Biyosürfaktanların Kombinasyonu Kullanılarak Geliştirilmiş Yağ Geri Kazanımı

Biyosürfaktan üreten mikropların taranması ve tanımlanmasında yer alan yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan maddelerin kromatografik karakterizasyonu ve kimyasal olarak tanımlanması, biyosürfaktan kalıntı yağ geri kazanımının arttırılmasında endüstriyel uygulanabilirliğinin belirlenmesi için yöntemler de sunulmaktadır.

Biyosürfaktanlar, farklı polaritelerin iki fazı arasındaki yüzey gerilimini azaltabilen yüzey aktif bileşiklerdir. Biyoyüzey aktif maddeler, daha az toksisite, yüksek biyolojik parçalanabilirlik, çevresel uyumluluk ve aşırı çevre koşullarına tolerans nedeniyle kimyasal yüzey aktif maddelere umut verici alternatifler olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, biyosürfaktan üretebilen mikropların taranması için kullanılan yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan üreten mikroplar, damla çökmesi, yağ yayılması ve emülsiyon indeksi testleri kullanılarak tanımlanmıştır. Biyosürfaktan üretimi, mikrobiyal üyelerin büyümesi nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalmanın belirlenmesiyle doğrulanmıştır. Ayrıca biyosürfaktanların karakterizasyonu ve tanımlanmasında yer alan yöntemleri de açıklıyoruz. Ekstrakte edilen biyosürfaktan ince tabaka kromatografisi ve ardından plakların diferansiyel boyanması biyosürfaktan doğasını belirlemek için yapıldı. LCMS, ¹H NMR ve FT-IR, biyosürfaktan kimyasal olarak tanımlamak için kullanıldı. Ayrıca, simüle edilmiş bir kum paketi sütununda artık yağ geri kazanımını arttırmak için üretilen biyosürfaktan kombinasyonunun uygulanmasını değerlendirme yöntemlerini de gösteriyoruz.

Biyosürfaktanlar, mikroorganizmalar tarafından üretilen ve yüzeyi ve iki faz arasındaki ara yüzey gerilimini azaltma kapasitesine sahip amfipatik yüzey aktif moleküllerdir¹. Tipik bir biyosürfaktan genellikle bir şeker köstebeği veya bir peptit zinciri veya hidrofilik amino asitten oluşan hidrofilik bir kısım ve doymuş veya doymamış bir yağ asidi zincirinden oluşan hidrofobik bir kısım içerir². Amfipatik doğaları nedeniyle, biyosürfaktanlar iki faz arasındaki arayüzde toplanır ve sınırdaki ara yüzey gerilimini azaltır, bu da bir fazın diğerine dağılmasını kolaylaştırır ^1,3. Şimdiye kadar bildirilen çeşitli biyosürfaktan türleri arasında, karbonhidratların ester bağları (örneğin, rhamnolipidler, trehalolipidler ve soforolipidler) yoluyla uzun zincirli alifatik veya hidroksi-alifatik asitlere bağlandığı glikolipidler, lipitlerin polipeptit zincirlerine bağlandığı lipopeptitler (örneğin, yüzey aktif madde ve likenisin) ve genellikle polisakkarit-protein komplekslerinden oluşan polimerik biyosürfaktan maddeler (örneğin, emülsan, liposan, alasan ve lipomannan)⁴. Mikroorganizmalar tarafından üretilen diğer biyosürfaktan türleri arasında yağ asitleri, fosfolipitler, nötr lipitler ve partikül biyosürfaktanlar^{bulunur 5}. En çok çalışılan biyosürfaktan sınıfı glikolipidlerdir ve bunların arasında çalışmaların çoğu rhamnolipidler üzerinde bildirilmiştir⁶. Rhamnolipidler, bir veya iki uzun zincirli yağ asidi molekülüne (genellikle hidroksi-dekanoik asit) bağlı bir veya iki ramnoz molekülü (hidrofilik kısmı oluşturan) içerir. Rhamnolipidler ilk olarak Pseudomonas aeruginosa^7'den bildirilen primer glikolipidlerdir.

Biyosürfaktanlar, sundukları çeşitli benzersiz ve ayırt edici özellikler nedeniyle kimyasal muadillerine kıyasla artan bir odak noktası kazanmaktadır⁸. Bunlar arasında daha yüksek özgüllük, daha düşük toksisite, daha fazla çeşitlilik, hazırlama kolaylığı, daha yüksek biyolojik parçalanabilirlik, daha iyi köpüklenme, çevresel uyumluluk ve aşırı koşullar altında aktivite^{9 bulunur}. Biyosürfaktan maddelerinin yapısal çeşitliliği (Şekil S1), onlara kimyasal muadillerine göre bir avantaj sağlayan bir başka avantajdır¹⁰. Kritik misel konsantrasyonları (CMC) genellikle kimyasal yüzey aktif maddelerden birkaç kat daha düşük olduğu için genellikle daha düşük konsantrasyonlarda daha etkili ve verimlidirler¹¹. Yüksek oranda ısıl stabil oldukları (100 ° C'ye kadar) ve daha yüksek pH (9'a kadar) ve yüksek tuz konsantrasyonlarını (50 g / L'ye kadar) tolere edebildikleri ^{bildirilmiştir12,} böylece aşırı koşullara maruz kalmayı gerektiren endüstriyel proseslerde çeşitli avantajlar sunarlar¹³. Biyolojik olarak parçalanabilirlik ve daha düşük toksisite, onları biyoremediasyon gibi çevresel uygulamalar için uygun hale getirir. Sundukları avantajlar nedeniyle, gıda, tarım, deterjan, kozmetik ve petrol endüstrisi gibi çeşitli endüstrilerde artan ilgi görmektedirler¹¹. Biyosürfaktanlar, petrol kirleticilerinin ve toksik kirleticilerin uzaklaştırılması için petrol ıslahında da çok dikkat çekmiştir¹⁴.

Burada Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108 tarafından üretilen biyosürfaktan maddelerinin üretimini, karakterizasyonunu ve uygulamasını sunuyoruz. Gelişmiş yağ geri kazanımı için biyosürfaktan bir kombinasyonunun taranması, karakterizasyonu ve uygulanmasında yer alan adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir.

Şekil 1: Biyosürfaktanların bir kombinasyonunu kullanarak gelişmiş yağ geri kazanımı için bir yöntem. Kademeli iş akışı gösterilir. Çalışma dört adımda gerçekleştirildi. İlk önce mikrobiyal suşlar kültürlendi ve damla çökme testi, yağ yayılma testi, emülsiyon indeksi testi ve yüzey gerilimi ölçümünü içeren çeşitli tahlillerle biyosürfaktan üretimi için tarandı. Daha sonra, biyosürfaktanlar hücresiz et suyundan ekstrakte edildi ve doğaları ince tabaka kromatografisi kullanılarak tanımlandı ve LCMS, NMR ve FT-IR kullanılarak daha da tanımlandı. Bir sonraki adımda, ekstrakte edilen biyosürfaktan maddeler birlikte karıştırıldı ve elde edilen karışımın gelişmiş yağ geri kazanımı için potansiyeli, kum paketi kolon tekniği kullanılarak belirlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Biyosürfaktan üretmek için bu mikrobiyal suşların taranması, damla çökmesi, yağ yayılımı, emülsiyon indeksi testi ve mikropların büyümesi nedeniyle hücresiz ortamın yüzey geriliminde azalmanın belirlenmesi ile yapıldı. Biyosürfaktanlar LCMS, ¹H NMR ve FT-IR ile ekstrakte edildi, karakterize edildi ve kimyasal olarak tanımlandı. Son olarak, bu mikroplar tarafından üretilen biyosürfaktan bir karışımı hazırlandı ve simüle edilmiş bir kum paketi sütununda kalan yağı geri kazanmak için kullanıldı.

Bu çalışma sadece biyosürfaktan kombinasyonunun taranması, tanımlanması, yapısal karakterizasyonu ve artık yağ geri kazanımının arttırılması üzerine uygulanmasında yer alan yöntemleri göstermektedir. Mikrobiyal suşlar tarafından üretilen biyosürfaktan maddelerinin ayrıntılı bir fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamaz^15,16. Herhangi bir biyosürfaktan ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için kritik misel tayini, termogravimetrik analiz, yüzey ıslanabilirliği ve biyolojik parçalanabilirlik gibi çeşitli deneyler gerçekleştirilir. Ancak bu makale bir yöntem makalesi olduğundan, odak noktası, artık yağ geri kazanımını arttırmak için biyosürfaktan kombinasyonunun taranması, tanımlanması, yapısal karakterizasyonu ve uygulanmasıdır; bu deneyler bu çalışmaya dahil edilmemiştir.

1. Mikrobiyal suşların büyümesi

1. 2 g Luria Suyu tozu tartın ve 250 mL'lik konik bir şişede 50 mL damıtılmış suya ekleyin. Toz tamamen çözünene kadar içeriği karıştırın ve damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye kadar yükseltin.
2. Benzer şekilde, 100 mL Luria Suyu'ndan iki şişe daha hazırlayın ve şişelerin boynuna pamuklu tapalar yerleştirin.
3. Pamuklu tapaları alüminyum folyo ile örtün ve ortamı sterilize etmek için şişeleri 121 ° C'de 15 dakika ve 15 psi otoklav yapın.
4. Otoklavlamadan sonra, ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
5. Bir suşun birincil kültürünün hazırlanması için, bir aşılama döngüsü kullanarak bir LA plakasından tek bir koloni seçin ve 5 mL steril Luria suyu içeren bir test tüpünde aşılayın.
6. Test tüpünü gece boyunca 30 ° C'de 180 rpm'de inkübe edin.
7. 100 mL otoklavlanmış Luria Suyu içeren şişeleri, laminer hava akış kabini içindeki şişelere 1 mL gece yetiştirilen tohum kültürleri ekleyerek aşılayın.
8. Şişeleri döner bir inkübatörde 7 gün boyunca 30 ° C ve 180 rpm'de inkübe edin.
9. Kuluçka süresinin tamamlanmasından sonra, şişeleri hasat edin ve kültür suyunu santrifüj tüplerine aktarın. Kültürü 4 °C'de soğutulmuş bir santrifüjde 20 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüj yapın.
10. Nazikçe, hücresiz süpernatantı taze bir beherin içine dökün ve biyosürfaktan üretimi için tarama testlerinde kullanın.

2. Biyosürfaktan üretimi için tarama tahlilleri

NOT: Aşağıdaki bölümlerde, pozitif kontrol olarak ticari yüzey aktif madde (Saponin) kullanılırken, negatif kontrol olarak su ve aşılanmamış ortam kullanılmıştır.

1. Damla çökme testi
   1. Temiz bir cam slayt alın ve slaytın yüzeyini 200 μL yağ ile kaplayın.
   2. Yağın merkezine 20 μL hücresiz süpernatant ekleyin ve 2-3 dakika boyunca bozulmadan bırakın.
      NOT: Damla çökerse, biyosürfaktan varlığı için süpernatantı pozitif olarak puanlayın.
2. Yağ serpme testi
   1. Bir Petri plakasına (75 mm çapında) 20 mL çift damıtılmış su alın ve su yüzeyine 200 μL ham petrol ekleyin.
   2. Yağın merkezine 20 μL hücresiz süpernatant ekleyin ve 1 dakika boyunca bozulmadan bırakın.
      NOT: Yağ yer değiştirmesi nedeniyle bir temizleme bölgesi oluşursa, biyosürfaktan varlığı için süpernatantı pozitif olarak puanlayın.
3. Emülsiyon indeksi testi (E₂₄ testi)
   1. Her biri temiz bir cam test tüpüne 4 mL benzin (benzin) ve hücresiz süpernatant ekleyin.
   2. Karışımı 3 dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve sonraki 24 saat boyunca bozulmadan bırakın.
   3. 24 saat sonra, E₂₄ indeksini, tüm sıvı sütunun (cm) yüksekliğine göre emülsifiye tabakanın (cm) yüksekliğinin bir yüzdesi olarak belirleyin.
      
      NOT: 24 saat sonra bir emülsiyon (sudaki yağ veya yağdaki su) gözlenirse, süpernatantın biyosürfaktan içermesi muhtemeldir.
4. Yüzey gerilimi ölçümü
   NOT: Yüzey gerilimi Du Noüy halka yöntemi¹⁷ kullanılarak ölçülmüştür. Bu deneyde kullanılan alet ( bakınız Malzeme Tablosu) çok hassastır, bu nedenle cam kabın ve probun uygun şekilde temizlenmesini sağlayın.
   1. Sistemi açın ve açmak için ilgili yazılıma çift tıklayın.
   2. Cam kabı, yüzey gerilimi belirlenecek sıvı ile temizleyin.
   3. Sıvıyı (40 mL) kaba ekleyin ve kabı kap tutucusuna monte edin.
   4. Prob tutucusunun kilidini açın ve probu üzerine monte edin. Şimdi manuel kontrol cihazındaki Kilitle düğmesine basarak prob tutucuyu kilitleyin .
   5. Manuel kontrolörü kullanarak, platformun yüksekliğini, probun sıvı yüzeyinden yaklaşık 2-3 mm uzakta olacak şekilde ayarlayın.
   6. Şimdi yüzey gerilimini ölçmek için yazılımı kullanın. Ekranın sol üst panelinde bulunan Dosya'ya tıklayın. Çalışma Alanını Aç'a tıklayın. Bir açılır pencere görünecektir.
   7. Aşağı kaydırın ve K100: Yüzey ve Ara Yüz Gerilimi simgesine çift tıklayın.
   8. Şimdi, ekranın sol üst köşesinde bulunan Dosya simgesine tıklayın. Yeni Veritabanı'na tıklayın. Verileri kaydetmek için adı girin ve Tamam'a tıklayın.
   9. Yine, SFT > Ring> Yeni Ölçüm > Dosya'ya tıklayın. Ölçümün adını girin. Yapılandırma şablonunun SFT halkasını gösterdiğinden emin olun.
   10. Probu ve ölçüm için kullanılan kabı seçerek Ölçüm Yapılandırması penceresindeki ayrıntıları doldurun. Ayrıca, sıvı ve gaz fazının ayrıntılarını doldurun.
       NOT: Sıvı faz su, gaz fazı ise hava olacaktır. Sıvı fazın yoğunluğu, hücresiz süpernatanın yoğunluğudur. Bu, sıvının 50 mL'lik ağırlığının alınması ve yoğunluğun Kg/^m3 olarak hesaplanmasıyla belirlenebilir.
   11. Şimdi Prosedür sekmesine tıklayın ve aşağıdaki ayrıntıları doldurun: Algılama Hızı: 6 mm / dak, Algılama Hassasiyeti: 0,005 g, Arama Hızı: 6 mm / dak, Arama Hassasiyeti: 0,005 g, Ölçüm Hızı: 3 mm / dak, Ölçüm Hassasiyeti: 0,001 g, Daldırma Derinliği: 3 mm, Geri Dönüş Mesafesi: % 10, düzeltme: Harkins & Jordan, maksimum değerler: 5. Tamam'a tıklayın.
   12. Açılır pencerede, verilerin depolanacağı veritabanını seçin ve Tamam'a tıklayın.
       NOT: Burada yeni bir veritabanı oluşturulabilir veya mevcut verilere yeni ölçümler eklenebilir.
   13. Şimdi ekranın üst ortasında bulunan Oynat düğmesine tıklayın. Sistem komut dosyasını yürütmeye başlayacaktır. Sistem stabilize olduktan sonra, yüzeyi algılar. Probu sıvıya batırın, probu ileri geri hareket ettirin ve oluşan lameldeki gerginliği tespit edin.
   14. Sonuçları elde etmek için ekranın sol orta tarafındaki Ölçüm simgesine tıklayın. Veri'ye tıklayın ve belirlenen yüzey gerilimini not edin.
   15. Ölçümün tamamlanmasından sonra, platformun yüksekliğini düşürün ve probun ve kabın kilidini açın ve aletten çıkarın.
       NOT: Biyosürfaktan üretimi nedeniyle yüzey gerilimindeki azalmayı belirlemek için, kontrol olarak aşılanmamış LB kullanılmalıdır.

3. Biyosürfaktan ekstraksiyonu

1. Hücresiz süpernatantın pH'ını 2 N HCl kullanarak 2'ye ayarlayın. karışımı gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
2. Süpernatanta eşit miktarda kloroform-metanol karışımı (2: 1) ekleyin ve 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
3. Faz ayrımının gerçekleşmesi için karışımı rahatsız etmeden bırakın.
4. Su ve metanol içeren üst fazı çıkarın ve biyosürfaktan içeren alt fazı bir duman davlumbazında buharlaşmaya bırakın.
5. Organik fazın buharlaştırılmasından sonra, bal rengindeki ham biyosürfaktan 3 mL kloroform içinde yeniden çözün ve bu karışımı biyosürfaktan daha fazla tanımlanması ve karakterizasyonu için kullanın.

4. Emülsiyon stabilite çalışmaları

1. Farklı sıcaklıklarda emülsiyon kararlılığı
   1. Farklı test tüplerinde 5 mL hücresiz süpernatant alın.
   2. Her test tüpüne 5 mL benzin ekleyin ve 3 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice karıştırın.
   3. Test tüplerini farklı su banyolarında farklı sıcaklıklarda (30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C ve 70 ° C) gece boyunca inkübe edin.
   4. 24 saat sonra, daha önce de belirtildiği gibi emülsiyon endekslerini tahmin edin.
2. Farklı pH değerlerinde emülsiyon kararlılığı
   1. Temiz test tüplerinde hücresiz süpernatantın 5 mL'sini alın.
   2. 1 N HCl ve 1 N NaOH kullanarak hücresiz süpernatantların (2, 4, 6, 8 ve 10) pH'ını ayarlayın.
   3. Test tüplerine eşit miktarda benzin ekleyin ve 3 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice karıştırın.
   4. Test tüplerini oda sıcaklığında 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   5. Emülsiyon indeksini daha önce de belirtildiği gibi tahmin edin.
3. Farklı tuz konsantrasyonlarında emülsiyon kararlılığı
   1. Temiz test tüplerinde hücresiz süpernatantın 5 mL'sini alın.
   2. Süpernatantlara farklı miktarlarda tuz (NaCl) ekleyin (0 g / L, 5 g / L, 10 g / L, 20 g / L, 60 g / L ve 80 g / L).
   3. Tuzları hücresiz süpernatantlarda 3 dakika boyunca vorteks yaparak çözün.
   4. Test tüplerine eşit miktarda benzin ekleyin ve 3 dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice karıştırın.
   5. Test tüplerini oda sıcaklığında 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   6. Emülsiyon indeksini 24 saat sonra tahmin edin.

5. Biyosürfaktan niteliğinin belirlenmesi

1. Ekstrakte edilen biyosürfaktan TLC'si
   1. TLC plakalarındaki biyosürfaktan maddelerin 20 μL'sini tespit edin. Bir seferde 2 μL nokta.
   2. Biyosürfaktanları üç farklı TLC plakasında tespit edin.
   3. Kloroform:metanol (2:1) içeren elüentin 100 mL'lik bir karışımını hazırlayın ve elüenti TLC odasına ekleyin. Odanın kapağını kapatın ve 20 dakika doygunluğa ulaşmasına izin verin.
   4. Plakaları kuruttuktan sonra, TLC plakalarını kloroform metanol karışımı ile doyurulmuş odanın içine yerleştirin ve TLC'yi çalıştırın.
   5. Eluent TLC plakasının tepesine ulaştıktan sonra (üstten 1 cm uzakta), plakaları çıkarın ve havayla kurumasını bekleyin.
2. Lipid tespiti için boyama
   1. Temiz bir TLC haznesi alın ve taze odaya biraz (5-10) granül iyot ekleyin ve odayı 5 ila 10 dakika doyurun.
   2. TLC plakasını haznenin içine yerleştirin ve sarı lekelerin gelişimini gözlemleyin. Lekeler ortaya çıkarsa, lipit bileşeninin varlığı için biyosürfaktan pozitif puan alın.
3. Peptit veya amino asit tespiti için boyama
   1. 20 mL bütanol içinde 0.4 g ninhidrin çözerek bir ninhidrin çözeltisi hazırlayın. Karışıma 0,6 mL% 100 buzul asetik asit ekleyin.
   2. TLC plakasına ninhidrin çözeltisi püskürtün ve 2 dakika boyunca havayla kurumasını bekleyin. Plakayı 110 ° C'de ısıtın ve rengin gelişimini gözlemleyin.
      NOT: Mavi lekeler belirirse, herhangi bir peptit zincirinin veya amino asidin varlığı için biyosürfaktan pozitif puan alın.
4. Karbonhidrat tespiti için boyama
   1. 1 mL H2_{SO 4} içeren 48 mL buzul asetik asidine 2 mL p-anisaldehit ekleyerek_birp-anisaldehit çözeltisi hazırlayın. Karışıma 0.6 mL asetik asit ekleyin.
   2. Karışımı bir TLC plakasına eşit şekilde püskürtün ve 2 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.
   3. Plakayı 110 ° C'de inkübe edin ve lekelerin gelişimini izleyin.
      NOT: Yeşil veya kahverengi lekeler ortaya çıkarsa, biyosürfaktan herhangi bir karbonhidratın varlığı için pozitif puan alın.

6. Biyosürfaktan kimyasal olarak tanımlanması

1. Biyosürfaktan LCMS
   1. Ekstrakte edilen biyosürfaktan 25 mg'ı 1 mL kloroform içinde çözün.
   2. Bir C18 sütunu kullanarak LCMS (referans tarama frekansı 10 sn olan bir kilit sprey konfigürasyonunda) gerçekleştirin.
   3. Kloroform kullanın: metanol (1: 1) mobil bir faz olarak ve numunenin 2 μL'sini kolona 0.1 mL / dak akış hızında enjekte edin.
   4. Deneysel parametreleri şu şekilde ayarlayın: polarite: ES pozitif, kılcal gerilim: 3 kV, kaynak sıcaklığı: 80 °C, çözünme sıcaklığı: 300 °C, çözünme gazı akış hızı: 7.000 L/s ve tuzak gaz akış hızı: 0,40 mL/dak.
   5. 20 dakikalık bir algılama süresi boyunca 100 ila 1.200 Da arasındaki aralıkları tarayın ve iyonları pozitif ES modunda inceleyin.
   6. Herhangi bir kütle spektrometresi nicel yazılımı kullanarak m / z değerlerini analiz edin.
   7. Analiz için yazılıma giriş yapın.
   8. Toplu Arama'ya tıklayın ve elde edilen kütlelerin listesini girin. Sonuçları pozitif şarj modunda araştırın ve katkı olarak M + H ve M + Na kullanın. Doğruluğu 10 PPM'ye kadar koruyun ve Ekran Yapısı'nı işaretleyin.
   9. Ara'ya tıklayın ve bileşikler listesinden en düşük PPM seviyesine sahip olanı seçin.
2. ¹ adet Biyosürfaktan H NMR
   NOT: ^{Biyosürfaktan 1}H NMR, 400 MHz NMR spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz.
   1. 5 mg biyosürfaktan 1 mL deuterated kloroform (CdCl₃) içinde çözün.
   2. Karışımı bir NMR tüpüne aktarın. Tüpü düzgün bir şekilde kapatın ve tüpü anahtara yerleştirin. Ayarlayıcı tüpü kullanarak tüpün yüksekliğini ayarlayın.
   3. Tüpü anahtarla birlikte NMR makinesine yerleştirin ve bir NMR spektrumu elde etmek için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
   4. Numune tüpü tipini seçmek için: sx N, burada N, ilgili yazılımda tüpün yerleştirildiği konumdur (örneğin, tüp 13^{. konuma} yerleştirilmişse sx 13).
   5. Verilerin depolanabileceği yeni bir klasör oluşturmak için edc yazın ve Enter tuşuna basın.
   6. Bir açılır pencere görünecektir. Listede CdCl _3'e tıklayarak çözücüyü seçin ve numunenin adını girin.
   7. Protokolü başlatmak için "getprosol" yazın; çözücüyü kilitlemek için "cdcl3'ü kilitle" yazın.
   8. Örneği şime etmek için "topshim" yazın ve son olarak verileri almak için "rga;zgefp" yazın. Bu, protokolü başlatacaktır.
   9. Spektrumlar elde edildikten sonra, "apk;abs n" yazın ve faz ve taban çizgisi düzeltmesi için enter tuşuna basın.
   10. Birincil tepe noktalarını seçmek için "pp" yazın ve Enter tuşuna basın. Yalnızca yoğun zirveleri seçmek için "mi" girin ve zirvelerin seçilmesi gereken yoğunluğu yazın. Varsayılan değer 0,2 olacaktır.
   11. Tepe noktalarını entegre etmek için, Entegre Et'e tıklayın ve imleci entegre edilecek tepenin sol tarafına yerleştirin ve imleci basılı tutarken imleci tıklayın ve tepenin etrafına sürükleyin.
   12. Sol üst köşedeki Dosya'ya ve ardından Kaydet'e tıklayarak verileri kaydedin.
   13. Numune "sx ej" yazılarak makineden çıkarılabilir.
   14. Zirveleri analiz edin ve H atomlarının ortamını belirleyin.
3. Fourier Dönüşümü Biyosürfaktan Kızılötesi Spektroskopisi
   NOT: Ekstrakte edilen biyosürfaktan FT-IR, ATR modunda ticari olarak temin edilebilen bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz.
   1. Spektrofotometreyi açın ve temizlemeyi, kurutucuyu ve dedektörü kontrol edin.
   2. Bir spektrum toplamak için, önce bir örnek olmadan arka plan spektrumunu toplayın.
   3. Ekstrakte edilen biyosürfaktan alın ve tamamen kurutun. Kurutulmuş biyosürfaktan doğrudan elmas kristalinin üzerine yerleştirin, basınç uygulayın ve ATR temas noktasına basın.
   4. Yazılımda, tarama sayısını seçin (30 girin) ve spektrumu 400 cm-1 ila 4.000 ^cm-1 arasında ^tarayın.
   5. Örnek spektrumu spektral pencereye eklemek için Tamam'a tıklayın.
   6. Dosyalar > Kaydet > Farklı Kaydet'e tıklayın ve dosya adını ve ardından .spa uzantısını girin ve Tamam'a tıklayın.

7. Biyosürfaktan uygulaması (gelişmiş yağ geri kazanımı)

NOT: Bu deneyde negatif kontrol olarak çift damıtılmış su, pozitif kontrol olarak %10 SDS, %10 Tween 80 ve %10 ticari saponin kullanılmıştır.

1. Camı alın ve alt çıkışı cam yünü ve cam boncuklarla kapatın.
2. Kolonu kumlu toprakla, toprağın üstüne bir miktar sıvı eklenebilecek ve içinden geçen akış altta toplanabilecek şekilde paketleyin. Kolonu tutucuya monte edin ve toprağın üstüne biraz cam boncuk ekleyin.
3. Kolonu 50 mL tuzlu su çözeltisi ile doldurun ve gözenek hacmini belirlemek için akışı toplayın.
   gözenek hacmi = üstüne eklenen tuzlu su hacmi - toplanan akış hacmi.
4. Kolonun üstünden ekledikten sonra ham petrolü içinden geçmeye zorlayarak tuzlu suyu kolondan çıkarın. İlk yağ doygunluk hacmini belirlemek için kolondan çıkan tuzlu su ve yağın hacmini toplayın. Kolondan salınan tuzlu suyun hacmi, ilk yağ doygunluğu hacmi veya yerinde orijinal yağ olacaktır.
5. Sütunu 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
6. 24 saat sonra, sütunu 10 gözenek hacmi tuzlu suyla doldurun ve ikincil yağ geri kazanımını tahmin etmek için sütundan çıkan yağı toplayın. İkincil yağ geri kazanımından sonra kolonda kalan yağ, artık yağa karşılık gelir.
7. Cam beherine ekstrakte edilen biyosürfaktan (adım 3.5'ten sonra ekstrakte edilen) eşit hacimlerde ekleyerek bir biyosürfaktan karışımı hazırlayın. Biyosürfaktanları sütunun üstüne ekleyin ve sütunu 24 saat boyunca inkübe edin.
8. 24 saat sonra, ek veya gelişmiş yağ geri kazanımını belirlemek için yağ ve su miktarını ölçün. Kolondan salınan yağın hacmi, geri kazanılan artık yağa karşılık gelecektir.
9. Aşağıdaki denklemle gelişmiş yağ geri kazanımını tahmin edin:
   

Üç bakteri suşu (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108), düşme çökme testi, yağ yer değiştirme testi, emülsiyon indeksi testi ve yüzey gerilimi azaltmayı içeren çeşitli tahlillerle biyosürfaktan üretimi için taranmıştır. Her üç bakteri suşunun hücresiz süpernatantları ve bir kimyasal yüzey aktif madde çözeltisi bir damla çöküşe neden oldu ve bu nedenle biyosürfaktanların varlığı için pozitif puan aldı (Şekil 4a). Öte yandan, su damlacığı çökmedi ve bu nedenle biyosürfaktan varlığı için negatif puan aldı. Ticari yüzey aktif madde ve üç bakteri kültürünün hücresiz süpernatanları, yağ yayılma tahlilindeki yağ tabakasının yer değiştirmesinde de başarılı olmuş ve bu nedenle biyosürfaktan varlığı için pozitif puan almıştır (Şekil 4b). Öte yandan, su herhangi bir yağın yerini alamadı ve bu nedenle negatif puan aldı. Emülsiyon indeksi tahlillerinde, ticari yüzey aktif madde ve üç mikrobiyal suşun süpernatanlarını içeren test tüplerinde kararlı bir emülsiyon gözlenmiştir. Bununla birlikte, aşılanmamış kültür ortamı içeren test tüpünde emülsiyon gözlenmedi (Şekil 4c). Bu yine Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in biyosürfaktan maddeleri ürettiğini ileri sürdü. Biyosürfaktan üretiminin doğrulanması, hücresiz et suyunun yüzey geriliminin ölçülmesi ve aşılanmamış kontrol ile karşılaştırılmasıyla elde edildi. Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in biyosürfaktanlarının, ortamın yüzey gerilimini sırasıyla 58.89 mN / m'den 45.41 mN / m'ye, 45.82 mN / m'ye ve 28.43 mN / m'ye düşürdüğü bulunmuştur (Şekil 5).

IFT ölçümleri halka çekme yöntemi kullanılarak yapıldı. Her üç suştan gelen biyosürfaktanlar, çeşitli sulu ve organik fazlar arasındaki ara yüzey gerilimlerini önemli ölçüde azaltabilmiştir (Tablo S1). Yüzey gerilimi ve ara yüzey gerilimi ölçümleri, üç suşun da biyosürfaktan ürettiğini doğrulamaktadır.

Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ve Paenibacillus sp. IITD108'in hücresiz kültürlerinden biyosürfaktanların çözücü ekstraksiyonu, sırasıyla 820 mg / L, 560 mg / L ve 480 mg / L'lik biyosürfaktan konsantrasyonları ile sonuçlandı.

Şekil 4C'de gözlemlendiği gibi, biyosürfaktan tarafından oluşturulan emülsiyon, yağ mikroemülsiyonundaki sudur. Emülsiyon stabilite testleri, biyosürfaktanların çeşitli çevresel koşullar altında iyi bir stabilite sergilediğini göstermiştir (Şekil 6). Üretilen emülsiyonlar, test edilen çeşitli sıcaklıklarda (Şekil 6a), pH değerlerinde (Şekil 6b) ve tuz konsantrasyonlarında (Şekil 6c) çok kararlıydı.

Biyosürfaktan maddelerin doğasını belirlemek için İnce Tabaka Kromatografisi yapıldı. Plakaların iyot buharı ile boyanması, tüm biyosürfaktanlarda ve kontrolde sarı lekelerin gelişmesine neden olmuştur ( Bacillus sp. IITD 106'dan Biyosürfaktan (Şekil 7a). Bu, biyosürfaktanların bir lipit köstebeği içerdiğini gösterdi. Ninhidrin ile boyandığında TLC plakalarının hiçbirinde mavi renkli lekeler elde edilmedi (Şekil 7b). Bu, biyosürfaktanların herhangi bir peptit köstebeği içermediğini gösterdi. Tüm TLC plakalarında anisaldehit lekesi ile boyandığında mavi ve yeşil lekeler gözlenmiştir (Şekil 7c). Bu, biyosürfaktanların bir karbonhidrat moiety içerdiğini gösterdi. TLC sonuçlarından tüm biyosürfaktanların glikolipid olduğu sonucuna varılmıştır.

LCMS kullanılarak biyosürfaktanların kimyasal olarak tanımlanması, Rhodococcus sp. IITD102 ve Lysinibacillus sp. IITD104'ün, 480.25 Da'lık bir kütleye sahip Di-rhamnopyranosic hidroksidekanoik asit olarak tanımlanan aynı tip biyosürfaktan ürettiğini ortaya koymuştur. Biyosürfaktan yapısı ¹H NMR ve FT-IR verileri ile desteklenmiştir (Şekil 8).

¹H NMR spektrumunda, 7.2'de elde edilen kimyasal kaymalar, karboksilik grupların protonlarını temsil ediyordu. Metil grubunun protonlarına karşılık gelen kimyasal kaymalar 1-2 ppm aralığında elde edildi. Alkil gruplarına bağlı protonlara karşılık gelen kaymalar 2.3 ppm'de elde edildi. Rhodococcus sp. IITD102 ve Lysinibacillus sp. IITD104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktanların ^FT-IR spektrumları, OH fonksiyonel grubunun varlığını doğrulayan 3.290 cm-1 dalga numarasında güçlü zirvelerin varlığını göstermiştir. 2.951 ^cm-1 dalga numarasındaki küçük bir tepe CH gerilmesine karşılık gelir. 1.620 ^cm-1'deki güçlü bir zirve, biyosürfaktanlarda karboksilik grubun varlığını temsil ediyordu. 1.530, 1.410, 1.200 ve 1.060'ta elde edilen diğer pikler, sırasıyla alkil, CH 3, C-O-C ve C-CH₃ fonksiyonel gruplarının varlığını doğruladı. Hem NMR hem de FT-IR verileri, LCMS çalışmalarından belirlenen biyosürfaktan yapısını desteklemiştir. Paenibacillus sp. IITD108'den ham biyosürfaktan LCMS (Şekil 9), biyosürfaktan toplu hidrofobik çekirdeğini oluşturan üç lipit zinciri içeren bir rhamnolipid ürettiğini göstermiştir. Biyosürfaktan 802 Da kütleli 2dekanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hidroksidekanoik asit olarak tanımlandı. LCMS sonuçları ¹H NMR ve FT-IR verileri ile desteklenmiştir.

Gelişmiş yağ geri kazanımı için kurulum Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 2: Kum paketi kolon tekniği kullanılarak geliştirilmiş yağ geri kazanımı için deneysel kurulum. Toprakla dolu sütun tutucuya monte edildi. Alt çıkış cam yünü ve cam boncuklarla kapatıldı. İkincil geri kazanımdan sonra, kolon içindeki artık yağ, biyosürfaktan karışımının eklenmesiyle gelişmiş yağ geri kazanımına tabi tutuldu. Kolonun dibine yerleştirilen tüp, salınan fraksiyonu toplamak için kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Simüle edilmiş geliştirilmiş yağ geri kazanım deneyinde, kolonun tepesine eklenen 50 mL tuzlu sudan, akışta 12 mL toplandı ve bu nedenle gözenek hacminin 38 mL olduğu tahmin edildi. Petrol kolondan geçirildiğinde, kolondan 33 mL tuzlu su salındı. Bu, başlangıçtaki yağ doygunluğu hacmini temsil ediyordu. 10 gözenek hacimli tuzlu su kullanılarak ikincil geri kazanım, 10 mL yağın elüsyonu ile sonuçlandı. Kolonda kalan kalan yağ 23 mL idi. Biyosürfaktan karışımını içeren su, kolondan 13 mL yağ geri kazanmayı başardı (Şekil 3).

Şekil 3: Bir kum paketi sütunu kullanılarak simüle edilmiş gelişmiş yağ geri kazanımı. Hem kontrol hem de test kolonunun ilk yağ doygunluk hacmi yaklaşık 33 mL idi. İkincil yağ geri kazanımı sırasında, hem kontrol hem de test kolonlarından yaklaşık 10 mL yağ geri kazanıldı. Testin geri kazanım profillerindeki ve kontrol kolonlarındaki farklılıklar sadece kolonda kalan artık yağın geri kazanımı sırasında gözlenmiştir. Biyosürfaktan karışımı, test kolonundan kalan 13 mL artık yağın daha fazla geri kazanılmasıyla sonuçlanırken, kontrol kolonunda bu adımda sadece 1.03 mL yağ geri kazanıldı. Bu, biyosürfaktan karışımının, rezervuarlardan kalan yağın geri kazanımını arttırmada büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu, gelişmiş petrol geri kazanımını temsil ediyordu. Bu nedenle, biyosürfaktan karışımını içeren su, artık yağın% 56.52'sini kolondan geri kazanabilmiştir (Tablo 1). Öte yandan,% 10 SDS,% 10 Ara% 80 ve% 10 saponin çözeltileri, kolondan% 85,% 68 ve% 73 artık yağ geri kazanımı sağlamıştır.

PV = tuzlu su ile ilk kolon doygunluğundan sonra belirlenen gözenek hacmi, OOIP = yerinde orijinal yağ, IOSV = ilk yağ doygunluğu hacmi, POS = Yüzde yağ doygunluğu, S_v = ikincil geri kazanım için eklenen tuzlu su hacmi, SOR = tuzlu su basmasından sonra geri kazanılan ikincil yağ, ROC = ikincil geri kazanımdan sonra sütundaki artık yağ, ROS = artık yağ doygunluğu, ROR = Biyosürfaktan taşkınından sonra geri kazanılan artık yağ, AOR = geri kazanılan ek yağ

Tablo 1: Bir kum paketi sütununda simüle edilmiş gelişmiş yağ geri kazanımı.

Şekil 4: Biyosürfaktan üretimi için tarama tahlilleri (a) Damla çökme testi: Su damlası, yağ kaplı yüzeye eklendikten sonra çökmezken, üç bakteri suşunun kimyasal yüzey aktif maddesi ve hücresiz süpernatanları damla çökmesine neden oldu. (b) Yağ yer değiştirme testi: Suyun düşmesi yağın yer değiştirmesine neden olmazken, üç bakteri suşunun kimyasal yüzey aktif maddesi ve hücresiz süpernatanları yağ katmanlarının yerini almıştır (c) Emülsiyon indeksi testi: Hücresiz süpernatanlar ve ticari yüzey aktif madde çözeltisinin hepsi kararlı bir emülsiyon indeksinin oluşmasına neden olmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Biyosürfaktan üretimi nedeniyle yüzey geriliminin azaltılması. Mikrobiyal büyüme nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalmanın belirlenmesi, mikrobiyal üyeler tarafından biyosürfaktan üretimini doğrulamıştır. Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ün büyümesi nedeniyle, ortamın yüzey gerilimi 59 mN / m'den 45 mN / m'ye düşmüştür. Paenibacillus sp. IITD 108'in büyümesi nedeniyle, ortamın yüzey gerilimi 59 mN / m'den 28 mN / m'ye düşürülmüştür.

Şekil 6: Çeşitli (a) sıcaklıklarda, (b) pH değerlerinde ve (c) tuz konsantrasyonlarında emülsiyon kararlılığı. Üç mikrobiyal suşun süpernatantları ve ticari yüzey aktif madde karışımı kullanılarak üretilen tüm emülsiyonlar, farklı çevresel koşullar altında büyük stabilite göstermektedir. Test edilen sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonu aralıklarında, belirlenen emülsiyon indeksleri benzerdi ve biyosürfaktan aşırı çevresel koşullar altında kullanılabileceğini ima eden değişen faktörlerin daha yüksek değerlerinde EI'de önemli bir azalma gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Biyosürfaktanların TLC karakterizasyonu (a) İyot buharı ile boyanmış plakalar: TLC plakası üzerinde geliştirilen çeşitli noktalar, ekstrakte edilen biyosürfaktanların, bir lipit grubu içeren çeşitli bileşiklerin bir karışımı olduğunu göstermektedir. Mavi okla işaretlenmiş lekeler, lipit moiety varlığı için pozitif boyanmış biyosürfaktan maddeleri temsil eder. Diğer lekeler, ham biyosürfaktan karışımında bulunan bileşiklerin geri kalanını temsil eder. (b) Ninhidrin ile boyanmış plakalar: Plakalar ninhidrin ile boyandığında mor lekeler ortaya çıkmadı. Bu, biyosürfaktan karışımında herhangi bir amino asidin bulunmadığını ve (c) Anisaldehit ile boyanmış plakaları: TLC plakasında açık yeşil ve sarı lekeler ortaya çıktı ve bunlar şeker içeren bileşikleri temsil etti. Siyah oklarla işaretlenmiş lekeler, karbonhidrat moiety'nin varlığı için pozitif boyanmış biyosürfaktanları temsil eder. Hem iyot hem de anisaldehit ile boyanan lekeler, hem lipit hem de karbonhidrat moieties içeren bileşikleri temsil eder ve muhtemelen bir glikolipid biyosürfaktan olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonu. (a) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan elde edilen biyosürfaktan FT-IR spektrumlarını temsil eder, (b) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen biyosürfaktan elde edilen biyosürfaktan elde edilen H1 NMR spektrumlarını temsil eder ve (c) Rhodococcus sp. IITD 102 ve Lysinibacillus sp. IITD 104'ten ekstrakte edilen ham biyosürfaktan maddelerin yapısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonu. (a) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktanların FT-IR spektrumlarını temsil eder, (b) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen biyosürfaktanların 1 H NMR spektrumunu temsil eder ve (c) Paenibacillus sp. IITD 108'den ekstrakte edilen ham biyosürfaktanların yapısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil S1: Farklı biyosürfaktan türlerinin yapısı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo S1: Biyosürfaktan maddelerinin su ve hidrokarbonlar arasındaki ara yüzey gerilimi (IFT) üzerine etkisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Biyoyüzey aktif maddeler, kimyasal yüzey aktif maddelere cazip alternatifler haline gelen biyolojik olarak aktif bileşenlerin en çok yönlü gruplarından biridir. Daha iyi ıslanabilirlikleri, düşük CMC'leri, çeşitlendirilmiş yapıları ve çevre dostu olmaları nedeniyle deterjan, boya, kozmetik, gıda, ilaç, tarım, petrol ve su arıtma gibi çok sayıda endüstride geniş bir uygulama alanına sahiptirler¹⁸. Bu, biyosürfaktan üretimi yapabilen daha fazla mikrobiyal suşun keşfedilmesine olan ilginin artmasına neden olmuştur. Burada, gelişmiş yağ geri kazanımı için Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktan karışımının taranması, tanımlanması ve uygulanması için yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan üretimi, damla çökmesi, yağ yayılımı, emülsiyon indeksi testi ile tarandı ve mikrobiyal büyüme nedeniyle ortamın yüzey gerilimindeki azalma ölçülerek doğrulandı. Rhodococcus'tan glikolipid biyosürfaktanlarının (rhamnolipidler ve trehalolipidler) üretimi hakkında çeşitli raporlar literatürde mevcuttur 19,20,21,22,23,24. Najafi ve ark., Paenibacillus sp. alvei ARN63^25'ten bir lipopeptid biyosürfaktan üretimini ve optimizasyonunu bildirmişlerdir. Bezza ve ark. Paenibacillus dendritiformis CN5²⁶ tarafından üretilen bir lipopeptid biyosürfaktan ile pirenin biyolojik olarak parçalandığını bildirmişlerdir. Biyosürfaktan üretimi (Lipopeptitler ve glikolipidler) Paenibacillus^{27,28,29,30,31'in} diğer suşları tarafından da bildirilmiştir. Çeşitli Lysinibacillus türlerinin biyosürfaktan^32,33,34 ürettiği bildirilmiştir. Lysinibacillus sfaericus'un hidrofobik pestisitlerin çözünmesini sağlayabilen rhamnolipid ürettiği bildirilmiştir³⁵.

Biyosürfaktan maddelerin kimyasal muadillerine göre sunduğu avantajlardan biri, aşırı çevre koşulları altında stabiliteleridir. Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktanlar, farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonları aralıkları altında stabiliteleri açısından test edildi ve bu parametrelerin aşırı değerleri altında stabil oldukları bulundu. Daha önce, Habib ve ark., farklı sıcaklık aralıklarında, pH değerlerinde ve tuz konsantrasyonlarında stabilite gösteren hidrokarbon bozunan Rhodococcus sp. tarafından üretilen bir lipopeptit bildirmiştir³⁶. İnorganik tuzların konsantrasyonundaki artışın, emülsiyonun stabilitesini arttırdığı bildirilmiştir³⁷. Kolloidlerin kümelenme veya ayrılma eğilimi, parçacık etkileşimi sırasında yer alan çekici (Van der Walls kuvvetleri) ve itici kuvvetlerin (elektrostatik kuvvetler) bir fonksiyonudur³⁸. Suya çözünen tuz kristalleri kendi elektrik yüklerini oluşturur ve iyonlar emülsiyon damlacıkları üzerine adsorbe salınır. Tuz konsantrasyonunun arttırılmasında, ikinci katmanın genişlemesi ve itilmesi azalır. Ayrıca, bir iyonun yük yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, elektrik tabakasının uzunluğu o kadar düşük olur. Böylece, Na^{2 +} gibi iki değerli katyonlar, monovalent katyonlara kıyasla daha kararlı emülsiyonların oluşumuna neden olur³⁹.

Biyosürfaktanların kimyasal yüzey aktif maddelere göre sahip olduğu bir diğer avantaj, biyolojik olarak parçalanabilir^{olmaları 40}. Zeng ve ark., sentetik yüzey aktif madde Triton X 100, lineer alkilbenzen sülfonatlar (LAS) ve rhamnolipidin bozunma kapasitelerini karşılaştırmış ve rhamnolipid biyosürfaktanının tamamen bozunduğunu, LAS ve Triton X 100'ün ise sadece kısmen^{parçalandığını} bulmuşlardır. Liu ve ark. ayrıca sentetik yüzey aktif maddeler CTAB, Triton X 100 ve SDS'nin aksine, rhamnolipidin toksisite göstermediğini ve B. subtilis ve diğer kompost mikroorganizmaları⁴² tarafından kolayca parçalanabileceğini bildirmektedir.

Her üç mikrobiyal suş tarafından üretilen biyosürfaktanların glikolipidler olduğu bulunmuştur. Rhodococcus'un daha önce çeşitli araştırma grupları^20,21,23 tarafından glikolipid ürettiği bildirilmiştir. Lysinibacillus ve Paenibacillus tarafından glikolipid biyosürfaktan üretimi ile ilgili benzer raporlar literatürde de mevcuttur^{31,32,35,43,44}. Biyosürfaktan maddelerinin kimyasal olarak tanımlanması onların rhamnolipidler olduğunu ortaya koydu. Rhamnolipidler, bir lipit zincirine bağlı bir veya iki ramnoz ünitesi içeren glikolipid biyosürfaktanlar sınıfıdır⁴⁵. Bunlar en çok çalışılan biyosürfaktan türüdür. Çeşitli mikrobiyal suşların rhamnolipidler 7,46,47,48,49 ürettiği bildirilmiştir. Rhamnolipidlerin, artık yağ 50,51,52,53'ün geri kazanımını arttırmak için yüksek potansiyel sergilediği bildirilmiştir. Çalışmamızda, Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 ve Paenibacillus sp. IITD 108 tarafından üretilen biyosürfaktanların karışımının, simüle edilmiş bir kum paketi kolon testinde artık yağın yaklaşık% 56.52'sini başarıyla geri kazandığını bulduk. Bu, biyosürfaktan karışımının, toprak rezervuarlarından artık yağın geri kazanımı için kullanılabileceğini göstermiştir. Benzer bir kum paketi testinde, Sun ve ark. biyosürfaktan artık yağın% 50'sinin geri kazanılmasında başarılı olduğunu bildirmiştir⁵⁴. Bacillus subtilis'in hücresiz suyunu içeren biyosürfaktanların da artık yağın% 33'ünün geri kazanılmasında etkili olduğu bildirilmiştir⁵⁵. Darvishi ve ark. ve Wahabi ve ark.56,57 tarafından% 27 ve% 26 -% ^36'lık artık petrol geri kazanımı da bildirilmiştir.

Rezervuarlardan kalan petrolün geri kazanımı için biyosürfaktanların ekonomik olarak değerlendirilmesi, EOR'da biyosürfaktan kullanımının ekonomik olarak uygulanabilir bir seçenek olduğunu göstermektedir. Moutinho ve ark., ticari bir biyosürfaktan (rhamnolipidler) tipik maliyetinin kg⁵⁸ başına yaklaşık 59.6 USD olduğunu bildirmiştir. Başka bir çalışmada, 28 mg / L biyosürfaktan biyosürfaktan konsantrasyonunun, artık yağ geri kazanımını arttırdığı ve 52.5^m3 ek yağ üretimine yol açtığı bildirilmiştir⁵⁹. Çalışmalar, 10 mg / L'lik biyosürfaktan konsantrasyonunun yağ geri kazanımını harekete geçirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bildirilen verilere göre, 52.5^m3 ek yağ üretmek için gereken biyosürfaktan miktarı 0.525 kg civarındadır. 52,5^m3 petrolün toplam üretim maliyeti yaklaşık 21463 ABD Dolarıdır ve bunun sadece 30 ABD Doları, biyosürfaktan üretim maliyetidir. Veriler, biyosürfaktan maddenin varil başına petrol üretimindeki yüzde maliyetinin sadece% 0.0000139 olduğunu göstermektedir.

Sonuçlarımız, biyosürfaktanların kombinasyonunun, rezervuarlardan kalan yağı geri kazanmak için verimli bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Bildiğimiz kadarıyla, bu, farklı mikrobiyal suşlar tarafından üretilen biyosürfaktan bir karışım kullanarak rezervuardan kalan yağın geri kazanımını arttırmaya yönelik ilk rapordur. Çalışmamız, biyosürfaktanların taranması, yapısal karakterizasyonu ve gelişmiş yağ geri kazanımında uygulanmasında yer alan yöntemleri açıkça tanımlamasına rağmen, çalışma, çeşitli uygulamalarda verimliliklerini etkileyen biyosürfaktanların ayrıntılı bir fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamamaktadır. Herhangi bir yüzey aktif maddenin misellerin oluşturulmasındaki etkinliğinin ölçüsü olan ve sürfaktan anlamlı kullanımı için sınırlayıcı konsantrasyonunu belirleyen kritik misel konsantrasyonu, bu çalışmada⁶⁰ belirlenmemiştir. Benzer şekilde, EOR için rezervuar koşullarında uygulanabilirliğini belirleyen biyosürfaktan termal stabilitesi de tanımlanmamıştır⁶¹. Bazı uygulamalarda biyosürfaktan maddeler antibiyofilm ajanları olarak da kullanılmaktadır. Yüzey ıslanabilirlikleri, antibiyofilm doğalarını belirlemede önemli bir rol oynar. Mevcut çalışmada yüzey ıslanabilirliği çalışmaları da yapılmamıştır⁶². Biyosürfaktanların çeşitli uygulamalarında önemli olan, biyolojik olarak parçalanabilirlikleri ve antimikrobiyal doğalarını içeren diğer fonksiyonel özellikler de bu çalışmada belirlenmemiştir^63,64. Bu nedenle, biyosürfaktan maddelerin yapısal karakterizasyonuna odaklandık. Hedef uygulamaya bağlı olarak, stabilite, biyolojik parçalanabilirlik ve antimikrobiyal aktivite gibi fonksiyonel karakterizasyon gerçekleştirilebilir.

Damla çökme tahlilinde ve yağ yayılma tahlilinde, görünürlüğü arttırmak için, biraz renge sahip bir yağ kullanmak daha iyidir. Yağ yayılma testinde, emülsiyon 24 saat sonra gözlenmelidir. Hafif köpükler, eğer oluşursa, 24 saat içinde parçalanır. Tensiyometreler çok hassas aletlerdir, bu nedenle yüzey gerilimi ölçümleri sırasında, son ölçümlerin taşınmasından kaynaklanan hataları önlemek için her ölçümden önce kap ve prob düzgün bir şekilde temizlenmelidir. Biyosürfaktan ekstraksiyonu, hücresiz süpernatana kloroform metanol karışımının eklenmesini içerir. Adım ya bir duman davlumbazında yapılmalı ya da şişe, ekstraksiyon karışımının transferinden hemen sonra alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. Bir EOR deneyinde ikincil geri kazanım sırasında, kolondan başka yağ çıkmayana kadar tuzlu su çözeltisi fazla eklenmelidir.

Yöntem, kolonlardan artık yağın geri kazanılmasında biyosürfaktan karışımının kapsamını tartışmaktadır. Süreç birçok faktöre bağlıdır. İlk kültürlerin toplandığı mikropların büyüme aşaması. Bazı biyosürfaktanların log fazında üretildiği, bazılarının ise durağan fazda üretildiği bildirilmiştir. Kültürler, biyosürfaktan üretiminin maksimuma ulaştığı belirli bir aşamada buna göre hasat edilmelidir. Biyosürfaktan tarama testleri daha az hassastır, bu nedenle tüm tahliller, belirli bir suşun biyosürfaktan üretme kabiliyeti hakkında bir sonuca varmadan önce yapılmalıdır. Biyosürfaktan saflaştırılması, ham biyosürfaktan konsantrasyonu düşükse, biyosürfaktan kimyasal karakterizasyonundan önce yapılmalıdır. Gelişmiş yağ geri kazanım deneyleri, kolonu paketlemek için kullanılan toprak türüne büyük ölçüde bağlıdır. Toprak tamamen kuru olmalı ve daha büyük granülleri ve diğer katı kirleticileri gidermek için elenmelidir. Kolonu paketlemek için kumlu toprak ve kuru bahçe toprağı (eşit oranda) karışımı tercih edilmelidir. Deney sırasında kolondan toprak sızmasını önlemek için kolon çıkışı cam yünü ve cam boncuklarla düzgün bir şekilde kapatılmalıdır.

Açıklanan yöntem, üretilen biyosürfaktan maddelerin ve bunların karışımlarının, simüle edilmiş bir kum paketi kolon deneyinde ek yağın geri kazanımındaki önemini belirlemek için yararlıdır. Farklı biyosürfaktanlar farklı özgüllüklere sahiptir, çünkü farklı fonksiyonel gruplar içerirler⁶⁵. Biyosürfaktan maddelerin bir kombinasyonu, çeşitli hidrokarbonların çözünmesini sağlayacak ve bu nedenle rezervuarlardan kalan yağ geri kazanımını artıracaktır. Açıklanan yöntem, petrol kuyularından gelişmiş petrol geri kazanımı gibi saha uygulamalarında biyosürfaktan karışımlarının potansiyelinin belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Yazarlar, finansal destek için Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı'na teşekkür eder.