تعزيز استخراج النفط باستخدام مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي

نوضح الطرق التي ينطوي عليها فحص وتحديد الميكروبات المنتجة للفاعل بالسطح الحيوي. كما يتم عرض طرق للتوصيف الكروماتوغرافي والتحديد الكيميائي للخافضات للتوتر السطحي الحيوي ، وتحديد التطبيق الصناعي للفاعل بالسطح الحيوي في تعزيز استخراج النفط المتبقي.

المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي هي مركبات نشطة على السطح قادرة على تقليل التوتر السطحي بين مرحلتين من الأقطاب المختلفة. وقد ظهرت المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي كبدائل واعدة للمواد الكيميائية الخافضة للتوتر السطحي بسبب انخفاض السمية وارتفاع قابلية التحلل البيولوجي والتوافق البيئي والتسامح مع الظروف البيئية القاسية. هنا ، نوضح الطرق المستخدمة لفحص الميكروبات القادرة على إنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. تم تحديد الميكروبات المنتجة للفاعل بالسطح الحيوي باستخدام انهيار السقوط ، وانتشار النفط ، واختبارات مؤشر المستحلب. تم التحقق من صحة إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي من خلال تحديد انخفاض التوتر السطحي للوسائط بسبب نمو الأعضاء الميكروبية. كما نصف الطرق التي ينطوي عليها توصيف وتحديد المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. تم إجراء كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة للفاعل بالسطح الحيوي المستخرج متبوعا بتلطيخ تفاضلي للألواح لتحديد طبيعة الفاعل بالسطح الحيوي. تم استخدام LCMS و ¹H NMR و FT-IR لتحديد الفاعل بالسطح الحيوي كيميائيا. كما نوضح طرق تقييم تطبيق مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المنتجة لتعزيز استخراج النفط المتبقي في عمود حزمة رملية محاكاة.

المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي هي الجزيئات الأمفيباثية النشطة على السطح التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة التي لديها القدرة على تقليل السطح والتوتر بين الوجوه بين مرحلتين¹. يحتوي الفاعل بالسطح الحيوي النموذجي على جزء محب للماء يتكون عادة من مويتي السكر أو سلسلة الببتيد أو الأحماض الأمينية المحبة للماء وجزء مسعور يتكون من سلسلة أحماض دهنية مشبعة أو غير مشبعة². نظرا لطبيعتها البرمائية ، تتجمع المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي في الواجهة بين المرحلتين وتقلل من التوتر البيني عند الحدود ، مما يسهل تشتت مرحلة واحدة إلى^{المرحلة الأخرى 1,3}. تشمل الأنواع المختلفة من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن الجليكوليبيدات التي ترتبط فيها الكربوهيدرات بالأحماض الأليفاتية طويلة السلسلة أو الهيدروكسي الأليفاتيك عبر روابط الإستر (على سبيل المثال ، rhamnolipids و trehalolipids و sophorolipids) ، lipopeptides التي ترتبط فيها الدهون بسلاسل polypeptide (على سبيل المثال ، surfactin و lichenysin) ، والمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي البوليمرية التي تتكون عادة من مجمعات بروتين السكريات (على سبيل المثال ، مستحلب ، ليبوسان ، ألاسان وليبومانان)⁴. أنواع أخرى من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة تشمل الأحماض الدهنية والدهون الفوسفاتية والدهون المحايدة والجسيمات السطحية الحيوية⁵. الفئة الأكثر دراسة من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي هي glycolipids ومن بينها تم الإبلاغ عن معظم الدراسات على rhamnolipids⁶. تحتوي Rhamnolipids على واحد أو جزيئين من الرامنوز (الذي يشكل الجزء المحب للماء) مرتبط بواحد أو جزيئين من الأحماض الدهنية طويلة السلسلة (عادة حمض الهيدروكسي ديكانويك). Rhamnolipids هي جليكوليبيدات أولية تم الإبلاغ عنها أولا من Pseudomonas aeruginosa⁷.

تكتسب المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي تركيزا متزايدا مقارنة بنظيراتها الكيميائية بسبب العديد من الخصائص الفريدة والمميزة التي تقدمها⁸. وتشمل هذه الخصائص أعلى ، وسمية أقل ، وتنوع أكبر ، وسهولة التحضير ، وقابلية أعلى للتحلل البيولوجي ، ورغوة أفضل ، والتوافق البيئي والنشاط في ظل الظروف القاسية⁹. التنوع الهيكلي للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي (الشكل S1) هو ميزة أخرى تمنحها ميزة على نظيراتها الكيميائية¹⁰. وهي عموما أكثر فعالية وكفاءة عند تركيزات أقل لأن تركيزها الحرج من الميسيلات (CMC) عادة ما يكون أقل بعدة مرات من المواد الكيميائية الخافضة للتوتر السطحي¹¹. وقد أفيد بأنها مستقرة حراريا للغاية (تصل إلى 100 درجة مئوية) ويمكن أن تتحمل درجة حموضة أعلى (تصل إلى 9) وتركيزات ملح عالية (تصل إلى 50 جم / لتر)¹² وبالتالي توفر العديد من المزايا في العمليات الصناعية ، والتي تتطلب التعرض للظروف القاسية¹³. التحلل البيولوجي وانخفاض السمية تجعلها مناسبة للتطبيقات البيئية مثل المعالجة الحيوية. بسبب المزايا التي تقدمها ، فقد تم الحصول على اهتمام متزايد في مختلف الصناعات مثل الصناعات الغذائية والزراعية والمنظفات ومستحضرات التجميل والبترول^{الصناعة 11}. كما اكتسبت المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الكثير من الاهتمام في معالجة النفط لإزالة الملوثات النفطية والملوثات السامة¹⁴.

هنا نقوم بالإبلاغ عن إنتاج وتوصيف وتطبيق المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها Rhodococcus sp. IITD102 و Lysinibacillus sp. IITD104 و Paenibacillus sp. IITD108. ويوضح الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها فحص وتوصيف وتطبيق مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي لتعزيز استخراج النفط.

الشكل 1: طريقة لتعزيز استخراج النفط باستخدام مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. يتم عرض تدفق العمل التدريجي. تم تنفيذ العمل في أربع خطوات. أولا ، تم استزراع السلالات الميكروبية وفحصها لإنتاج الفاعل بالسطح الحيوي بواسطة فحوصات مختلفة ، والتي شملت فحص انهيار السقوط ، وفحص انتشار الزيت ، وفحص مؤشر المستحلب ، وقياس التوتر السطحي. بعد ذلك ، تم استخراج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي من المرق الخالي من الخلايا وتم تحديد طبيعتها باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وتم تحديدها بشكل أكبر باستخدام LCMS و NMR و FT-IR. وفي الخطوة التالية، تم خلط المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة معا وتم تحديد إمكانات الخليط الناتج لتعزيز استخراج الزيت باستخدام تقنية عمود حزمة الرمال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم فحص هذه السلالات الميكروبية لإنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي عن طريق انهيار السقوط ، وانتشار الزيت ، وفحص مؤشر المستحلب وتحديد الحد من التوتر السطحي للوسط الخالي من الخلايا بسبب نمو الميكروبات. تم استخراج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي وتمييزها وتحديدها كيميائيا بواسطة LCMS و ¹H NMR و FT-IR. وأخيرا ، تم إعداد خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها هذه الميكروبات وتم استخدامه لاستعادة الزيت المتبقي في عمود حزمة رملية محاكاة.

توضح هذه الدراسة فقط الأساليب المستخدمة في فحص وتحديد وتوصيف هيكلي وتطبيق مزيج الفاعل بالسطح الحيوي على تعزيز استخراج النفط المتبقي. وهو لا يوفر توصيفا وظيفيا مفصلا للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها السلالات الميكروبية^15,16. يتم إجراء تجارب مختلفة مثل تحديد الميسيل الحرج ، والتحليل الحراري الوزني ، وقابلية البلل السطحي ، والتحلل البيولوجي للتوصيف الوظيفي التفصيلي لأي خافض للتوتر السطحي الحيوي. ولكن بما أن هذه الورقة هي ورقة أساليب، فإن التركيز ينصب على الفحص، والتحديد، والتوصيف الهيكلي، وتطبيق مزيج الفاعل بالسطح الحيوي على تعزيز استخراج النفط المتبقي؛ لم يتم تضمين هذه التجارب في هذه الدراسة.

1. نمو السلالات الميكروبية

1. يزن 2 غرام من مسحوق مرق لوريا ويضاف إلى 50 مل من الماء المقطر في قارورة مخروطية 250 مل. امزج المحتويات حتى يذوب المسحوق تماما وقم بتكوين الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر.
2. وبالمثل ، قم بإعداد قارورتين أخريين من 100 مل من Luria Broth ووضع سدادات قطنية على عنق القوارير.
3. قم بتغطية المقابس القطنية بورق الألومنيوم وقم بتعقيم القوارير لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لتعقيم الوسائط.
4. بعد التعقيم ، دع الوسائط تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
5. لإعداد الثقافة الأولية للسلالة ، اختر مستعمرة واحدة من صفيحة LA باستخدام حلقة التلقيح وقم بالتلقيح في أنبوب اختبار يحتوي على 5 مل من مرق لوريا المعقم.
6. احتضن أنبوب الاختبار بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة.
7. قم بتلقيح القوارير التي تحتوي على 100 مل من مرق لوريا المعقم عن طريق إضافة 1 مل من مزارع البذور المزروعة بين عشية وضحاها إلى القوارير داخل خزانة تدفق الهواء الرقائقي.
8. احتضن القوارير في حاضنة دوارة عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 7 أيام.
9. بعد الانتهاء من فترة الحضانة ، قم بحصاد القوارير ونقل مرق الثقافة إلى أنابيب الطرد المركزي. قم بالطرد المركزي للثقافة عند 4500 × g لمدة 20 دقيقة في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجات مئوية.
10. بلطف ، صب supernatant خالية من الخلايا في كوب طازج واستخدامها في فحص الفحوصات لإنتاج الفاعل بالسطح الحيوي.

2. فحوصات الفحص لإنتاج الفاعل بالسطح الحيوي

ملاحظة: في الأقسام التالية، تم استخدام الفاعل بالسطح التجاري (Saponin) كعنصر تحكم إيجابي بينما تم استخدام الماء والوسائط غير الملقحة كعنصر تحكم سلبي.

1. فحص انهيار الإسقاط
   1. خذ شريحة زجاجية نظيفة وقم بتغطية سطح الشريحة ب 200 ميكرولتر من الزيت.
   2. أضف 20 ميكرولتر من السوبرنات الخالي من الخلايا إلى وسط الزيت واتركه دون إزعاج لمدة 2-3 دقائق.
      ملاحظة: إذا انهار الانخفاض ، فقم بتسجيل الإيجابيات الفائقة لوجود الفاعل بالسطح الحيوي.
2. فحص انتشار النفط
   1. خذ 20 مل من الماء المقطر المزدوج في صفيحة بتري (قطرها 75 مم) وأضف 200 ميكرولتر من النفط الخام إلى سطح الماء.
   2. أضف 20 ميكرولتر من السوبرنات الخالي من الخلايا إلى وسط الزيت واتركه دون إزعاج لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: إذا تم تشكيل منطقة تطهير بسبب إزاحة النفط ، فقم بتسجيل إيجابية supernatant لوجود الفاعل بالسطح الحيوي.
3. فحص مؤشر المستحلب (E₂₄ فحص)
   1. أضف 4 مل من البنزين (البنزين) والسوبر نات الخالي من الخلايا إلى أنبوب اختبار زجاجي نظيف.
   2. دوامة الخليط بقوة لمدة 3 دقائق وتركه دون إزعاج لمدة 24 ساعة القادمة.
   3. بعد 24 ساعة، حدد مؤشر E₂₄ كنسبة مئوية من ارتفاع الطبقة المستحلبة (سم) فيما يتعلق بارتفاع العمود السائل بأكمله (سم).
      
      ملاحظة: إذا لوحظ مستحلب (زيت في الماء أو ماء في زيت) بعد 24 ساعة ، فمن المحتمل أن يحتوي supernatant على الفاعل بالسطح الحيوي.
4. قياس التوتر السطحي
   ملاحظة: تم قياس التوتر السطحي باستخدام طريقة حلقة دو نوي¹⁷. الأداة المستخدمة في هذه التجربة (انظر جدول المواد) حساسة للغاية ، لذلك تأكد من التنظيف السليم للوعاء الزجاجي والمسبار.
   1. قم بتشغيل النظام وانقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج المرتبط به لفتحه.
   2. نظف الوعاء الزجاجي بالسائل الذي سيتم تحديد توتره السطحي.
   3. أضف السائل (40 مل) إلى الوعاء وقم بتركيب الوعاء على حامل السفينة.
   4. افتح حامل المسبار وقم بتركيب المسبار عليه. الآن قم بقفل حامل المسبار عن طريق الضغط على زر القفل الموجود على وحدة التحكم اليدوية.
   5. باستخدام وحدة التحكم اليدوية ، اضبط ارتفاع المنصة بحيث يكون المسبار على بعد حوالي 2-3 مم من سطح السائل.
   6. الآن استخدم البرنامج لقياس التوتر السطحي. انقر فوق ملف موجود في اللوحة العلوية اليسرى من الشاشة. انقر فوق فتح مساحة العمل. ستظهر نافذة منبثقة.
   7. قم بالتمرير لأسفل وانقر نقرا مزدوجا فوق رمز التوتر السطحي والبيني K100: Surface and Interface .
   8. الآن ، انقر فوق رمز الملف الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة. انقر على قاعدة بيانات جديدة. أدخل الاسم لحفظ البيانات وانقر على موافق.
   9. مرة أخرى ، انقر فوق ملف > قياس جديد > SFT > Ring. أدخل اسم القياس. تأكد من أن قالب التكوين يعرض حلقة SFT.
   10. املأ التفاصيل في نافذة تكوين القياس عن طريق تحديد المسبار والوعاء المستخدم للقياس. أيضا ، املأ تفاصيل السائل ومرحلة الغاز.
       ملاحظة: ستكون المرحلة السائلة هي الماء، في حين أن المرحلة الغازية ستكون الهواء. كثافة الطور السائل هي كثافة السوبرناتانت الحر الخلوي. يمكن تحديد ذلك عن طريق أخذ وزن 50 مل من السائل وحساب الكثافة ك كجم / م³.
   11. الآن انقر فوق علامة التبويب الإجراء واملأ التفاصيل التالية: سرعة الكشف: 6 مم / دقيقة ، حساسية الكشف: 0.005 جم ، سرعة البحث: 6 مم / دقيقة ، حساسية البحث: 0.005 جم ، سرعة القياس: 3 مم / دقيقة ، حساسية القياس: 0.001 جم ، عمق الغمر: 3 مم ، مسافة العودة: 10٪ ، التصحيح: Harkins & Jordan ، القيم القصوى: 5. انقر فوق موافق.
   12. في النافذة المنبثقة ، حدد قاعدة البيانات لتخزين البيانات وانقر فوق موافق.
       ملاحظة: يمكن للمرء إنشاء قاعدة بيانات جديدة هنا أو إضافة قياسات جديدة إلى البيانات الموجودة.
   13. الآن انقر على زر التشغيل الموجود في أعلى وسط الشاشة. سيبدأ النظام في تنفيذ البرنامج النصي. بعد استقرار النظام ، سيكتشف السطح. اغمر المسبار في السائل ، وحرك المسبار ذهابا وإيابا واكتشف التوتر في الصفيحة المشكلة.
   14. للحصول على النتائج ، انقر فوق رمز القياس في الجانب الأوسط الأيسر من الشاشة. انقر على البيانات ولاحظ أسفل التوتر السطحي المحدد.
   15. بعد الانتهاء من القياس ، قم بخفض ارتفاع المنصة وفتح وإلغاء تثبيت المسبار والسفينة من الجهاز.
       ملاحظة: لتحديد الانخفاض في التوتر السطحي بسبب إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي ، يجب استخدام LB غير الملقح كعنصر تحكم.

3. استخراج الفاعل بالسطح الحيوي

1. اضبط الرقم الهيدروجيني للسوبرناتانت الخالي من الخلايا إلى 2 باستخدام 2 N HCl. قم بتخزين الخليط عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
2. أضف كمية متساوية من خليط الكلوروفورم والميثانول (2: 1) إلى المادة الفائقة واخلطها بقوة لمدة 20 دقيقة.
3. اترك الخليط دون إزعاج حتى يحدث فصل الطور.
4. قم بإزالة المرحلة العليا التي تحتوي على الماء والميثانول واترك المرحلة السفلية التي تحتوي على الفاعل بالسطح الحيوي لتتبخر في غطاء الدخان.
5. بعد تبخر المرحلة العضوية ، أعد إذابة الفاعل بالسطح الحيوي الخام بلون العسل في 3 مل من الكلوروفورم واستخدم هذا الخليط لمزيد من التحديد والتوصيف للفاعل بالسطح الحيوي.

4. دراسات استقرار المستحلب

1. استقرار المستحلب عند درجات حرارة مختلفة
   1. خذ 5 مل من المواد الفائقة الخالية من الخلايا في أنابيب اختبار مختلفة.
   2. أضف 5 مل من البنزين إلى كل أنبوب اختبار واخلطه بقوة عن طريق الدوامة لمدة 3 دقائق.
   3. احتضان أنابيب الاختبار بين عشية وضحاها في حمامات مائية مختلفة في درجات حرارة مختلفة (30 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 70 درجة مئوية).
   4. بعد 24 ساعة ، قم بتقدير مؤشرات المستحلب كما ذكرنا سابقا.
2. استقرار المستحلب عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة
   1. خذ 5 مل من supernatant خالية من الخلايا في أنابيب اختبار نظيفة.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني للسوبرناتات الخالية من الخلايا (2 و 4 و 6 و 8 و 10) باستخدام 1 N HCl و 1 N NaOH.
   3. أضف كمية متساوية من البنزين إلى أنابيب الاختبار واخلطها بقوة عن طريق الدوامة لمدة 3 دقائق.
   4. اترك أنابيب الاختبار دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
   5. تقدير مؤشر المستحلب كما ذكر سابقا.
3. استقرار المستحلب عند تركيزات الملح المختلفة
   1. خذ 5 مل من supernatant خالية من الخلايا في أنابيب اختبار نظيفة.
   2. أضف كميات مختلفة من الملح (كلوريد الصوديوم) إلى المواد الفائقة (0 جم / لتر ، 5 جم / لتر ، 10 جم / لتر ، 20 جم / لتر ، 60 جم / لتر و 80 جم / لتر).
   3. قم بإذابة الأملاح في السوبرناتات الخالية من الخلايا عن طريق الدوامة لمدة 3 دقائق.
   4. أضف كمية متساوية من البنزين إلى أنابيب الاختبار واخلطها بقوة عن طريق الدوامة لمدة 3 دقائق.
   5. اترك أنابيب الاختبار دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
   6. تقدير مؤشر المستحلب بعد 24 ساعة.

5. تحديد طبيعة الفاعل بالسطح الحيوي

1. TLC من الفاعل بالسطح الحيوي المستخرج
   1. بقعة 20 ميكرولتر من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي على لوحات TLC. بقعة 2 ميكرولتر في وقت واحد.
   2. حدد المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي على ثلاث لوحات TLC مختلفة.
   3. تحضير خليط 100 مل من الشفاف الذي يحتوي على الكلوروفورم: الميثانول (2: 1) وإضافة العطر إلى غرفة TLC. أغلق غطاء الغرفة واتركه يشبع لمدة 20 دقيقة.
   4. بعد تجفيف الألواح ، ضع ألواح TLC داخل الغرفة المشبعة بخليط الميثانول الكلوروفورم وقم بتشغيل TLC.
   5. بعد أن يصل اللونت إلى الجزء العلوي من لوحة TLC (على بعد 1 سم من الأعلى) ، أخرج الألواح واتركها تجف في الهواء.
2. تلطيخ للكشف عن الدهون
   1. خذ غرفة TLC نظيفة وأضف بعض (5-10) حبيبات من اليود إلى الغرفة الطازجة وتشبع الغرفة لمدة 5 إلى 10 دقائق.
   2. ضع لوحة TLC داخل الغرفة وراقب تطور البقع الصفراء. إذا ظهرت البقع ، سجل الفاعل بالسطح الحيوي إيجابيا لوجود مكون الدهون.
3. تلطيخ للكشف عن الببتيد أو الأحماض الأمينية
   1. تحضير محلول النينهيدرين عن طريق إذابة 0.4 غرام من النينهيدرين في 20 مل من البيوتانول. أضف 0.6 مل من حمض الخليك الجليدي 100٪ إلى الخليط.
   2. رش لوحة TLC بمحلول النينهيدرين واتركها تجف في الهواء لمدة 2 دقيقة. تسخين اللوحة عند 110 درجة مئوية ومراقبة تطور اللون.
      ملاحظة: إذا ظهرت البقع الزرقاء ، فقم بتسجيل الفاعل بالسطح الحيوي إيجابيا لوجود أي سلسلة ببتيد أو حمض أميني.
4. تلطيخ للكشف عن الكربوهيدرات
   1. تحضير محلول p-anisaldehyde عن طريق إضافة 2 مل من p-anisaldehyde إلى 48 مل من حمض الخليك الجليدي الذي يحتوي على 1 مل من H₂SO₄. أضف 0.6 مل من حمض الخليك إلى الخليط.
   2. رش الخليط بالتساوي على طبق TLC واتركه يجف في الهواء لمدة 2 دقيقة.
   3. احتضان اللوحة عند 110 درجة مئوية ومراقبة تطور البقع.
      ملاحظة: إذا ظهرت البقع الخضراء أو البنية ، فقم بتسجيل الفاعل بالسطح الحيوي إيجابيا لوجود أي كربوهيدرات.

6. التحديد الكيميائي للفاعل بالسطح الحيوي

1. LCMS من الفاعل بالسطح الحيوي
   1. يذوب 25 ملغ من الفاعل بالسطح الحيوي المستخرج في 1 مل من الكلوروفورم.
   2. قم بإجراء LCMS (في تكوين رذاذ القفل بتردد مسح مرجعي يبلغ 10 ثوان) باستخدام عمود C18.
   3. استخدم الكلوروفورم: الميثانول (1:1) كطور متحرك وحقن 2 ميكرولتر من العينة في العمود بمعدل تدفق 0.1 مل / دقيقة.
   4. اضبط المعلمات التجريبية على: القطبية: ES إيجابي ، الجهد الشعري: 3 كيلو فولت ، درجة حرارة المصدر: 80 درجة مئوية ، درجة حرارة الذوبان: 300 درجة مئوية ، معدل تدفق غاز الإذابة: 7000 لتر / ساعة ، ومعدل تدفق غاز الفخ: 0.40 مل / دقيقة.
   5. امسح النطاقات من 100 إلى 1200 Da خلال وقت اكتشاف مدته 20 دقيقة وامسح الأيونات في وضع ES الموجب.
   6. تحليل قيم m/z باستخدام أي برنامج لقياس الطيف الكتلي كميا.
   7. للتحليل، قم بتسجيل الدخول إلى البرنامج.
   8. انقر فوق البحث الدفعي وأدخل قائمة الجماهير التي تم الحصول عليها. امسح النتائج في وضع الشحنة الموجبة واستخدم M + H و M + Na كإضافات. حافظ على الدقة حتى 10 صفحات في الدقيقة وحدد بنية الشاشة.
   9. انقر فوق بحث ومن قائمة المركبات ، حدد المركب الذي يحتوي على أدنى مستوى PPM.
2. ¹ H NMR من الفاعل بالسطح الحيوي
   ملاحظة: أجري الرنين المغناطيسي النووي ^{H 1}H للفاعل بالسطح الحيوي باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي 400 ميغاهرتز (انظر جدول المواد).
   1. إذابة 5 ملغ من الفاعل بالسطح الحيوي في 1 مل من الكلوروفورم المثني (CdCl₃).
   2. انقل الخليط إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. قم بتغطية الأنبوب بشكل صحيح وأدخل الأنبوب في مفتاح الربط. اضبط ارتفاع الأنبوب باستخدام أنبوب الضبط.
   3. ضع الأنبوب مع مفتاح الربط في جهاز الرنين المغناطيسي النووي واتبع الخطوات المذكورة أدناه للحصول على طيف الرنين المغناطيسي النووي.
   4. لتحديد نوع أنبوب العينة: sx N، حيث N هو الموضع الذي تم فيه وضع الأنبوب (على سبيل المثال، sx 13، إذا تم وضع الأنبوب في^الموضع 13) في البرامج المرتبطة به.
   5. اكتب edc واضغط على Enter لإنشاء مجلد جديد حيث يمكن تخزين البيانات.
   6. ستظهر نافذة منبثقة. حدد المذيب بالنقر فوق CdCl ₃ في القائمة وأدخل اسم العينة.
   7. لبدء البروتوكول ، اكتب "getprosol" ؛ لقفل المذيب، اكتب "قفل cdcl3".
   8. اكتب "topshim" لمسح العينة ، وأخيرا اكتب "rga ؛ zgefp" للحصول على البيانات. سيؤدي ذلك إلى بدء تشغيل البروتوكول.
   9. بعد الحصول على الأطياف، اكتب "apk;abs n" واضغط على Enter لتصحيح الطور وخط الأساس.
   10. لتحديد القمم الأساسية، اكتب "pp" واضغط على Enter. لتحديد القمم المكثفة فقط، أدخل "mi" واكتب الكثافة التي يجب تحديد القمم فوقها. ستكون القيمة الافتراضية 0.2.
   11. لدمج القمم ، انقر فوق دمج وضع المؤشر على الجانب الأيسر من الذروة المراد دمجها وأثناء الضغط على المؤشر ، انقر واسحب المؤشر حول الذروة.
   12. احفظ البيانات بالنقر فوق ملف في الزاوية العلوية اليسرى ، ثم انقر فوق حفظ.
   13. يمكن إخراج العينة من الجهاز عن طريق كتابة "sx ej".
   14. تحليل القمم وتحديد بيئة ذرات H.
3. فورييه تحويل التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء للفاعل بالسطح الحيوي
   ملاحظة: تم إجراء FT-IR للفاعل بالسطح الحيوي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي المتاح تجاريا في وضع ATR (انظر جدول المواد).
   1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي وتحقق من التطهير والمجفف والكاشف.
   2. لجمع طيف ، قم أولا بجمع طيف الخلفية دون وجود عينة في مكانها.
   3. خذ الفاعل بالسطح الحيوي المستخرج وجففه تماما. ضع الفاعل بالسطح الحيوي المجفف مباشرة فوق كريستال الماس ، واضغط على نقطة اللمس ATR.
   4. في البرنامج ، حدد عدد عمليات الفحص (أدخل 30) وامسح الطيف من 400 سم - 1 إلى 4000 سم ^{- 1}.
   5. انقر فوق موافق لإضافة طيف العينة إلى النافذة الطيفية.
   6. انقر فوق الملفات > حفظ > حفظ باسم وأدخل اسم الملف متبوعا بامتبعا بالامتداد .spa وانقر فوق موافق.

7. تطبيق الفاعل بالسطح الحيوي (تعزيز استخراج النفط)

ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام الماء المقطر المزدوج كعنصر تحكم سلبي وتم استخدام 10٪ SDS و 10٪ Tween 80 و 10٪ saponin التجاري كعناصر تحكم إيجابية.

1. خذ الزجاج وأغلق المخرج السفلي بالصوف الزجاجي والخرز الزجاجي.
2. قم بتعبئة العمود بالتربة الرملية بطريقة يمكن من خلالها إضافة بعض السائل في الجزء العلوي من التربة ويمكن جمع التدفق من خلاله في الأسفل. قم بتركيب العمود على الحامل وأضف بعض الخرز الزجاجي فوق التربة.
3. قم بإغراق العمود ب 50 مل من محلول ملحي وجمع التدفق لتحديد حجم المسام.
   حجم المسام = حجم المحلول الملحي المضاف في الأعلى - حجم التدفق الذي تم جمعه.
4. قم بإزالة المحلول الملحي من العمود عن طريق إجبار النفط الخام على المرور عبره بعد إضافته من أعلى العمود. اجمع حجم المحلول الملحي والزيت الخارج من العمود لتحديد حجم تشبع الزيت الأولي. سيكون حجم المحلول الملحي المنبعث من العمود هو حجم تشبع الزيت الأولي أو الزيت الأصلي في مكانه.
5. اترك العمود دون إزعاج لمدة 24 ساعة.
6. بعد 24 ساعة ، قم بإغراق العمود ب 10 أحجام من المسام من المحلول الملحي وجمع الزيت الخارج من العمود لتقدير استخراج النفط الثانوي. النفط المتبقي في العمود بعد استرداد الزيت الثانوي يتوافق مع الزيت المتبقي.
7. تحضير خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي عن طريق إضافة كميات متساوية من الفاعل بالسطح الحيوي المستخرج (المستخرج بعد الخطوة 3.5) إلى الكأس الزجاجي. أضف المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي إلى أعلى العمود واحتضن العمود لمدة 24 ساعة.
8. بعد 24 ساعة، قم بقياس كمية الزيت والماء لتحديد استخلاص الزيت الإضافي أو المعزز. سوف يتوافق حجم النفط المنبعث من العمود مع النفط المتبقي المسترد.
9. تقدير الاستخلاص المعزز للنفط بالمعادلة التالية:
   

تم فحص ثلاث سلالات بكتيرية (Rhodococcus sp. IITD102 ، Lysinibacillus sp. IITD104 ، و Paenibacillus sp. IITD108) لإنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بواسطة فحوصات مختلفة ، والتي شملت فحص انهيار السقوط ، وفحص إزاحة الزيت ، وفحص مؤشر المستحلب ، والحد من التوتر السطحي. أدت المواد الفائقة الخالية من الخلايا لجميع السلالات البكتيرية الثلاث ومحلول من الفاعل بالسطح الكيميائي إلى انهيار قطرة ، وبالتالي ، تم تسجيلها إيجابية لوجود المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي (الشكل 4 أ). من ناحية أخرى ، لم تنهار قطرة الماء ، وبالتالي تم تسجيلها سلبية لوجود الفاعل بالسطح الحيوي. كما نجح الفاعل بالسطح التجاري والمواد الخارقة الخالية من الخلايا في الثقافات البكتيرية الثلاث في إزاحة طبقة الزيت في مقايسة نشر الزيت ، وبالتالي ، تم تسجيلها بشكل إيجابي لوجود الفاعل بالسطح الحيوي (الشكل 4 ب). الماء ، من ناحية أخرى ، لا يمكن أن يحل محل أي نفط ، وبالتالي ، تم تسجيله سلبيا. في مقايسات مؤشر المستحلب ، لوحظ مستحلب مستقر في أنابيب الاختبار التي تحتوي على الفاعل بالسطح التجاري والمواد الفائقة للسلالات الميكروبية الثلاثة. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي مستحلب في أنبوب الاختبار الذي يحتوي على وسط استزراع غير ملقح (الشكل 4 ج). هذا يشير مرة أخرى إلى أن Rhodococcus sp. IITD102 و Lysinibacillus sp. IITD104 و Paenibacillus sp. IITD108 تنتج مواد خافضة للتوتر السطحي الحيوي. تم الحصول على تأكيد إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي عن طريق قياس التوتر السطحي للمرق الخالي من الخلايا ومقارنته بالتحكم غير الملقح. تم العثور على المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي من Rhodococcus sp. IITD102 و Lysinibacillus sp. IITD104 و Paenibacillus sp. IITD108 لتقليل التوتر السطحي للوسط من 58.89 mN / m إلى 45.41 mN / m و 45.82 mN / m و 28.43 mN / m ، على التوالي (الشكل 5).

تم إجراء قياسات IFT باستخدام طريقة سحب الحلقة. وكانت المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي من جميع السلالات الثلاث قادرة على الحد بشكل كبير من التوترات البينية بين مختلف المراحل المائية والعضوية (الجدول S1). يؤكد التوتر السطحي وقياسات التوتر بين الوجوه أن جميع السلالات الثلاث تنتج مواد فاعلة بالسطح حيوية.

أدى استخراج المذيبات من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي من الثقافات الخالية من الخلايا في Rhodococcus sp. IITD102 و Lysinibacillus sp. IITD104 و Paenibacillus sp. IITD108 إلى تركيزات من الفاعل بالسطح الحيوي من 820 ملغ / لتر ، 560 ملغ / لتر ، و 480 ملغ / لتر ، على التوالي.

وكما لوحظ في الشكل 4C، فإن المستحلب الذي شكله الفاعل بالسطح الحيوي كان الماء في مستحلب الزيت الدقيق. أظهرت اختبارات استقرار المستحلب أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي أظهرت استقرارا جيدا في ظل ظروف بيئية متنوعة (الشكل 6). كانت المستحلبات المنتجة مستقرة للغاية عبر درجات حرارة متنوعة (الشكل 6 أ) ، وقيم الأس الهيدروجيني (الشكل 6 ب) ، وتركيزات الملح (الشكل 6 ج) التي تم اختبارها.

تم إجراء كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة لتحديد طبيعة المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. أدى تلطيخ الألواح ببخار اليود إلى ظهور بقع صفراء في جميع المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي والمكافحة (الفاعل بالسطح الحيوي من Bacillus sp. IITD 106 (الشكل 7 أ). هذا يشير إلى أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي تحتوي على مويتي دهني. لم يتم الحصول على بقع زرقاء اللون في أي من لوحات TLC عند تلطيخ النينهيدرين (الشكل 7 ب). وأظهر ذلك أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي لا تحتوي على أي ببتيد مويتي. لوحظت بقع زرقاء وخضراء في جميع لوحات TLC ، عندما كانت ملطخة ببقع أنيسالدهيد (الشكل 7 ج). أظهر هذا أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي تحتوي على مويتي الكربوهيدرات. من نتائج TLC ، تم التوصل إلى أن جميع المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي كانت جليكوليبيدات.

كشف التحديد الكيميائي للخافضات للتوتر السطحي الحيوي باستخدام LCMS أن Rhodococcus sp. IITD102 ، و Lysinibacillus sp. IITD104 ينتجان نفس النوع من الفاعل بالسطح الحيوي ، الذي تم تحديده على أنه حمض الهيدروكسي ديكانويك Di-rhamnopyranosic بكتلة 480.25 Da. تم دعم بنية الفاعل بالسطح الحيوي من خلال بيانات ¹H NMR و FT-IR (الشكل 8).

في طيف الرنين المغناطيسي النووي H ^{1 H}، مثلت التحولات الكيميائية التي تم الحصول عليها عند 7.2 بروتونات المجموعات الكربوكسيلية. تم الحصول على التحولات الكيميائية المقابلة لبروتونات مجموعة الميثيل في نطاق 1-2 جزء في المليون. تم الحصول على التحولات المقابلة للبروتونات المرتبطة بمجموعات الألكيل عند 2.3 جزء في المليون. أظهرت أطياف FT-IR للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من Rhodococcus sp. IITD102 و Lysinibacillus sp. IITD104 وجود قمم قوية عند رقم الموجة 3,290 ^cm-1 ، مما يؤكد وجود المجموعة الوظيفية OH. قمة صغيرة عند رقم الموجة 2,951 ^cm-1 تتوافق مع تمدد CH. تمثل الذروة القوية عند 1,620 ^cm-1 وجود مجموعة كربوكسيلية في المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. أكدت القمم الأخرى التي تم الحصول عليها عند 1,530 و 1,410 و 1,200 و 1,060 وجود مجموعات وظيفية من الألكيل و CH 3 و C-O-C و C-CH₃ ، على التوالي. دعمت كل من بيانات NMR و FT-IR بنية الفاعل بالسطح الحيوي المحددة من دراسات LCMS. أظهر LCMS من الفاعل بالسطح الحيوي الخام من Paenibacillus sp. IITD108 (الشكل 9) أنه ينتج رامنوليبيد يحتوي على ثلاث سلاسل دهنية تشكل النواة السائبة الكارهة للماء للفاعل بالسطح الحيوي. تم تحديد الفاعل بالسطح الحيوي على أنه 2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroxydecanoic acid بكتلة 802 Da. تم دعم نتائج LCMS بواسطة ^{بيانات 1}H NMR و FT-IR.

ويبين الشكل 2 الإعداد اللازم لتعزيز استخراج النفط.

الشكل 2: إعداد تجريبي لتعزيز استخراج الزيت باستخدام تقنية عمود حزمة الرمال. تم تركيب العمود المعبأ بالتربة على الحامل. تم إغلاق المخرج السفلي بالصوف الزجاجي والخرز الزجاجي. بعد الاسترداد الثانوي ، تعرض الزيت المتبقي داخل العمود لاستعادة الزيت المعزز بإضافة خليط الفاعل بالسطح الحيوي إليه. تم استخدام الأنبوب الموضوع في أسفل العمود لجمع الكسر المنحرف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في تجربة محاكاة استخراج النفط المعزز ، من أصل 50 مل من المحلول الملحي المضاف إلى أعلى العمود ، تم جمع 12 مل في التدفق ، وبالتالي ، قدر حجم المسام ب 38 مل. عندما تم إجبار النفط من خلال العمود ، تم إطلاق 33 مل من محلول ملحي من العمود. وهذا يمثل حجم تشبع الزيت الأولي. أدى الاسترداد الثانوي باستخدام 10 أحجام من المسام من محلول ملحي إلى إزالة 10 مل من الزيت. كان الزيت المتبقي في العمود 23 مل. تمكنت المياه التي تحتوي على خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي من استعادة 13 مل من الزيت من العمود (الشكل 3).

الشكل 3: محاكاة الاستخلاص المعزز للنفط باستخدام عمود حزمة رملية. كان حجم تشبع الزيت الأولي لكل من عمود التحكم والاختبار حوالي 33 مل. أثناء استخراج الزيت الثانوي ، تم استرداد حوالي 10 مل من الزيت من كل من أعمدة التحكم والاختبار. لوحظت الاختلافات في ملامح الاسترداد للاختبار وأعمدة التحكم فقط أثناء استرداد الزيت المتبقي المتبقي في العمود. وأدى خليط الفاعل بالسطح الحيوي إلى مزيد من الاسترداد ل 13 مل من الزيت المتبقي من عمود الاختبار بينما في عمود التحكم تم استرداد 1.03 مل فقط من الزيت في هذه الخطوة. وهذا يدل على أن خليط الفاعل بالسطح الحيوي لديه إمكانات كبيرة في تعزيز استعادة النفط المتبقي من المكامن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمثل ذلك استخلاصا معززا للنفط. لذلك ، كانت المياه التي تحتوي على خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي قادرة على استعادة 56.52٪ من الزيت المتبقي من العمود (الجدول 1). من ناحية أخرى ، تمكنت حلول 10٪ SDS و 10٪ Tween 80 و 10٪ saponin من استرداد 85٪ و 68٪ و 73٪ من الزيت المتبقي من العمود.

حيث PV = حجم المسام المحدد بعد تشبع العمود الأولي بالمحلول الملحي ، OOIP = الزيت الأصلي في مكانه ، IOSV = حجم تشبع الزيت الأولي ، POS = النسبة المئوية لتشبع الزيت ، S_v = حجم المحلول الملحي المضاف للاسترداد الثانوي ، SOR = الزيت الثانوي المستعاد بعد فيضان المحلول الملحي ، ROC = الزيت المتبقي في العمود بعد الاسترداد الثانوي ، ROS = تشبع الزيت المتبقي ، ROR = الزيت المتبقي المستعاد بعد الفيضانات السطحية الحيوية ، AOR = النفط الإضافي المسترد

الجدول 1: محاكاة الاستخلاص المعزز للنفط في عمود حزمة رملية.

الشكل 4: فحوصات الفحص لإنتاج الفاعل بالسطح الحيوي (أ) فحص انهيار القطرة: لم تنهار قطرة الماء بعد إضافتها إلى السطح المطلي بالزيت بينما أدت المواد الكيميائية الخافضة للتوتر السطحي والمواد الفائقة الخالية من الخلايا من السلالات البكتيرية الثلاث إلى انهيار السقوط. (ب) فحص إزاحة الزيت: لم تؤد قطرة الماء إلى إزاحة الزيت في حين أن المواد الكيميائية الخافضة للتوتر السطحي والسطحي الخالي من الخلايا من السلالات البكتيرية الثلاث أزاحت طبقات الزيت (ج) مقايسة مؤشر المستحلب: أدت المواد الخارقة الخالية من الخلايا والمحلول التجاري الخافض للتوتر السطحي إلى تكوين مؤشر مستحلب مستقر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: خفض التوتر السطحي بسبب إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي. أكد تحديد انخفاض التوتر السطحي للوسط بسبب النمو الميكروبي إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي من قبل الأعضاء الميكروبيين. بسبب نمو Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104 ، انخفض التوتر السطحي للوسط من 59 mN / m إلى 45 mN / m. بسبب نمو Paenibacillus sp. IITD 108 ، انخفض التوتر السطحي للوسط من 59 mN / m إلى 28 mN / m. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استقرار المستحلب عند درجات حرارة مختلفة (أ) و (ب) قيم الأس الهيدروجيني و (ج) تركيزات الملح. تظهر جميع المستحلبات المتولدة باستخدام المواد الفائقة للسلالات الميكروبية الثلاث وخليط الفاعل بالسطح التجاري استقرارا كبيرا في ظل ظروف بيئية مختلفة. ضمن نطاقات درجة الحرارة ودرجة الحموضة وتركيز الملح التي تم اختبارها ، كانت مؤشرات المستحلب المحددة متشابهة ولم يلاحظ أي انخفاض كبير في EI عند قيم أعلى من العوامل المختلفة التي تشير إلى أنه يمكن استخدام الفاعل بالسطح الحيوي في ظل الظروف البيئية القاسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: توصيف TLC للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي (أ) الألواح الملطخة ببخار اليود: تظهر البقع المختلفة التي تم تطويرها على لوحة TLC أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة هي خليط من مركبات مختلفة تحتوي على مجموعة دهنية. تمثل البقع المميزة بالسهم الأزرق المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي ، والتي لطخت إيجابية لوجود الدهون moiety. تمثل البقع الأخرى بقية المركبات الموجودة في خليط الفاعل بالسطح الحيوي الخام. (ب) اللوحات الملطخة بالنينهيدرين: لم تظهر بقع أرجوانية عندما كانت الألواح ملطخة بالنينهيدرين. هذا يمثل عدم وجود أي أحماض أمينية في خليط الفاعل بالسطح الحيوي و (ج) لوحات ملطخة بأنيسالدهيد: ظهرت بقع خضراء وصفراء فاتحة على لوحة TLC وهذه تمثل المركبات التي تحتوي على السكريات. تمثل البقع المميزة بالأسهم السوداء المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي لطخت بشكل إيجابي لوجود مويتي الكربوهيدرات. تمثل البقع الملطخة بكل من اليود والأنيسالدهيد مركبات تحتوي على كل من الدهون والكربوهيدرات ويمكن أن تكون خافض للتوتر السطحي الحيوي جليكوليبيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: التوصيف الكيميائي للفاعل بالسطح الحيوي المستخرج من Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104. (أ) تمثل أطياف FT-IR للمواد الخافضة للتوتر السطحي الأحيائي المستخرجة من Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104 ، (ب) تمثل أطياف H¹ NMR للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104 ، و (ج) توضح بنية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الخام المستخرجة من Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: التوصيف الكيميائي للفاعل بالسطح الحيوي المستخرج من Paenibacillus sp. IITD 108. (أ) تمثل أطياف FT-IR للمواد الخافضة للتوتر السطحي الأحيائي المستخرجة من Paenibacillus sp. IITD 108 ، (ب) تمثل أطياف ^الرنينالمغناطيسي النووي 1 H للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من Paenibacillus sp. IITD 108 ، و (ج) تبين بنية المواد البيوستانفترية السطحية الخام المستخرجة من Paenibacillus sp. IITD 108. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: بنية أنواع مختلفة من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول S1: تأثير المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي على التوتر البيني بين الماء والهيدروكربونات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي هي واحدة من المجموعة الأكثر تنوعا من المكونات النشطة بيولوجيا التي أصبحت بدائل جذابة للخافضات للتوتر السطحي الكيميائية. لديهم مجموعة واسعة من التطبيقات في العديد من الصناعات مثل المنظفات والدهانات ومستحضرات التجميل والمواد الغذائية والمستحضرات الصيدلانية والزراعة والبترول ومعالجة المياه بسبب قدرتها على البلل بشكل أفضل ، وانخفاض CMC ، والهيكل المتنوع ، والود البيئي¹⁸. وقد أدى ذلك إلى زيادة الاهتمام باكتشاف المزيد من السلالات الميكروبية القادرة على إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي. هنا ، نوضح طرق فحص وتحديد وتطبيق خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104 و Paenibacillus sp. IITD 108 ، لتعزيز استخراج النفط. تم فحص إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي عن طريق انهيار الانخفاض ، وانتشار النفط ، وفحص مؤشر المستحلب وتأكيده عن طريق قياس الانخفاض في التوتر السطحي للوسط بسبب النمو الميكروبي. تتوفر تقارير مختلفة عن إنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الجليكوليبيد (rhamnolipids و trehalolipids) من Rhodococcus في الأدبيات¹⁹،²⁰،²¹،²²،^23،24. أبلغ نجفي وآخرون عن إنتاج وتحسين الفاعل بالسطح الحيوي ليبوببتيد من Paenibacillus sp. alvei ARN63²⁵. أبلغ بيزا وآخرون عن التحلل البيولوجي للبيرين بواسطة خافض للتوتر السطحي الحيوي ليبوببتيد الذي تنتجه Paenibacillus dendritiformis CN5²⁶. كما تم الإبلاغ عن إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي (ليبوببتيدات وغليكوليبيدس) من قبل سلالات أخرى من Paenibacillus²⁷،²⁸،²⁹،^30،31. تم الإبلاغ عن أنواع مختلفة من Lysinibacillus لإنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي³²،^33،34. تم الإبلاغ عن أن Lysinibacillus sphaericus ينتج رامنوليبيد قادر على إذابة مبيدات الآفات الكارهة للماء³⁵.

واحدة من المزايا التي تقدمها المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي على نظيراتها الكيميائية هي استقرارها في ظل الظروف البيئية القاسية. تم فحص المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها Rhodococcus sp. IITD 102 و Lysinibacillus sp. IITD 104 و Paenibacillus sp. IITD 108 لاستقرارها تحت نطاقات مختلفة من درجات الحرارة ودرجة الحموضة وتركيزات الملح ووجد أنها مستقرة تحت القيم القصوى لهذه المعلمات. في السابق ، أبلغ حبيب وآخرون عن ليبوبتيد ناتج عن الهيدروكربون المتحلل Rhodococcus sp. الذي أظهر استقرارا عبر نطاقات مختلفة من درجات الحرارة وقيم الأس الهيدروجيني وتركيزات الملح³⁶. تم الإبلاغ عن زيادة في تركيز الأملاح غير العضوية لزيادة استقرار المستحلب³⁷. ميل الغرويات إلى التكتل أو الانفصال هو دالة للجاذبية (قوى فان دير وولز) والقوى المنفرة (القوى الكهروستاتيكية) التي تشارك أثناء تفاعل الجسيمات³⁸. تقوم بلورات الملح عند الذوبان في الماء بإنشاء شحناتها الكهربائية الخاصة بها وتطلق الأيونات الممتزات على قطرات المستحلب. عند زيادة تركيز الملح ، يقل توسع الطبقة الثانية ونفورها. أيضا ، كلما زادت كثافة شحنة الأيون ، انخفض طول الطبقة الكهربائية. وبالتالي ، فإن الكاتيونات الثنائية مثل Na²+ تؤدي إلى تكوين مستحلبات أكثر استقرارا مقارنة بالكاتيونات أحادية التكافؤ³⁹.

ميزة أخرى أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي لديها على المواد الكيميائية السطحية هي أنها قابلة للتحلل^{البيولوجي 40}. قارن زنغ وآخرون قدرات التحلل للفاعل بالسطح الاصطناعي Triton X 100 وكبريتونات الألكيل بنزين الخطية (LAS) و rhamnolipid ووجدوا أن الفاعل بالسطح الحيوي rhamnolipid كان متدهورا تماما في حين أن LAS و Triton X 100 كانا متدهورين جزئيا فقط⁴¹. ويفيد ليو وآخرون أيضا أنه على النقيض من المواد الخافضة للتوتر السطحي الاصطناعية CTAB و Triton X 100 و SDS ، فإن rhamnolipid لا تظهر أي سمية ويمكن أن تتحلل بسهولة بواسطة B. subtilis وغيرها من الكائنات الحية الدقيقة السماد⁴².

تم العثور على المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها جميع السلالات الميكروبية الثلاث لتكون جليكوليبيدات. تم الإبلاغ سابقا عن Rhodococcus لإنتاج glycolipid من قبل مجموعات بحثية مختلفة²⁰،^21،23. تتوفر تقارير مماثلة عن إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي من قبل Lysinibacillus و Paenibacillus أيضا في الأدبيات^31،32،35،^43،44. كشف التحديد الكيميائي للخافضات للتوتر السطحي الحيوي أنها رامنوليبيدات. Rhamnolipids هي فئة من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي glycolipid التي تحتوي على وحدة أو وحدتين من وحدات الرامنوز المتصلة بسلسلة الدهون⁴⁵. هم النوع الأكثر دراسة من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي. تم الإبلاغ عن سلالات ميكروبية مختلفة لإنتاج rhamnolipids 7,46,47,48,49. تم الإبلاغ عن أن الرامنوليبيدات تظهر إمكانات عالية لتعزيز استعادة النفط المتبقي^50,51,52,53. في دراستنا ، وجدنا أن خليط المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها Rhodococcus sp. IITD 102 ، و Lysinibacillus sp. IITD 104 ، و Paenibacillus sp. IITD 108 استعادت بنجاح حوالي 56.52٪ من الزيت المتبقي في اختبار عمود حزمة الرمل المحاكاة. وأظهر ذلك أنه يمكن استخدام خليط المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي لاستعادة النفط المتبقي من المكامن الأرضية. في اختبار مماثل لحزمة الرمل ، أفاد Sun et al. أن الفاعل بالسطح الحيوي نجح في استعادة 50٪ من الزيت المتبقي⁵⁴. كما تم الإبلاغ عن أن المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تحتوي على مرق خال من الخلايا من Bacillus subtilis فعالة في استعادة 33٪ من الزيت المتبقي⁵⁵. كما أبلغ دارفيشي وآخرون ووهابي وآخرون عن استرداد النفط المتبقي بنسبة 27٪ و ^{26٪ -36٪.}

ويبين التقييم الاقتصادي للمواد الخافضة للتوتر السطحي الأحيائي من أجل استعادة النفط المتبقي من المكامن أن استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي الأحيائي في الاستخلاص المعزز للنفط هو خيار قابل للتطبيق اقتصاديا. وأفاد موتينيو وآخرون أن التكلفة النموذجية للفاعل بالسطح الحيوي التجاري (rhamnolipids) تبلغ حوالي 59.6 دولارا أمريكيا لكل كيلوغرام⁵⁸. وفي دراسة أخرى، أفيد أيضا بأن تركيز الفاعل بالسطح الحيوي البالغ 28 ملغم/لتر من الفاعل بالسطح الحيوي عزز استخراج النفط المتبقي وأدى إلى إنتاج 52.5^م3 من النفط الإضافي⁵⁹. وأظهرت الدراسات أن تركيز الفاعل بالسطح الحيوي البالغ 10 ملغم/لتر كان كافيا لتعبئة استخراج النفط. وفقا للبيانات المبلغ عنها ، فإن كمية الفاعل بالسطح الحيوي المطلوبة لإنتاج 52.5 م³ من النفط الإضافي تبلغ حوالي 0.525 كجم. تبلغ التكلفة الإجمالية لإنتاج 52.5 م³ نفط حوالي 21463 دولارا أمريكيا منها 30 دولارا أمريكيا فقط هي تكلفة إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي. تظهر البيانات أن النسبة المئوية لتكلفة الفاعل بالسطح الحيوي في إنتاج النفط لكل برميل هي 0.0000139٪ فقط.

تشير نتائجنا إلى أنه يمكن استخدام مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بكفاءة لاستعادة النفط المتبقي من المكامن. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول عن تعزيز استعادة النفط المتبقي من الخزان باستخدام خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي التي تنتجها سلالات ميكروبية مختلفة. على الرغم من أن دراستنا تصف بوضوح الطرق التي ينطوي عليها الفحص والتوصيف الهيكلي وتطبيق المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي في الاستخلاص المعزز للنفط ، إلا أن الدراسة لا توفر توصيفا وظيفيا مفصلا للمواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي ، والتي تؤثر على كفاءتها في التطبيقات المختلفة. لم يتم تحديد تركيز الميسيل الحرج ، وهو مقياس كفاءة أي فاعل بالسطح في تشكيل المذيلات ويحدد التركيز المحدد للفاعل بالسطح لاستخدامه بشكل هادف بالغرض ، في هذه الدراسة⁶⁰. وبالمثل ، فإن الاستقرار الحراري للفاعل بالسطح الحيوي ، الذي يحدد قابليته للتطبيق في ظروف الخزان للاستخلاص المعزز للنفط لم يتم وصفه أيضا⁶¹. تستخدم المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي في بعض التطبيقات أيضا كعوامل مضادة للبيوفيلم. تلعب قابلية بلل سطحها دورا مهما في تحديد طبيعتها المضاد للأفلام الحيوية. كما لم تجر دراسات قابلية البلل السطحي في العمل الحالي⁶². الخصائص الوظيفية الأخرى الهامة في مختلف تطبيقات المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي ، والتي تشمل قابليتها للتحلل البيولوجي والطبيعة المضادة للميكروبات لم يتم تحديدها أيضا في هذه الدراسة^63,64. وهكذا ، ركزنا على التوصيف الهيكلي للخافضات للتوتر السطحي الحيوي. اعتمادا على التطبيق المستهدف ، يمكن إجراء توصيف وظيفي مثل الاستقرار والتحلل البيولوجي والنشاط المضاد للميكروبات.

في فحص انهيار القطرة وفحص انتشار الزيت ، لزيادة الرؤية ، من الأفضل استخدام زيت له بعض اللون. في فحص انتشار الزيت ، يجب ملاحظة المستحلب بعد 24 ساعة. تتفكك الرغاوي الخفيفة ، إذا تشكلت ، في 24 ساعة. مقاييس الشد هي أدوات حساسة للغاية لذلك أثناء قياسات التوتر السطحي ، يجب تنظيف الوعاء والمسبار بشكل صحيح قبل كل قياس لتجنب أي أخطاء بسبب ترحيل القياسات الأخيرة. استخراج الفاعل بالسطح الحيوي ينطوي على إضافة خليط الميثانول الكلوروفورم إلى supernatant خالية من الخلايا. يجب تنفيذ الخطوة إما في غطاء الدخان ، أو يجب تغطية القارورة بورق الألومنيوم مباشرة بعد نقل خليط الاستخراج. أثناء الاسترداد الثانوي في تجربة الاستخلاص المعزز للنفط ، يجب إضافة محلول ملحي بشكل زائد حتى لا يخرج أي زيت آخر من العمود.

تناقش الطريقة نطاق خليط من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي في استعادة الزيت المتبقي من الأعمدة. تعتمد العملية على العديد من العوامل. مرحلة نمو الميكروبات التي يتم فيها حصاد الثقافات الأولية. وقد أبلغ عن إنتاج بعض المواد الخافضة للتوتر السطحي الأحيائي في مرحلة السجل، في حين أبلغ عن إنتاج مواد أخرى في المرحلة الثابتة. وينبغي حصاد الثقافات وفقا لذلك في مرحلة معينة عندما يصل إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي إلى أقصى حد له. فحوصات فحص الفاعل بالسطح الحيوي أقل حساسية ، لذلك يجب إجراء جميع الفحوصات قبل التوصل إلى استنتاج حول القدرة على إنتاج الفاعل بالسطح الحيوي لسلالة معينة. يجب إجراء تنقية الفاعل بالسطح الحيوي قبل التوصيف الكيميائي للفاعل بالسطح الحيوي إذا كان تركيز الفاعل بالسطح الحيوي منخفضا في الفاعل بالسطح الحيوي الخام. تعتمد تجارب استخراج النفط المحسنة بشكل كبير على نوع التربة المستخدمة لتعبئة العمود. يجب أن تكون التربة جافة تماما ويجب غربلها لإزالة حبيبات أكبر والملوثات الصلبة الأخرى. يجب تفضيل مزيج من التربة الرملية وتربة الحديقة الجافة (بنسبة متساوية) لتعبئة العمود. يجب إغلاق مخرج العمود بشكل صحيح بالصوف الزجاجي والخرز الزجاجي لتجنب تسرب التربة من العمود أثناء التجربة.

الطريقة الموصوفة مفيدة لتحديد أهمية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المنتجة ومخاليطها في استعادة زيت إضافي في تجربة عمود حزمة رملية محاكاة. المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المختلفة لها خصائص مختلفة لأنها تحتوي على مجموعات وظيفية مختلفة⁶⁵. ومن شأن مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي أن يمكن من إذابة الهيدروكربونات المتنوعة، وبالتالي سيزيد من استخراج النفط المتبقي من المكامن. وستساعد الطريقة الموصوفة في تحديد إمكانات مخاليط الفاعل بالسطح الحيوي في التطبيقات الميدانية مثل الاستخلاص المعزز للنفط من آبار النفط.

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

ويود المؤلفان أن يشكرا إدارة التكنولوجيا الأحيائية في حكومة الهند على الدعم المالي.