Récupération assistée du pétrole à l’aide d’une combinaison de biosurfactants

Nous illustrons les méthodes impliquées dans le criblage et l’identification des microbes producteurs de biosurfactants. Les méthodes de caractérisation chromatographique et d’identification chimique des biosurfactants, déterminant l’applicabilité industrielle du biosurfactant dans l’amélioration de la récupération de l’huile résiduelle sont également présentées.

Les biosurfactants sont des composés tensioactifs capables de réduire la tension superficielle entre deux phases de polarités différentes. Les biosurfactants sont apparus comme des alternatives prometteuses aux tensioactifs chimiques en raison de leur toxicité moindre, de leur biodégradabilité élevée, de leur compatibilité environnementale et de leur tolérance aux conditions environnementales extrêmes. Nous illustrons ici les méthodes utilisées pour le criblage des microbes capables de produire des biosurfactants. Les microbes producteurs de biosurfactant ont été identifiés à l’aide de tests d’effondrement de gouttes, d’épandage d’huile et d’indice d’émulsion. La production de biosurfactants a été validée en déterminant la réduction de la tension superficielle du milieu due à la croissance des membres microbiens. Nous décrivons également les méthodes impliquées dans la caractérisation et l’identification des biosurfactants. Une chromatographie sur couche mince du biosurfactant extrait, suivie d’une coloration différentielle des plaques, a été effectuée pour déterminer la nature du biosurfactant. LCMS, ^{RMN 1}H et FT-IR ont été utilisés pour identifier chimiquement le biosurfactant. Nous illustrons également les méthodes permettant d’évaluer l’application de la combinaison de biosurfactants produits pour améliorer la récupération de l’huile résiduelle dans une colonne de sable simulée.

Les biosurfactants sont les molécules tensio-actives amphipathiques produites par des micro-organismes qui ont la capacité de réduire la surface et la tension interfaciale entre deux phases¹. Un biosurfactant typique contient une partie hydrophile qui est généralement composée d’une fraction sucrée ou d’une chaîne peptidique ou d’un acide aminé hydrophile et une partie hydrophobe composée d’une chaîne d’acides gras saturés ou insaturés². En raison de leur nature amphipathique, les biosurfactants s’assemblent à l’interface entre les deux phases et réduisent la tension interfaciale à la frontière, ce qui facilite la dispersion d’une phase dans l’autre ^1,3. Divers types de biosurfactants qui ont été rapportés jusqu’à présent comprennent les glycolipides dans lesquels les glucides sont liés à des acides aliphatiques ou hydroxy-aliphatiques à longue chaîne via des liaisons ester (par exemple, les rhamnolipides, les tréhalolipides et les sophorolipides), les lipopeptides dans lesquels les lipides sont attachés à des chaînes polypeptidiques (par exemple, la surfactine et la lichénysine) et les biosurfactants polymères qui sont généralement composés de complexes polysaccharide-protéine (par exemple, émulsan, liposan, alasan et lipomannane)⁴. D’autres types de biosurfactants produits par les micro-organismes comprennent les acides gras, les phospholipides, les lipides neutres et les biosurfactants particulaires⁵. La classe de biosurfactants la plus étudiée est celle des glycolipides et parmi eux la plupart des études ont été rapportées sur les rhamnolipides⁶. Les rhamnolipides contiennent une ou deux molécules de rhamnose (qui forment la partie hydrophile) liées à une ou deux molécules d’acide gras à longue chaîne (généralement de l’acide hydroxy-décanoïque). Les rhamnolipides sont des glycolipides primaires rapportés en premier chez Pseudomonas aeruginosa⁷.

Les biosurfactants ont gagné en attention par rapport à leurs homologues chimiques en raison de diverses propriétés uniques et distinctives qu’ils offrent⁸. Il s’agit notamment d’une plus grande spécificité, d’une toxicité plus faible, d’une plus grande diversité, d’une plus grande facilité de préparation, d’une biodégradabilité plus élevée, d’une meilleure moussage, d’une compatibilité environnementale et d’une activité dans des conditions extrêmes⁹. La diversité structurelle des biosurfactants (figure S1) est un autre avantage qui leur donne un avantage sur leurs homologues chimiques¹⁰. Ils sont généralement plus efficaces et efficients à des concentrations plus faibles, car leur concentration micellaire critique (CMC) est généralement plusieurs fois inférieure à celle des tensioactifs chimiques¹¹. Ils ont été signalés comme étant très thermostables (jusqu’à 100 °C) et peuvent tolérer un pH plus élevé (jusqu’à 9) et des concentrations élevées de sel (jusqu’à 50 g/L)¹² , offrant ainsi plusieurs avantages dans les processus industriels, qui nécessitent une exposition à des conditions extrêmes¹³. La biodégradabilité et la toxicité plus faible les rendent adaptés à des applications environnementales telles que la bioremédiation. En raison des avantages qu’ils offrent, ils ont reçu une attention accrue dans diverses industries comme l’industrie alimentaire, agricole, détergente, cosmétique et pétrolière¹¹. Les biosurfactants ont également attiré beaucoup d’attention dans l’assainissement des hydrocarbures pour l’élimination des contaminants pétroliers et des polluants toxiques¹⁴.

Nous rapportons ici la production, la caractérisation et l’application de biosurfactants produits par Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 et Paenibacillus sp. IITD108. Les étapes du criblage, de la caractérisation et de l’application d’une combinaison de biosurfactants pour la récupération assistée du pétrole sont décrites à la figure 1.

Figure 1 : Méthode de récupération assistée de l’huile à l’aide d’une combinaison de biosurfactants. Le flux de travail par étapes est affiché. Les travaux se sont déroulés en quatre étapes. Tout d’abord, les souches microbiennes ont été cultivées et examinées pour la production de biosurfactant par divers essais, notamment le test d’effondrement des gouttes, le test d’étalement d’huile, le test d’indice d’émulsion et la mesure de la tension superficielle. Ensuite, les biosurfactants ont été extraits du bouillon sans cellules et leur nature a été identifiée à l’aide de la chromatographie sur couche mince et ils ont été identifiés à l’aide de LCMS, RMN et FT-IR. Dans l’étape suivante, les biosurfactants extraits ont été mélangés ensemble et le potentiel du mélange résultant pour une récupération assistée du pétrole a été déterminé à l’aide de la technique de la colonne de sable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le criblage de ces souches microbiennes pour produire des biosurfactants a été effectué par effondrement de gouttes, propagation d’huile, dosage de l’indice d’émulsion et détermination de la réduction de la tension superficielle du milieu sans cellules due à la croissance des microbes. Les biosurfactants ont été extraits, caractérisés et identifiés chimiquement par LCMS, ^{RMN 1}H et FT-IR. Enfin, un mélange de biosurfactants produits par ces microbes a été préparé et a été utilisé pour récupérer l’huile résiduelle dans une colonne de sable simulée.

La présente étude illustre seulement les méthodes impliquées dans le criblage, l’identification, la caractérisation structurelle et l’application de la combinaison de biosurfactants sur l’amélioration de la récupération de l’huile résiduelle. Il ne fournit pas de caractérisation fonctionnelle détaillée des biosurfactants produits par les souches microbiennes^15,16. Diverses expériences telles que la détermination critique des micelles, l’analyse thermogravimétrique, la mouillabilité de surface et la biodégradabilité sont effectuées pour une caractérisation fonctionnelle détaillée de tout biosurfactant. Mais comme cet article est un document sur les méthodes, l’accent est mis sur le criblage, l’identification, la caractérisation structurelle et l’application de la combinaison de biosurfactants pour améliorer la récupération de l’huile résiduelle; ces expériences n’ont pas été incluses dans cette étude.

1. Croissance des souches microbiennes

1. Peser 2 g de poudre de bouillon Luria et ajouter à 50 mL d’eau distillée dans une fiole conique de 250 mL. Mélanger le contenu jusqu’à ce que la poudre se dissout complètement et porter le volume à 100 mL à l’aide d’eau distillée.
2. De même, préparez deux autres flacons de 100 mL de bouillon Luria et placez des bouchons de coton sur le col des flacons.
3. Couvrir les bouchons de coton avec du papier d’aluminium et autoclaver les flacons pendant 15 min à 121 °C et 15 psi pour stériliser le support.
4. Après l’autoclavage, laissez le média refroidir à la température ambiante.
5. Pour la préparation de la culture primaire d’une souche, choisir une seule colonie dans une plaque LA à l’aide d’une boucle d’inoculation et inoculer dans un tube à essai contenant 5 mL de bouillon stérile Luria.
6. Incuber le tube à essai pendant la nuit à 30 °C à 180 tr/min.
7. Inoculer les flacons contenant 100 mL de bouillon Luria autoclavé en ajoutant 1 mL de cultures de graines cultivées pendant la nuit aux flacons à l’intérieur de l’armoire à flux d’air laminaire.
8. Incuber les flacons dans un incubateur rotatif à 30 °C et 180 tr/min pendant 7 jours.
9. Une fois la période d’incubation terminée, récoltez les flacons et transférez le bouillon de culture dans les tubes de centrifugeuse. Centrifuger la culture à 4 500 x g pendant 20 min dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C.
10. Versez doucement le surnageant sans cellule dans un bécher frais et utilisez-le dans des tests de criblage pour la production de biosurfactants.

2. Essais de criblage pour la production de biosurfactants

REMARQUE : Dans les sections suivantes, un tensioactif commercial (saponine) a été utilisé comme témoin positif, tandis que l’eau et les milieux non inoculés ont été utilisés comme témoin négatif.

1. Essai d’effondrement de goutte
   1. Prenez une lame de verre propre et recouvrez la surface de la lame de 200 μL d’huile.
   2. Ajouter 20 μL du surnageant sans cellule au centre de l’huile et laisser tranquille pendant 2-3 min.
      REMARQUE: Si la goutte s’effondre, notez le surnageant positif pour la présence de biosurfactant.
2. Essai d’épandage d’huile
   1. Prendre 20 mL d’eau distillée double dans une plaque de Petri (75 mm de diamètre) et ajouter 200 μL de pétrole brut à la surface de l’eau.
   2. Ajouter 20 μL de surnageant sans cellule au centre de l’huile et laisser tranquille pendant 1 min.
      REMARQUE: Si une zone de défrichement est formée en raison du déplacement de l’huile, notez le surnageant positif pour la présence du biosurfactant.
3. Dosage de l’indice d’émulsion (_{test E 24} )
   1. Ajouter 4 mL d’essence (essence) et un surnageant sans cellule chacun dans un tube à essai en verre propre.
   2. Vortex le mélange vigoureusement pendant 3 min et laissez-le intact pendant les 24 heures suivantes.
   3. Après 24 h, déterminer l’indice E₂₄ en pourcentage de la hauteur de la couche émulsionnée (cm) par rapport à la hauteur de toute la colonne de liquide (cm).
      
      REMARQUE: Si une émulsion (huile dans l’eau ou eau dans l’huile) est observée après 24 h, le surnageant est susceptible de contenir le biosurfactant.
4. Mesure de la tension superficielle
   REMARQUE: La tension superficielle a été mesurée à l’aide de la méthode de l’anneau de Du Noüy¹⁷. L’instrument utilisé dans cette expérience (voir Tableau des matériaux) est très sensible, alors assurez-vous d’un nettoyage adéquat du récipient en verre et de la sonde.
   1. Allumez le système et double-cliquez sur le logiciel associé pour l’ouvrir.
   2. Nettoyez le récipient en verre avec le liquide dont la tension superficielle doit être déterminée.
   3. Ajouter le liquide (40 ml) dans le récipient et monter le récipient sur le porte-récipient.
   4. Déverrouillez le support de la sonde et montez la sonde dessus. Maintenant, verrouillez le support de la sonde en appuyant sur le bouton Verrouiller du contrôleur manuel.
   5. À l’aide du contrôleur manuel, ajustez la hauteur de la plate-forme de sorte que la sonde soit à environ 2-3 mm de la surface du liquide.
   6. Utilisez maintenant le logiciel pour mesurer la tension superficielle. Cliquez sur Fichier situé dans le panneau supérieur gauche de l’écran. Cliquez sur Ouvrir l’espace de travail. Une fenêtre pop-up apparaîtra.
   7. Faites défiler vers le bas et double-cliquez sur l’icône K100: Surface and Interfacial Tension .
   8. Maintenant, cliquez sur l’icône Fichier située dans le coin supérieur gauche de l’écran. Cliquez sur Nouvelle base de données. Entrez le nom pour enregistrer les données et cliquez sur OK.
   9. Encore une fois, cliquez sur Fichier > Nouvelle mesure > anneau > SFT. Entrez le nom de la mesure. Assurez-vous que le modèle de configuration affiche l’anneau SFT.
   10. Remplissez les détails dans la fenêtre Configuration de la mesure en sélectionnant la sonde et le récipient utilisé pour la mesure. Remplissez également les détails de la phase liquide et gazeuse.
       REMARQUE: La phase liquide sera l’eau, tandis que la phase gazeuse sera l’air. La densité de la phase liquide est la densité du surnageant libre de la cellule. Ceci peut être déterminé en prenant le poids de 50 mL du liquide et en calculant la densité en Kg/m³.
   11. Maintenant, cliquez sur l’onglet Procédure et remplissez les détails suivants : Vitesse de détection: 6 mm / min, Sensibilité de détection: 0,005 g, Vitesse de recherche: 6 mm / min, Sensibilité de recherche: 0,005 g, Vitesse de mesure: 3 mm / min, Sensibilité de mesure: 0,001 g, Profondeur d’immersion: 3 mm, Distance de retour: 10%, Correction: Harkins & Jordan, valeurs maximales: 5. Cliquez sur OK.
   12. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez la base de données pour stocker les données et cliquez sur OK.
       REMARQUE: On peut créer une nouvelle base de données ici ou ajouter de nouvelles mesures aux données existantes.
   13. Maintenant, cliquez sur le bouton Lecture situé en haut au centre de l’écran. Le système commencera à exécuter le script. Une fois le système stabilisé, il détectera la surface. Plongez la sonde dans le liquide, déplacez la sonde d’avant en arrière et détectez la tension dans la lame formée.
   14. Pour obtenir les résultats, cliquez sur l’icône Mesure au milieu à gauche de l’écran. Cliquez sur Données et notez la tension superficielle déterminée.
   15. Une fois la mesure terminée, abaissez la hauteur de la plate-forme et déverrouillez et démontez la sonde et le navire de l’instrument.
       REMARQUE: Pour déterminer la diminution de la tension superficielle due à la production de biosurfactant, le LB non ininoculé doit être utilisé comme témoin.

3. Extraction de biosurfactants

1. Ajuster le pH du surnageant libre de la cellule à 2 à l’aide de 2 N HCl. Conserver le mélange à 4 °C pendant la nuit.
2. Ajouter un volume égal de mélange chloroforme-méthanol (2:1) au surnageant et mélanger vigoureusement pendant 20 min.
3. Laissez le mélange intact pour que la séparation de phase se produise.
4. Retirer la phase supérieure contenant de l’eau et du méthanol et laisser la phase inférieure contenant le biosurfactant s’évaporer dans une hotte.
5. Après évaporation de la phase organique, redissoudre le biosurfactant brut de couleur miel dans 3 mL de chloroforme et utiliser ce mélange pour une identification et une caractérisation plus poussées du biosurfactant.

4. Études de stabilité de l’émulsion

1. Stabilité de l’émulsion à différentes températures
   1. Prendre 5 mL de surnageants sans cellules dans différents tubes à essai.
   2. Ajouter 5 mL d’essence à chaque éprouvette et mélanger vigoureusement en vortexant pendant 3 min.
   3. Incuber les tubes à essai pendant la nuit dans différents bains-marie à différentes températures (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C et 70 °C).
   4. Après 24 h, estimer les indices d’émulsion comme mentionné précédemment.
2. Stabilité de l’émulsion à différentes valeurs de pH
   1. Prendre 5 mL du surnageant sans cellule dans des tubes à essai propres.
   2. Ajuster le pH des surnageants libres de cellules (2, 4, 6, 8 et 10) à l’aide de 1 N HCl et 1 N NaOH.
   3. Ajouter une quantité égale d’essence dans les éprouvettes et mélanger vigoureusement en vortexant pendant 3 min.
   4. Laissez les tubes à essai intacts à température ambiante pendant 24 h.
   5. Estimez l’indice d’émulsion comme mentionné précédemment.
3. Stabilité de l’émulsion à différentes concentrations de sel
   1. Prendre 5 mL du surnageant sans cellule dans des tubes à essai propres.
   2. Ajouter différentes quantités de sel (NaCl) aux surnageants (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L et 80 g/L).
   3. Dissoudre les sels dans les surnageants libres de cellules en vortexant pendant 3 min.
   4. Ajouter une quantité égale d’essence dans les éprouvettes et mélanger vigoureusement en vortexant pendant 3 min.
   5. Laissez les tubes à essai intacts à température ambiante pendant 24 h.
   6. Estimer l’indice d’émulsion après 24 h.

5. Détermination de la nature du biosurfactant

1. TLC du biosurfactant extrait
   1. Repérez 20 μL des biosurfactants sur les plaques TLC. Spot 2 μL à la fois.
   2. Repérez les biosurfactants sur trois plaques TLC différentes.
   3. Préparer un mélange de 100 mL de l’éluant contenant du chloroforme:méthanol (2:1) et ajouter l’éluant à la chambre TLC. Fermez le couvercle de la chambre et laissez-le saturer pendant 20 min.
   4. Après avoir séché les plaques, placez les plaques TLC à l’intérieur de la chambre saturées d’un mélange de méthanol chloroforme et faites fonctionner le TLC.
   5. Une fois que l’éluant a atteint le sommet de la plaque TLC (à 1 cm du sommet), retirez les plaques et laissez-les sécher à l’air.
2. Coloration pour la détection des lipides
   1. Prenez une chambre TLC propre et ajoutez quelques (5-10) granules d’iode dans la chambre fraîche et saturez la chambre pendant 5 à 10 minutes.
   2. Placez la plaque TLC à l’intérieur de la chambre et observez le développement des taches jaunes. Si les taches apparaissent, notez le biosurfactant positif pour la présence du composant lipidique.
3. Coloration pour la détection de peptides ou d’acides aminés
   1. Préparer une solution de ninhydrine en dissolvant 0,4 g de ninhydrine dans 20 mL de butanol. Ajouter 0,6 mL d’acide acétique 100 % glacial au mélange.
   2. Vaporiser la plaque TLC avec une solution de ninhydrine et laisser sécher à l’air libre pendant 2 min. Chauffer la plaque à 110 °C et observer l’évolution de la couleur.
      REMARQUE: Si les taches bleues apparaissent, notez le biosurfactant positif pour la présence de toute chaîne peptidique ou acide aminé.
4. Coloration pour la détection des glucides
   1. Préparer une solution de p-anisaldéhyde en ajoutant 2 mL de p-anisaldéhyde à 48 mL d’acide acétique glacial contenant 1 mL de_H2SO₄. Ajouter 0,6 mL d’acide acétique au mélange.
   2. Vaporiser le mélange uniformément sur une plaque TLC et laisser sécher à l’air libre pendant 2 min.
   3. Incuber la plaque à 110 °C et surveiller le développement des taches.
      REMARQUE: Si les taches vertes ou brunes apparaissent, notez le biosurfactant positif pour la présence de glucides.

6. Identification chimique du biosurfactant

1. LCMS du biosurfactant
   1. Dissoudre 25 mg du biosurfactant extrait dans 1 mL de chloroforme.
   2. Effectuez un LCMS (dans une configuration de pulvérisation de verrouillage avec une fréquence de balayage de référence de 10 s) à l’aide d’une colonne C18.
   3. Utiliser chloroforme:méthanol (1:1) comme phase mobile et injecter 2 μL de l’échantillon dans la colonne à un débit de 0,1 mL/min.
   4. Réglez les paramètres expérimentaux sur : polarité : ES positive, tension capillaire : 3 kV, température de la source : 80 °C, température de solvatation : 300 °C, débit du gaz de solvatation : 7 000 L/h et débit du gaz de piégeage : 0,40 mL/min.
   5. Scannez les plages de 100 à 1 200 Da pendant un temps de détection de 20 minutes et surveillez les ions en mode ES positif.
   6. Analysez les valeurs m/z à l’aide de n’importe quel logiciel de spectrométrie de masse.
   7. Pour l’analyse, connectez-vous au logiciel.
   8. Cliquez sur Batch Search et entrez la liste des masses obtenues. Examinez les résultats en mode de charge positive et utilisez M + H et M + Na comme adduits. Maintenez la précision à 10 PPM et cochez sur Structure d’affichage.
   9. Cliquez sur Rechercher et dans la liste des composés, sélectionnez celui avec le niveau PPM le plus bas.
2. ¹ RMN H du biosurfactant
   REMARQUE: ^{La RMN 1}H du biosurfactant a été réalisée à l’aide d’un spectromètre RMN de 400 MHz (voir tableau des matériaux).
   1. Dissoudre 5 mg du biosurfactant dans 1 mL de chloroforme deutéré (CdCl₃).
   2. Transférer le mélange dans un tube RMN. Boucher correctement le tube et insérer le tube dans la clé. Ajustez la hauteur du tube à l’aide du tube de réglage.
   3. Placez le tube avec la clé dans la machine RMN et suivez les étapes mentionnées ci-dessous pour obtenir un spectre RMN.
   4. Pour sélectionner le type de tube d’échantillonnage : sx N, où N est la position où le tube a été placé (par exemple, sx 13, si le tube a été placé à la 13^e position) dans le logiciel associé.
   5. Tapez edc et appuyez sur Entrée pour créer un nouveau dossier dans lequel les données peuvent être stockées.
   6. Une fenêtre contextuelle apparaîtra. Sélectionnez le solvant en cliquant sur CdCl ₃ dans la liste et entrez le nom de l’échantillon.
   7. Pour démarrer le protocole, tapez « getprosol »; pour verrouiller le solvant, tapez « lock cdcl3 ».
   8. Tapez « topshim » pour caler l’échantillon, et enfin tapez « rga;zgefp » pour acquérir les données. Cela lancera le protocole.
   9. Une fois les spectres obtenus, tapez « apk;abs n » et appuyez sur Entrée pour la correction de phase et de ligne de base.
   10. Pour sélectionner les pics primaires, tapez « pp » et appuyez sur Entrée. Pour sélectionner uniquement les pics intenses, entrez « mi » et tapez l’intensité au-dessus de laquelle les pics doivent être sélectionnés. La valeur par défaut sera 0,2.
   11. Pour intégrer les pics, cliquez sur Intégrer et placez le curseur sur le côté gauche du pic à intégrer et, tout en maintenant le curseur enfoncé, cliquez et faites glisser le curseur autour du pic.
   12. Enregistrez les données en cliquant sur Fichier dans le coin supérieur gauche, puis cliquez sur Enregistrer.
   13. L’échantillon peut être éjecté de la machine en tapant « sx ej ».
   14. Analyser les pics et déterminer l’environnement des atomes H.
3. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier du biosurfactant
   REMARQUE: Le FT-IR du biosurfactant extrait a été réalisé à l’aide d’un spectrophotomètre disponible dans le commerce en mode ATR (voir tableau des matériaux).
   1. Allumez le spectrophotomètre et vérifiez la purge, le dessiccant et le détecteur.
   2. Pour collecter un spectre, collectez d’abord le spectre de fond sans échantillon en place.
   3. Prenez le biosurfactant extrait et séchez-le complètement. Placez le biosurfactant séché directement sur le cristal de diamant, appliquez une pression et appuyez sur le point de contact ATR.
   4. Dans le logiciel, sélectionnez le nombre de scans (entrez 30) et scannez le spectre de 400 ^cm-1 à 4 000 ^cm-1.
   5. Cliquez sur OK pour ajouter le spectre de l’échantillon à la fenêtre spectrale.
   6. Cliquez sur Fichiers > Enregistrer > Enregistrer sous et entrez le nom du fichier suivi de l’extension .spa et cliquez sur OK.

7. Application de biosurfactant (récupération assistée de l’huile)

REMARQUE: Dans cette expérience, de l’eau distillée double a été utilisée comme témoin négatif et 10% de FDS, 10% de Tween 80 et 10% de saponine commerciale ont été utilisés comme témoins positifs.

1. Prenez le verre et scellez la sortie inférieure avec de la laine de verre et des perles de verre.
2. Emballez la colonne avec du sol sablonneux de manière à ce qu’un peu de liquide puisse être ajouté au sommet du sol et que l’écoulement puisse être recueilli au fond. Montez la colonne sur le support et ajoutez des perles de verre sur le sol.
3. Inonder la colonne avec 50 mL de solution de saumure et recueillir l’écoulement pour déterminer le volume des pores.
   volume de pores = volume de saumure ajouté sur le dessus - volume de flux collecté.
4. Retirez la saumure de la colonne en forçant le pétrole brut à la traverser après l’avoir ajoutée par le haut de la colonne. Recueillir le volume de saumure et d’huile sortant de la colonne pour déterminer le volume initial de saturation en huile. Le volume de la saumure libérée par la colonne sera le volume initial de saturation en huile ou l’huile d’origine en place.
5. Laissez la colonne intacte pendant 24 h.
6. Après 24 h, inonder la colonne avec 10 volumes de saumure interstitielle et recueillir l’huile sortant de la colonne pour estimer la récupération secondaire de l’huile. L’huile laissée dans la colonne après récupération secondaire de l’huile correspond à l’huile résiduelle.
7. Préparer un mélange de biosurfactants en ajoutant des volumes égaux du biosurfactant extrait (extrait après l’étape 3.5) au bécher en verre. Ajouter les biosurfactants en haut de la colonne et incuber la colonne pendant 24 h.
8. Après 24 h, mesurez la quantité d’huile et d’eau pour déterminer la récupération supplémentaire ou améliorée de l’huile. Le volume d’huile libéré de la colonne correspondra à l’huile résiduelle récupérée.
9. Estimer la récupération assistée du pétrole à l’aide de l’équation suivante :
   

Trois souches bactériennes (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 et Paenibacillus sp. IITD108) ont été examinées pour la production de biosurfactants par divers essais, notamment le test d’effondrement de goutte, le test de déplacement d’huile, le test d’indice d’émulsion et la réduction de la tension superficielle. Les surnageants sans cellules des trois souches bactériennes et une solution de tensioactif chimique ont entraîné un effondrement de la goutte et, par conséquent, ont été notés positifs pour la présence des biosurfactants (figure 4a). D’autre part, la gouttelette d’eau ne s’est pas effondrée et a donc été notée négative pour la présence du biosurfactant. Le tensioactif commercial et les surnageants libres de cellules des trois cultures bactériennes ont également réussi à déplacer la couche d’huile dans le test d’épandage d’huile et, par conséquent, ont obtenu une note positive pour la présence de biosurfactant (Figure 4b). L’eau, en revanche, ne pouvait pas déplacer le pétrole et, par conséquent, a été notée négative. Dans les essais d’indice d’émulsion, une émulsion stable a été observée dans des tubes à essai contenant un tensioactif commercial et les surnageants des trois souches microbiennes. Cependant, aucune émulsion n’a été observée dans le tube à essai contenant un milieu de culture non ininoculé (figure 4c). Cela suggère à nouveau que Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 et Paenibacillus sp. IITD108 produisent des biosurfactants. La confirmation de la production de biosurfactants a été obtenue en mesurant la tension superficielle du bouillon sans cellules et en la comparant au témoin non ininoculé. Les biosurfactants de Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 et Paenibacillus sp. IITD108 ont permis de réduire la tension superficielle du milieu de 58,89 mN/m à 45,41 mN/m, 45,82 mN/m et 28,43 mN/m, respectivement (Figure 5).

Les mesures IFT ont été effectuées à l’aide de la méthode de traction en anneau. Les biosurfactants des trois souches étaient capables de réduire considérablement les tensions interfaciales entre les différentes phases aqueuses et organiques (tableau S1). Les mesures de tension superficielle et de tension interfaciale confirment que les trois souches produisent des biosurfactants.

L’extraction par solvant de biosurfactants à partir des cultures libres de cellules de Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 et Paenibacillus sp. IITD108 a donné des concentrations de biosurfactant de 820 mg/L, 560 mg/L et 480 mg/L, respectivement.

Comme on l’observe à la figure 4C, l’émulsion formée par le biosurfactant était de l’eau dans la microémulsion d’huile. Les essais de stabilité en émulsion ont montré que les biosurfactants présentaient une bonne stabilité dans diverses conditions environnementales (figure 6). Les émulsions produites étaient très stables à diverses températures (figure 6a), valeurs de pH (figure 6b) et concentrations de sel (figure 6c) testées.

La chromatographie sur couche mince a été réalisée pour déterminer la nature des biosurfactants. La coloration des plaques avec de la vapeur d’iode a entraîné le développement de taches jaunes dans tous les biosurfactants et le contrôle (Biosurfactant de Bacillus sp. IITD 106 (Figure 7a). Cela indiquait que les biosurfactants contenaient une fraction lipidique. Aucune tache de couleur bleue n’a été obtenue dans aucune des plaques TLC lors de la coloration à la ninhydrine (figure 7b). Cela a montré que les biosurfactants ne contenaient aucune fraction peptidique. Des taches bleues et vertes ont été observées dans toutes les plaques TLC, lorsqu’elles étaient colorées avec une coloration à l’anisaldéhyde (figure 7c). Cela a montré que les biosurfactants contenaient une fraction glucidique. D’après les résultats de TLC, il a été conclu que tous les biosurfactants étaient des glycolipides.

L’identification chimique des biosurfactants à l’aide du LCMS a révélé que le Rhodococcus sp. IITD102 et le Lysinibacillus sp. IITD104 produisent le même type de biosurfactant, qui a été identifié comme l’acide hydroxydécanoïque di-rhamnopyranosique d’une masse de 480,25 Da. La structure du biosurfactant a été étayée par ^{des données RMN et}FT-IR 1 H (figure 8).

Dans le spectre RMN ¹H, les décalages chimiques obtenus à 7,2 représentaient les protons des groupes carboxyliques. Des décalages chimiques correspondant aux protons du groupe méthyle ont été obtenus dans la gamme 1-2 ppm. Des décalages correspondant à des protons attachés à des groupes alkyles ont été obtenus à 2,3 ppm. Les spectres FT-IR des biosurfactants extraits de Rhodococcus sp. IITD102 et Lysinibacillus sp. IITD104 ont montré la présence de forts pics au numéro d’onde 3 290 ^cm-1, ce qui confirme la présence du groupe fonctionnel OH. Un petit pic au numéro d’onde 2 951 ^cm-1 correspond à l’étirement CH. Un fort pic à 1 620 ^cm-1 représentait la présence du groupe carboxylique dans les biosurfactants. D’autres pics obtenus à 1 530, 1 410, 1 200 et 1 060 ont confirmé la présence de groupes fonctionnels alkyle,_CH3, C-O-C et_C-CH3 , respectivement. Les données RMN et FT-IR ont étayé la structure du biosurfactant déterminée à partir d’études LCMS. Le SMTS du biosurfactant brut de Paenibacillus sp. IITD108 (Figure 9) a montré qu’il produit un rhamnolipide contenant trois chaînes lipidiques formant le noyau hydrophobe en vrac du biosurfactant. Le biosurfactant a été identifié comme étant de l’acide 2décanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroxydécanoïque d’une masse de 802 Da. Les résultats du SMLT ont été étayés par des données ^RMNet FT-IR 1 H.

La configuration pour la récupération assistée du pétrole est illustrée à la figure 2.

Figure 2 : Installation expérimentale pour la récupération assistée du pétrole à l’aide de la technique de la colonne de sable. La colonne remplie de terre a été montée sur le support. La sortie inférieure a été scellée avec de la laine de verre et des perles de verre. Après la récupération secondaire, l’huile résiduelle à l’intérieur de la colonne a été soumise à une récupération assistée de l’huile par l’ajout du mélange de biosurfactants. Le tube placé au bas de la colonne a été utilisé pour recueillir la fraction éluée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans l’expérience simulée de récupération assistée du pétrole, sur 50 mL de saumure ajoutés au sommet de la colonne, 12 mL ont été collectés dans le flux et, par conséquent, le volume des pores a été estimé à 38 mL. Lorsque l’huile a été forcée à travers la colonne, 33 mL de saumure ont été libérés de la colonne. Cela représentait le volume initial de saturation en huile. La récupération secondaire à l’aide de 10 volumes de saumure à pores a entraîné l’élution de 10 mL d’huile. L’huile résiduelle laissée dans la colonne était de 23 mL. L’eau contenant le mélange de biosurfactants a pu récupérer 13 mL d’huile de la colonne (Figure 3).

Figure 3 : Simulation d’une récupération assistée du pétrole à l’aide d’une colonne de sable. Le volume initial de saturation en huile de la colonne de contrôle et de la colonne d’essai était d’environ 33 mL. Au cours de la récupération secondaire du pétrole, environ 10 mL d’huile ont été récupérés à la fois des colonnes de contrôle et des colonnes d’essai. Les différences dans les profils de récupération de l’essai et des colonnes de contrôle n’ont été observées que lors de la récupération de l’huile résiduelle laissée dans la colonne. Le mélange de biosurfactants a permis de récupérer 13 mL d’huile résiduelle laissée par la colonne d’essai, tandis que dans la colonne témoin, seulement 1,03 mL d’huile a été récupéré à cette étape. Cela montre que le mélange de biosurfactants a un grand potentiel pour améliorer la récupération de l’huile résiduelle des réservoirs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cela représentait une récupération assistée du pétrole. Par conséquent, l’eau contenant le mélange de biosurfactants était capable de récupérer 56,52 % de l’huile résiduelle de la colonne (tableau 1). D’autre part, des solutions de 10% de FDS, 10% de Tween 80 et 10% de saponine ont pu récupérer 85%, 68% et 73% d’huile résiduelle de la colonne.

où PV = volume des pores déterminé après saturation initiale de la colonne avec de la saumure, OOIP = huile d’origine en place, IOSV = volume initial de saturation en huile, POS = pourcentage de saturation en huile, S_v = volume de saumure ajouté pour la récupération secondaire, SOR = huile secondaire récupérée après l’inondation de la saumure, ROC = huile résiduelle dans la colonne après récupération secondaire, ROS = saturation en huile résiduelle, ROR = huile résiduelle récupérée après une inondation de biosurfactant, AOR = huile supplémentaire récupérée

Tableau 1 : Simulation de récupération assistée du pétrole dans une colonne de sable.

Figure 4 : Essais de dépistage pour la production de biosurfactants (a) Essai d’effondrement de goutte : La goutte d’eau ne s’est pas effondrée après avoir été ajoutée à la surface enduite d’huile, tandis que le tensioactif chimique et les surnageants sans cellules des trois souches bactériennes ont entraîné l’effondrement de la goutte. b) Essai de déplacement d’huile: La goutte d’eau n’a pas entraîné le déplacement de l’huile alors que le tensioactif chimique et les surnageants sans cellules des trois souches bactériennes ont déplacé les couches d’huile(c) Essai d’indice d’émulsion: Les surnageants libres de cellules et la solution de tensioactif commercial ont tous entraîné la formation d’un indice d’émulsion stable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Réduction de la tension superficielle due à la production de biosurfactants. La détermination de la réduction de la tension superficielle du milieu due à la croissance microbienne a confirmé la production de biosurfactant par les membres microbiens. En raison de la croissance de Rhodococcus sp. IITD 102 et Lysinibacillus sp. IITD 104, la tension superficielle du milieu est passée de 59 mN/m à 45 mN/m. En raison de la croissance de Paenibacillus sp. IITD 108, la tension superficielle du milieu est passée de 59 mN/m à 28 mN/m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 : Stabilité de l’émulsion à différentes (a) températures, (b) valeurs de pH et (c) concentrations de sel. Toutes les émulsions générées à l’aide des surnageants des trois souches microbiennes et du mélange de tensioactif commercial présentent une grande stabilité dans différentes conditions environnementales. Dans les plages de température, de pH et de concentration en sel testées, les indices d’émulsion déterminés étaient similaires et aucune réduction majeure de l’IE n’a été observée à des valeurs plus élevées des différents facteurs impliquant que le biosurfactant peut être utilisé dans des conditions environnementales extrêmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Caractérisation TLC des biosurfactants (a) Plaques colorées avec de la vapeur d’iode : Diverses taches développées sur la plaque TLC montrent que les biosurfactants extraits sont un mélange de divers composés contenant un groupe lipidique. Les taches marquées d’une flèche bleue représentent les biosurfactants, qui se sont colorés positivement pour la présence de fraction lipidique. Les autres taches représentent le reste des composés présents dans le mélange du biosurfactant brut. b) Plaques colorées à la ninhydrine: Aucune tache violette n’est apparue lorsque les plaques ont été colorées avec de la ninhydrine. Cela représentait l’absence d’acides aminés dans le mélange de biosurfactants et (c) des plaques colorées avec de l’anisaldéhyde: des taches vert clair et jaune sont apparues sur la plaque TLC et celles-ci représentent les composés contenant des sucres. Les taches marquées de flèches noires représentent les biosurfactants qui se sont colorés positivement pour la présence de la fraction glucidique. Les taches qui se sont colorées à la fois avec de l’iode et de l’anisaldéhyde représentent des composés contenant à la fois des fractions lipidiques et glucidiques et pourraient éventuellement être un biosurfactant glycolipide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Caractérisation chimique du biosurfactant extrait de Rhodococcus sp. IITD 102 et Lysinibacillus sp. IITD 104. (a) représente les spectres FT-IR des biosurfactants extraits de Rhodococcus sp. IITD 102 et Lysinibacillus sp. IITD 104, (b) représente les spectres RMN H¹ des biosurfactants extraits de Rhodococcus sp. IITD 102 et Lysinibacillus sp. IITD 104, et (c) montre la structure des biosurfactants bruts extraits de Rhodococcus sp. IITD 102 et Lysinibacillus sp. IITD 104. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Caractérisation chimique du biosurfactant extrait de Paenibacillus sp. IITD 108. (a) représente les spectres FT-IR des biosurfactants extraits de Paenibacillus sp. IITD 108, (b) représente les spectres RMN ¹H des biosurfactants extraits de Paenibacillus sp. IITD 108, et (c) montre la structure des biosurfactants bruts extraits de Paenibacillus sp. IITD 108. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure S1 : Structure des différents types de biosurfactants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau S1 : Effet des biosurfactants sur la tension interfaciale (IFT) entre l’eau et les hydrocarbures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les biosurfactants sont l’un des groupes les plus polyvalents de composants biologiquement actifs qui deviennent des alternatives attrayantes aux tensioactifs chimiques. Ils ont un large éventail d’applications dans de nombreuses industries telles que les détergents, les peintures, les cosmétiques, l’alimentation, les produits pharmaceutiques, l’agriculture, le pétrole et le traitement de l’eau en raison de leur meilleure mouillabilité, de leur CMC plus faible, de leur structure diversifiée et de leur respect de l’environnement¹⁸. Cela a conduit à un intérêt accru pour la découverte de plus de souches microbiennes capables de produire des biosurfactants. Ici, nous illustrons les méthodes de criblage, d’identification et d’application d’un mélange de biosurfactants produits par Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 et Paenibacillus sp. IITD 108, pour une récupération assistée du pétrole. La production de biosurfactants a été examinée par l’effondrement des gouttes, l’étalement d’huile, le dosage de l’indice d’émulsion et confirmée par la mesure de la réduction de la tension superficielle du milieu due à la croissance microbienne. Divers rapports sur la production de biosurfactants glycolipides (rhamnolipides et tréhalolipides) à partir de Rhodococcus sont disponibles dans la littérature 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. ont rapporté la production et l’optimisation d’un biosurfactant lipopeptide de Paenibacillus sp. alvei ARN63²⁵. Bezza et al. ont rapporté une biodégradation du pyrène par un biosurfactant lipopeptide produit par Paenibacillus dendritiformis CN5²⁶. La production de biosurfactants (lipopeptides et glycolipides) a également été rapportée par d’autres souches de Paenibacillus 27,28,29,30,31. Diverses espèces de Lysinibacillus ont été signalées pour produire des biosurfactants 32,33,34. Lysinibacillus sphaericus a été rapporté pour produire rhamnolipid capable de solubilisation des pesticides hydrophobes³⁵.

L’un des avantages des biosurfactants par rapport à leurs homologues chimiques est leur stabilité dans des conditions environnementales extrêmes. Les biosurfactants produits par Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 et Paenibacillus sp. IITD 108 ont été testés pour leur stabilité dans différentes plages de température, de pH et de concentrations de sel et se sont révélés stables sous des valeurs extrêmes de ces paramètres. Auparavant, Habib et al. ont rapporté un lipopeptide produit par Rhodococcus sp. dégradant les hydrocarbures qui a montré une stabilité dans différentes plages de températures, de valeurs de pH et de concentrations de sel³⁶. L’augmentation de la concentration de sels inorganiques a été rapportée pour augmenter la stabilité de l’émulsion³⁷. La tendance des colloïdes à s’agglomérer ou à se séparer est fonction des forces d’attraction (forces de Van der Walls) et répulsives (forces électrostatiques) qui sont impliquées lors de l’interaction des particules³⁸. Les cristaux de sel en se dissolvant dans l’eau établissent leurs propres charges électriques et les ions libérés s’adsorbent sur les gouttelettes d’émulsion. En augmentant la concentration en sel, l’expansion et la répulsion de la deuxième couche diminuent. En outre, plus la densité de charge d’un ion est élevée, plus la longueur de la couche électrique est faible. Ainsi, les cations divalents tels que Na²⁺ entraînent la formation d’émulsions plus stables par rapport aux cations monovalents³⁹.

Un autre avantage des biosurfactants par rapport aux tensioactifs chimiques est qu’ils sont biodégradables⁴⁰. Zeng et al. ont comparé les capacités de dégradation du tensioactif synthétique Triton X 100, des sulfonates d’alkylbenzène linéaires (LAS) et du rhamnolipide et ont constaté que le biosurfactant rhamnolipidique était complètement dégradé alors que LAS et Triton X 100 n’étaient que partiellement dégradés⁴¹. Liu et al. rapportent également que, contrairement aux tensioactifs synthétiques CTAB, Triton X 100 et SDS, les rhamnolipides ne présentent aucune toxicité et pourraient être facilement dégradés par B. subtilis et d’autres micro-organismes de compost⁴².

Les biosurfactants produits par les trois souches microbiennes se sont avérés être des glycolipides. Rhodococcus a déjà été rapporté pour produire glycolipide par divers groupes de recherche 20,21,23. Des rapports similaires sur la production de biosurfactants glycolipides par Lysinibacillus et Paenibacillus sont également disponibles dans la littérature 31,32,35,43,44. L’identification chimique des biosurfactants a révélé qu’il s’agissait de rhamnolipides. Les rhamnolipides sont la classe des biosurfactants glycolipides qui contiennent une ou deux unités de rhamnose reliées à une chaîne lipidique⁴⁵. Ce sont les types de biosurfactants les plus étudiés. Diverses souches microbiennes ont été signalées pour produire des rhamnolipides 7,46,47,48,49. Il a été signalé que les rhamnolipides présentent un potentiel élevé d’amélioration de la récupération de l’huile résiduelle ^50,51,52,53. Dans notre étude, nous avons constaté que le mélange de biosurfactants produit par Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 et Paenibacillus sp. IITD 108 a récupéré avec succès environ 56,52% de l’huile résiduelle dans un test simulé de colonne de sable. Cela a montré que le mélange de biosurfactants peut être utilisé pour la récupération de l’huile résiduelle des réservoirs souterrains. Dans un test similaire sur le sac de sable, Sun et al. ont rapporté que le biosurfactant a réussi à récupérer 50% de l’huile résiduelle⁵⁴. Les biosurfactants contenant du bouillon sans cellules de Bacillus subtilis ont également été signalés comme étant efficaces pour récupérer 33% de l’huile résiduelle⁵⁵. Des récupérations résiduelles du pétrole de 27 % et de 26 % à 36 % ont également été signalées par Darvishi et al. et Wahabi et ^al.56,57.

L’évaluation économique des biosurfactants pour la récupération de l’huile résiduelle des réservoirs montre que l’utilisation de biosurfactants dans l’EOR est une option économiquement viable. Moutinho et al. ont rapporté que le coût typique d’un biosurfactant commercial (rhamnolipides) est d’environ 59,6 USD par kg⁵⁸. Dans une autre étude, il a également été rapporté que la concentration de biosurfactant de 28 mg/L de biosurfactant a amélioré la récupération de l’huile résiduelle et a conduit à la production de 52,5^m3 d’huile supplémentaire⁵⁹. Les études ont montré qu’une concentration de biosurfactant de 10 mg/L était suffisante pour mobiliser la récupération de l’huile. Selon les données rapportées, la quantité de biosurfactant nécessaire pour produire 52,5 m³ d’huile supplémentaire est d’environ 0,525 kg. Le coût global de production de 52,5^m3 d’huile est d’environ 21463 dollars des États-Unis, dont seulement 30 dollars des États-Unis sont le coût de production du biosurfactant. Les données montrent que le coût en pourcentage du biosurfactant dans la production de pétrole par baril n’est que de 0,0000139%.

Nos résultats suggèrent que la combinaison des biosurfactants peut être utilisée efficacement pour récupérer l’huile résiduelle des réservoirs. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur l’amélioration de la récupération de l’huile résiduelle du réservoir à l’aide d’un mélange de biosurfactants produits par différentes souches microbiennes. Bien que notre étude décrive clairement les méthodes impliquées dans le criblage, la caractérisation structurale et l’application des biosurfactants dans la récupération assistée du pétrole, l’étude ne fournit pas de caractérisation fonctionnelle détaillée des biosurfactants, ce qui affecte leur efficacité dans diverses applications. La concentration micellaire critique, qui est la mesure de l’efficacité de tout tensioactif dans la formation des micelles et spécifie la concentration limite du tensioactif pour son utilisation significative, n’a pas été déterminée dans la présente étude⁶⁰. De même, la stabilité thermique du biosurfactant, qui détermine son applicabilité aux conditions du réservoir pour l’EOR, n’a pas non plus été décrite⁶¹. Les biosurfactants dans certaines applications sont également utilisés comme agents antibiofilm. Leur mouillabilité de surface joue un rôle important dans la détermination de leur nature antibiofilm. Les études de mouillabilité de surface n’ont pas non plus été réalisées dans le cadre du présent travail⁶². D’autres caractéristiques fonctionnelles importantes dans diverses applications de biosurfactants, notamment leur biodégradabilité et leur nature antimicrobienne, n’ont pas non plus été déterminées dans cette étude^63,64. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation structurale des biosurfactants. Selon l’application cible, une caractérisation fonctionnelle telle que la stabilité, la biodégradabilité et l’activité antimicrobienne peut être effectuée.

Dans le test d’effondrement de goutte et le test d’étalement d’huile, pour augmenter la visibilité, il est préférable d’utiliser une huile qui a une certaine couleur. Dans le test d’étalement d’huile, l’émulsion doit être observée après 24 h. Les mousses légères, si elles se forment, se désintègrent en 24 h. Les tensiomètres sont des instruments très sensibles, c’est pourquoi lors des mesures de tension superficielle, le récipient et la sonde doivent être nettoyés correctement avant chaque mesure afin d’éviter toute erreur due aux reports des dernières mesures. L’extraction du biosurfactant implique l’ajout d’un mélange de chloroforme méthanol au surnageant sans cellule. L’étape doit être effectuée soit dans une hotte de fumée, soit la fiole doit être recouverte de papier d’aluminium immédiatement après le transfert du mélange d’extraction. Lors de la récupération secondaire dans une expérience EOR, une solution de saumure doit être ajoutée en excès jusqu’à ce qu’aucune autre huile ne sorte de la colonne.

La méthode examine la portée du mélange de biosurfactants dans la récupération de l’huile résiduelle des colonnes. Le processus dépend de nombreux facteurs. Stade de croissance des microbes auquel les cultures initiales sont récoltées. Certains biosurfactants ont été signalés comme étant produits dans la phase logarithmique, tandis que d’autres ont été signalés comme étant produits dans la phase stationnaire. Les cultures doivent être récoltées en conséquence au stade particulier où la production de biosurfactant a atteint son maximum. Les tests de criblage des biosurfactants sont moins sensibles, donc tous les tests doivent être effectués avant de parvenir à une conclusion sur la capacité de production de biosurfactant d’une souche particulière. La purification du biosurfactant doit être effectuée avant la caractérisation chimique du biosurfactant si la concentration du biosurfactant est faible dans le biosurfactant brut. Les expériences de récupération assistée du pétrole dépendent fortement du type de sol utilisé pour emballer la colonne. Le sol doit être complètement sec et doit être tamisé pour éliminer les granulés plus gros et autres contaminants solides. Un mélange de sol sablonneux et de sol de jardin sec (dans un rapport égal) doit être préféré pour emballer la colonne. La sortie de la colonne doit être scellée correctement avec de la laine de verre et des perles de verre pour éviter les fuites de terre de la colonne au cours de l’expérience.

La méthode décrite est utile pour déterminer l’importance des biosurfactants produits et de leurs mélanges dans la récupération d’huile supplémentaire dans une expérience simulée de colonne de sable. Différents biosurfactants ont des spécificités différentes car ils contiennent différents groupes fonctionnels⁶⁵. Une combinaison de biosurfactants permettra la solubilisation de divers hydrocarbures et augmentera donc la récupération de l’huile résiduelle des réservoirs. La méthode décrite aidera à déterminer le potentiel des mélanges de biosurfactants dans des applications sur le terrain telles que la récupération assistée du pétrole à partir de puits de pétrole.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les auteurs tiennent à remercier le Département de biotechnologie du Gouvernement indien pour son soutien financier.