosürfaktan ekstraksiyonu, hücresiz süpernatana kloroform metanol karışımının eklenmesini içerir. Adım ya bir duman davlumbazında yapılmalı ya da şişe, ekstraksiyon karışımının transferinden hemen sonra alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. Bir EOR deneyinde ikincil geri kazanım sırasında, kolondan başka yağ çıkmayana kadar tuzlu su çözeltisi fazla eklenmelidir.
Yöntem, kolonlardan artık yağın geri kazanılmasında biyosürfaktan karışımının kapsamını tartışmaktadır. Süreç birçok faktöre bağlıdır. İlk kültürlerin toplandığı mikropların büyüme aşaması. Bazı biyosürfaktanların log fazında üretildiği, bazılarının ise durağan fazda üretildiği bildirilmiştir. Kültürler, biyosürfaktan üretiminin maksimuma ulaştığı belirli bir aşamada buna göre hasat edilmelidir. Biyosürfaktan tarama testleri daha az hassastır, bu nedenle tüm tahliller, belirli bir suşun biyosürfaktan üretme kabiliyeti hakkında bir sonuca varmadan önce yapılmalıdır. Biyosürfaktan saflaştırılması, ham biyosürfaktan konsantrasyonu düşükse, biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonundan önce yapılmalıdır. Gelişmiş yağ geri kazanım deneyleri, kolonu paketlemek için kullanılan toprak türüne büyük ölçüde bağlıdır. Toprak tamamen kuru olmalı ve daha büyük granülleri ve diğer katı kirleticileri gidermek için elenmelidir. Kolonu paketlemek için kumlu toprak ve kuru bahçe toprağı (eşit oranda) karışımı tercih edilmelidir. Deney sırasında kolondan toprak sızmasını önlemek için kolon çıkışı cam yünü ve cam boncuklarla düzgün bir şekilde kapatılmalıdır.
Açıklanan yöntem, üretilen biyosürfaktan maddelerin ve bunların karışımlarının, simüle edilmiş bir kum paketi kolon deneyinde ek yağın geri kazanımındaki önemini belirlemek için yararlıdır. Farklı biyosürfaktanlar farklı özgüllüklere sahiptir, çünkü farklı fonksiyonel gruplar içerirler65. Biyosürfaktan maddelerin bir kombinasyonu, çeşitli hidrokarbonların çözünmesini sağlayacak ve bu nedenle rezervuarlardan kalan yağ geri kazanımını artıracaktır. Açıklanan yöntem, petrol kuyularından gelişmiş petrol geri kazanımı gibi saha uygulamalarında biyosürfaktan karışımlarının potansiyelinin belirlenmesinde yardımcı olacaktır.
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Yazarlar, finansal destek için Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı'na teşekkür eder.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 ml pipette | Eppendorf, Germany | G54412G | |
1H NMR | Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA | ||
20 ul pipette | Thermo scientific, USA | H69820 | |
Autoclave | JAISBO, India | Ser no 5923 | Jain Scientific |
Blue flame burner | Rocker scientific, Taiwan | dragon 200 | |
Butanol | GLR inovations, India | GLR09.022930 | |
C18 column | Agilent Technologies, USA | 770995-902 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810R | |
Chloroform | Merck, India | 1.94506.2521 | |
Chloroform-d | SRL, India | 57034 | |
Falcon tubes | Tarsons, India | 546041 | Radiation sterilized polypropylene |
FT-IR | Thermo Fisher Scientific, USA | Nicolet iS50 | |
Fume hood | Khera, India | 47408 | Customied |
glacial acetic acid | Merck, India | 1.93002 | |
Glass beads | Merck, India | 104014 | |
Glass slides | Polar industrial Corporation, USA | Blue Star | 75 mm * 25 mm |
Glass wool | Merk, India | 104086 | |
Hydrochloric acid | Merck, India | 1003170510 | |
Incubator | Thermo Scientific, USA | MaxQ600 | Shaking incubator |
Incubator | Khera, India | Sunbim | |
Iodine resublimed | Merck, India | 231-442-4 | resublimed Granules |
K12 –Kruss tensiometer | Kruss Scientific, Germany | K100 | |
Laminar air flow cabnet | Thermo Scientific, China | 1300 Series A2 | |
LCMS | Agilent Technologies, USA | 1260 Infinity II | |
Luria Broth | HIMEDIA, India | M575-500G | Powder |
Methanol | Merck, India | 107018 | |
Ninhydrin | Titan Biotech Limited, India | 1608 | |
p- anisaldehyde | Sigma, USA | 204-602-6 | |
Petri plate | Tarsons, India | 460090-90 MM | Radiation sterilized polypropylene |
Saponin | Merck, India | 232-462-6 | |
Sodium chloride | Merck, India | 231-598-3 | |
Test tubes | Borosil, India | 9800U06 | Glass tubes |
TLC plates | Merck, India | 1055540007 | |
Vortex | GeNei, India | 2006114318 | |
Water Bath | Julabo, India | SW21C |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır