使用生物表面活性剂组合提高石油采收率

我们说明了筛选和鉴定产生生物表面活性剂的微生物的方法。还介绍了生物表面活性剂的色谱表征和化学鉴定方法，确定了生物表面活性剂在提高残油采收率方面的工业适用性。

生物表面活性剂是表面活性化合物，能够降低两个不同极性的相之间的表面张力。生物表面活性剂已成为化学表面活性剂的有前途的替代品，因为它具有较低的毒性，高生物降解性，环境相容性和对极端环境条件的耐受性。在这里，我们说明了用于筛选能够产生生物表面活性剂的微生物的方法。使用滴落塌陷，油扩散和乳液指数测定来鉴定产生生物表面活性剂的微生物。通过确定由于微生物构件的生长而导致的介质表面张力的降低，验证了生物表面活性剂的生产。我们还描述了生物表面活性剂表征和鉴定所涉及的方法。对提取的生物表面活性剂进行薄层色谱，然后对板进行差异染色以确定生物表面活性剂的性质。LCMS， ¹H NMR和FT-IR用于化学鉴定生物表面活性剂。我们进一步说明了评估所生产生物表面活性剂组合在模拟砂堆积柱中提高残余油采收率的方法。

生物表面活性剂是由微生物产生的两亲表面活性分子，具有降低表面和两相1之间的界面张力^的能力。典型的生物表面活性剂含有亲水部分，其通常由糖部分或肽链或亲水氨基酸组成，疏水部分由饱和或不饱和脂肪酸链²组成。由于其两亲性质，生物表面活性剂在两相之间的界面处组装并降低边界处的界面张力，这有助于一相分散到另一相^1，3中。迄今为止报道的各种类型的生物表面活性剂包括糖脂，其中碳水化合物 通过 酯键（例如，鼠李脂，三卤脂和桔梗脂）与长链脂肪族或羟基脂肪族酸相连，脂质附着在多肽链上的脂肽（例如，表面活性素和地衣官能素），以及通常由多糖 - 蛋白质复合物组成的聚合物生物表面活性剂（例如， 乳聚糖，脂质，阿拉桑和脂甘露聚糖）⁴。由微生物产生的其他类型的生物表面活性剂包括脂肪酸、磷脂、中性脂质和颗粒生物表面活性剂⁵.研究最多的一类生物表面活性剂是糖脂类，其中大多数研究都报告了鼠李糖脂⁶。鼠李糖含有一个或两个鼠李糖分子（形成亲水部分），与一个或两个长链脂肪酸分子（通常是羟基癸酸）相连。鼠李糖脂是首先从 铜绿假单胞菌⁷ 中报告的原代糖脂。

与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂因其提供的各种独特和独特的特性而受到越来越多的关注⁸.这些包括更高的特异性，更低的毒性，更大的多样性，易于制备，更高的生物降解性，更好的发泡性，环境相容性和极端条件下的活性⁹。生物表面活性剂的结构多样性（图S1）是另一个优点，使它们比化学对应物¹⁰更具优势。它们在较低浓度下通常更有效和高效，因为它们的临界胶束浓度（CMC）通常比化学表面活性剂¹¹低几倍。据报道，它们具有高度耐热性（高达100°C），并且可以耐受更高的pH值（高达9）和高盐浓度（高达50 g / L）¹² 因此在需要暴露在极端条件下的工业过程中具有多种优势¹³。生物降解性和较低的毒性使它们适用于环境应用，如生物修复。由于它们提供的优势，它们在食品，农业，洗涤剂，化妆品和石油工业等各个行业中得到了越来越多的关注¹¹.生物表面活性剂在石油修复中也引起了很多关注，以去除石油污染物和有毒污染物¹⁴。

在这里，我们报告了由 红球菌 IITD102， Lysinibacillus sp. IITD104和 Paenibacillus sp. IITD108生产的生物表面活性剂的生产，表征和应用。 图1概述了筛选，表征和应用生物表面活性剂组合以提高石油采收率所涉及的步骤。

图1:使用生物表面活性剂组合提高石油采收率的方法。 图中显示了逐步工作流程。这项工作分四个步骤进行。首先，通过各种测定对微生物菌株进行培养和筛选，以生产生物表面活性剂，包括滴坍试验，油扩散测定，乳化指数测定和表面张力测量。然后，从无细胞肉汤中提取生物表面活性剂，并使用薄层色谱法鉴定其性质，并使用LCMS，NMR和FT-IR进一步鉴定它们。在下一步中，将提取的生物表面活性剂混合在一起，并使用砂包柱技术确定所得混合物提高石油采收率的潜力。 请点击此处查看此图的大图。

通过滴坍，油铺，乳液指数测定和测定由于微生物生长引起的无细胞培养基表面张力的降低，对这些微生物菌株进行筛选以产生生物表面活性剂。通过LCMS， ¹H NMR和FT-IR提取，表征和化学鉴定生物表面活性剂。最后，制备了这些微生物产生的生物表面活性剂混合物，并用于回收模拟砂包柱中的残余油。

本研究仅说明了生物表面活性剂组合在提高残油采收率方面的筛选、鉴定、结构表征和应用方法。它没有提供由微生物菌株^15，16产生的生物表面活性剂的详细功能表征。执行各种实验，例如关键胶束测定，热重分析，表面润湿性和生物降解性，以对任何生物表面活性剂进行详细的功能表征。但由于本文是方法论文，因此重点在于生物表面活性剂组合在提高残油采收率方面的筛选、鉴定、结构表征和应用;这些实验尚未纳入本研究。

1. 微生物菌株的生长

1. 称取 2 克 Luria 肉汤粉，并在 250 mL 锥形瓶中加入 50 mL 蒸馏水。混合内容物，直到粉末完全溶解，并使用蒸馏水将体积制成100 mL。
2. 同样，再准备两个100 mL的Luria肉汤烧瓶，并将棉塞放在烧瓶的颈部。
3. 用铝箔覆盖棉塞，并在121°C和15 psi下高压灭菌烧瓶15分钟以灭菌培养基。
4. 高压灭菌后，让培养基冷却至室温。
5. 对于菌株的原代培养物的制备，使用接种环从LA板中挑选单个菌落，并接种在含有5mL无菌Luria肉汤的试管中。
6. 将试管在30°C下以180rpm孵育过夜。
7. 通过将1 mL过夜生长的种子培养物加入层流气流柜内的烧瓶中，接种含有100 mL高压灭菌的Luria肉汤的烧瓶。
8. 将烧瓶在旋转培养箱中以30°C和180rpm孵育7天。
9. 孵育期完成后，收获烧瓶并将培养液转移到离心管中。在4°C的冷冻离心机中以4，500× g 离心培养物20分钟。
10. 轻轻地将无细胞上清液倒入新鲜烧杯中，并将其用于生物表面活性剂生产的筛选测定。

2. 生物表面活性剂生产的筛选分析

注意:在以下各节中，商用表面活性剂（皂苷）用作阳性对照，而水和未接种的培养基用作阴性对照。

1. 跌落塌陷试验
   1. 取干净的载玻片，并在载玻片表面涂上200μL油。
   2. 向油的中心加入20μL无细胞上清液，并使其不受干扰2-3分钟。
      注意:如果液滴塌陷，则对生物表面活性剂存在的上清液进行正评分。
2. 油扩散试验
   1. 在培养皿（直径75毫米）中取20mL双蒸馏水，并在水面上加入200μL原油。
   2. 向油的中心加入20μL无细胞上清液，并使其不受干扰1分钟。
      注意:如果由于油驱赶而形成清除区，则将上清液评分为阳性，以确定生物表面活性剂的存在。
3. 乳化指数测定（E₂₄ 测定）
   1. 将4 mL汽油（汽油）和无细胞上清液分别加入干净的玻璃试管中。
   2. 剧烈涡旋混合物3分钟，并使其在接下来的24小时内不受干扰。
   3. 24小时后，确定E₂₄ 指数占乳化层高度（cm）相对于整个液体柱高度（cm）的百分比。
      
      注意:如果在24小时后观察到乳液（水包油或油中水），则上清液可能含有生物表面活性剂。
4. 表面张力测量
   注:表面张力是使用杜努伊环法¹⁷测量的。本实验中使用的仪器（见 材料表）非常灵敏，因此请确保正确清洁玻璃容器和探头。
   1. 打开系统并双击关联的软件将其打开。
   2. 用要确定其表面张力的液体清洁玻璃容器。
   3. 将液体（40 mL）加入容器中，并将容器安装在容器支架上。
   4. 解锁探头支架并将其安装在其上。现在，通过按手动控制器上的 锁定按钮锁定 探头支架。
   5. 使用手动控制器，调整平台的高度，使探头距离液体表面约2-3毫米。
   6. 现在使用软件测量表面张力。单击位于屏幕左上角面板上的 "文件 "。单击" 打开工作区"。将出现一个弹出窗口。
   7. 向下滚动并双击 K100:表面和界面张力 图标。
   8. 现在，单击位于屏幕左上角 的文件 图标。单击" 新建数据库"。输入用于保存数据的名称，然后单击 确定。
   9. 再次单击" 文件> SFT >环>新建测量"。输入测量的名称。确保配置模板显示 SFT 环。
   10. 通过选择探头和用于测量的容器，在 "测量配置" 窗口中填写详细信息。另外，填写液体和气相的详细信息。
       注意:液相将是水，而气相将是空气。液相的密度是无细胞上清液的密度。这可以通过取50 mL液体的重量并计算密度为Kg / m³来确定。
   11. 现在单击" 过程 "选项卡并填写以下详细信息: 检测速度:6 mm/min，检测灵敏度:0.005 g，搜索速度:6 mm/min，搜索灵敏度:0.005 g，测量速度:3 mm/min，测量灵敏度:0.001 g，浸入深度:3 mm，返回距离:10%，校正: Harkins & Jordan，最大值: 5。单击 确定。
   12. 在弹出窗口中，选择要存储数据的数据库，然后单击 确定。
       注意:可以在此处创建新数据库或向现有数据添加新的测量值。
   13. 现在点击 位于屏幕顶部中心的" 播放 "按钮。系统将开始执行脚本。系统稳定后，它将检测表面。将探头浸入液体中，来回移动探头并检测形成的薄片中的张力。
   14. 要获得结果，请单击屏幕左中侧的 "测量 "图标。单击" 数据 "并记下确定的表面张力。
   15. 测量完成后，降低平台的高度，从仪器上解锁和卸载探头和容器。
       注意:为了确定由于生物表面活性剂生产而导致的表面张力降低，应使用未接种的LB作为对照。

3. 生物表面活性剂提取

1. 使用2 N HCl将细胞游离上清液的pH调节至2，将混合物在4°C下储存过夜。
2. 向上清液中加入等体积的氯仿 - 甲醇混合物（2:1），并剧烈混合20分钟。
3. 保持混合物不受干扰，以便进行相分离。
4. 除去含有水和甲醇的上相，将含有生物表面活性剂的下相留在通风橱中蒸发。
5. 有机相蒸发后，将蜂蜜色的粗生物表面活性剂重新溶解在3mL氯仿中，并使用该混合物进一步鉴定和表征生物表面活性剂。

4. 乳液稳定性研究

1. 不同温度下的乳液稳定性
   1. 在不同的试管中取5 mL无细胞上清液。
   2. 向每个试管中加入5 mL汽油，并通过涡旋3分钟剧烈混合。
   3. 将试管在不同温度（30°C，40°C，50°C，60°C和70°C）的不同水浴中孵育过夜。
   4. 24小时后，如前所述估计乳液指数。
2. 不同pH值下的乳液稳定性
   1. 在干净的试管中取5mL无细胞上清液。
   2. 使用1 N HCl和1 N NaOH调节无细胞上清液（2，4，6，8和10）的pH值。
   3. 向试管中加入等量的汽油，并通过涡旋3分钟剧烈混合。
   4. 将试管在室温下保持不受干扰24小时。
   5. 如前所述估计乳液指数。
3. 不同盐浓度下的乳液稳定性
   1. 在干净的试管中取5mL无细胞上清液。
   2. 向上清液中加入不同量的盐（NaCl）（0 g / L，5 g / L，10 g / L，20 g / L，60 g / L和80 g / L）。
   3. 通过涡旋3分钟溶解细胞游离上清液中的盐。
   4. 向试管中加入等量的汽油，并通过涡旋3分钟剧烈混合。
   5. 将试管在室温下保持不受干扰24小时。
   6. 估计24小时后的乳液指数。

5. 确定生物表面活性剂的性质

1. 提取的生物表面活性剂的TLC
   1. 在TLC板上发现20μL生物表面活性剂。一次光斑2μL。
   2. 在三种不同的TLC板上发现生物表面活性剂。
   3. 制备含有氯仿:甲醇（2:1）的淋洗液的100mL混合物，并将淋洗液加入TLC室。关闭腔室的盖子，让它饱和20分钟。
   4. 干燥板后，将TLC板置于用氯仿甲醇混合物饱和的腔内并运行TLC。
   5. 淋洗液到达TLC板的顶部（距顶部1厘米）后，取出板并使其风干。
2. 用于脂质检测的染色
   1. 取一个干净的TLC室，将一些（5-10）粒碘加入新鲜室中，并在室中饱和5至10分钟。
   2. 将TLC板放在腔内，观察黄色斑点的发展。如果出现斑点，则将生物表面活性剂评分为脂质成分的存在。
3. 用于肽或氨基酸检测的染色
   1. 通过将0.4g茚三酮溶解在20mL丁醇中来制备茚三酮溶液。向混合物中加入0.6 mL 100%冰醋酸。
   2. 用茚三酮溶液喷洒TLC板，让它风干2分钟。在110°C下加热板并观察颜色的发展。
      注意:如果出现蓝色斑点，则将生物表面活性剂评分为阳性，以发现任何肽链或氨基酸的存在。
4. 用于碳水化合物检测的染色
   1. 通过在含有1 mL_{H 2SO 4}的48 mL冰醋酸中加入2 mL对茴香醛来制备对茴香醛溶液。向混合物中加入0.6mL乙酸。
   2. 将混合物均匀地喷洒在TLC板上，让其风干2分钟。
   3. 将板在110°C下孵育并监测斑点的发展。
      注意:如果出现绿色或棕色斑点，请将生物表面活性剂评分为阳性，以发现任何碳水化合物的存在。

6. 生物表面活性剂的化学鉴定

1. 生物表面活性剂的LCMS
   1. 将25mg提取的生物表面活性剂溶解在1mL氯仿中。
   2. 使用 C18 色谱柱执行 LCMS（在锁定喷涂配置中，参考扫描频率为 10 s）。
   3. 使用氯仿:甲醇（1:1）作为流动相，并以0.1 mL / min的流速将2μL样品注入色谱柱中。
   4. 将实验参数设置为:极性:ES正，毛细管电压:3 kV，源温度:80°C，脱溶温度:300°C，脱溶气体流量:7，000 L/h，捕集气流量:0.40 mL/min。
   5. 在20分钟的检测时间内扫描100至1，200 Da的范围，并在正ES模式下测量离子。
   6. 使用任何质谱定量软件分析m / z值。
   7. 要进行分析，请登录软件。
   8. 单击 批量搜索 ，然后输入获得的质量列表。在正电荷模式下测量结果，并使用M + H和M + Na作为加合物。在 显示结构上保持精度为 10 PPM 和滴答声。
   9. 单击" 搜索 "，然后从化合物列表中选择PPM水平最低的化合物。
2. ^{1 个}生物表面活性剂的H NMR
   注意:使用400 MHz NMR光谱仪对生物表面活性剂进行了 ¹H NMR（参见 材料表）。
   1. 将5mg生物表面活性剂溶解在1mL氘化氯仿（CdCl₃）中。
   2. 将混合物转移到NMR管中。正确盖上管子，然后将管子插入扳手中。使用调节管调整管的高度。
   3. 将管子与扳手一起放入NMR机器中，然后按照下面提到的步骤获得NMR光谱。
   4. 要选择样品管类型:sx N，其中N是相关软件中放置管的位置（例如，sx 13，如果管放置在^第 13个位置）。
   5. 键入 edc 并按 Enter 键以创建可在其中存储数据的新文件夹。
   6. 将出现一个弹出窗口。通过单击列表中的CdCl ₃ 选择溶剂，然后输入样品的名称。
   7. 要启动协议，请键入"getprosol";要锁定溶剂，请键入"锁定 cdcl3"。
   8. 键入"topshim"以填充样本，最后键入"rga;zgefp"以获取数据。这将启动协议。
   9. 获得光谱后，键入"apk;abs n"，然后按回车键进行相位和基线校正。
   10. 要选择主峰，请键入"pp"并按 Enter 键。要仅选择强烈峰值，请输入"mi"并键入应选择峰值的强度。默认值为 0.2。
   11. 要积分峰值，请单击 积分并将光 标放在要积分的峰值的左侧，同时按住光标单击并在峰值周围拖动光标。
   12. 通过单击左上角的" 文件 "保存数据，然后单击" 保存"。
   13. 可以通过键入"sx ej"将样本从机器中弹出。
   14. 分析峰并确定H原子的环境。
3. 生物表面活性剂的傅里叶变换红外光谱
   注意:提取的生物表面活性剂的FT-IR在ATR模式下使用市售分光光度计进行（参见 材料表）。
   1. 打开分光光度计，检查吹扫、干燥剂和检测器。
   2. 要收集光谱，请首先收集背景光谱，而无需放置样本。
   3. 取提取的生物表面活性剂并完全干燥。将干燥的生物表面活性剂直接放在金刚石晶体上，施加压力并按ATR接触点。
   4. 在软件中，选择扫描次数（输入30），然后扫描从400 ^cm-1 到4，000 ^cm-1的光谱。
   5. 单击 "确定" 将样本光谱添加到光谱窗口。
   6. 单击"文件">"保存>"另存为"，然后输入文件扩展名 .spa，然后单击"确定"。

7. 生物表面活性剂应用（提高石油采收率）

注意:在本实验中，使用双蒸馏水作为阴性对照，并使用10%SDS，10%吐温80和10%商业皂苷作为阳性对照。

1. 取杯，用玻璃棉和玻璃珠密封底部出口。
2. 用沙质土壤包装柱子，这样可以在土壤顶部添加一些液体，并且可以在底部收集流经。将立柱安装在支架上，并在土壤顶部添加一些玻璃珠。
3. 用50 mL盐水溶液淹没色谱柱，并收集流过以确定孔隙体积。
   孔体积=顶部添加的盐水体积 - 收集的流出量。
4. 从塔的顶部添加后，通过迫使原油通过柱子，从塔中除去盐水。收集盐水和从色谱柱中流出的油的体积，以确定初始油饱和体积。从色谱柱中释放的盐水体积将是初始油饱和体积或原油到位。
5. 保持柱子不受干扰24小时。
6. 24 h后，用10孔体积的盐水淹没柱，并收集从柱中出来的油以估计二次采油率。二次采油后留在塔中的油对应于残余油。
7. 通过在玻璃烧杯中加入等体积的提取的生物表面活性剂（步骤3.5后提取）来制备生物表面活性剂的混合物。将生物表面活性剂加入柱的顶部，并将柱孵育24小时。
8. 24小时后，测量油和水的量以确定额外或增强的油采收率。从色谱柱中释放的油的体积将对应于回收的残余油。
9. 使用以下等式估算提高的石油采收率:
   

通过各种测定筛选了三种细菌菌株（红球菌 属IITD102， 利西尼巴西勒 属IITD104和 帕尼巴西鲁斯 属IITD108）用于生产生物表面活性剂，包括滴塌法，油置换测定，乳化指数测定和表面张力降低。所有三种细菌菌株的无细胞上清液和化学表面活性剂溶液导致滴剂塌陷，因此生物表面活性剂的存在评分为阳性（图4a）。另一方面，水滴没有塌陷，因此生物表面活性剂的存在得分为负数。三种细菌培养物的商用表面活性剂和游离细胞上清液也成功地取代了油扩散测定中的油层，因此，生物表面活性剂的存在得分为阳性（图4b）。另一方面，水不能取代任何石油，因此得分为负数。在乳液指数测定中，在含有商用表面活性剂和三种微生物菌株上清液的试管中观察到稳定的乳液。然而，在含有未接种培养基的试管中未观察到乳液（图4c）。这再次表明 ，红球菌 属IITD102， 莱西尼巴西菌 IITD104和 Paenibacillus 属IITD108产生生物表面活性剂。通过测量无细胞肉汤的表面张力并将其与未接种的对照进行比较，获得了生物表面活性剂生产的确认。发现 红球菌 属IITD102， 赖西尼巴西勒 属IITD104和 Paenibacillus 属IITD108的生物表面活性剂分别将培养基的表面张力从58.89 mN / m降低到45.41 mN / m，45.82 mN / m和28.43 mN / m（图5）。

IFT测量是使用拉环法进行的。来自所有三种菌株的生物表面活性剂能够显着降低各种水相和有机相之间的界面张力（表S1）。表面张力和界面张力测量结果证实，所有三种菌株都产生生物表面活性剂。

从 红球菌 属IITD102， 利西尼巴西菌 属IITD104和 Paenibacillus 属IITD108的无细胞培养物中溶剂提取生物表面活性剂的生物表面活性剂浓度分别为820mg / L，560mg / L和480mg / L。

如图 4C所示，由生物表面活性剂形成的乳液是油中的水微乳液。乳液稳定性测定表明，生物表面活性剂在各种环境条件下表现出良好的稳定性（图6）。产生的乳液在测试的不同温度（图6a），pH值（图6b）和盐浓度（图6c）下都非常稳定。

进行薄层色谱以确定生物表面活性剂的性质。用碘蒸气染色板导致所有生物表面活性剂和对照中出现黄色斑点（来自 芽孢杆菌 属IITD 106的生物表面活性剂（图7a）。这表明生物表面活性剂含有脂质部分。用茚三酮染色后，在任何TLC板中均未获得蓝色斑点（图7b）。这表明生物表面活性剂不含任何肽部分。当用茴香醛染色剂染色时，在所有TLC板中观察到蓝色和绿色斑点（图7c）。这表明生物表面活性剂含有碳水化合物部分。从TLC的结果中可以得出结论，所有的生物表面活性剂都是糖脂。

使用LCMS对生物表面活性剂进行化学鉴定表明， 红球菌 属IITD102和 Lysinibacillus 属IITD104产生相同类型的生物表面活性剂，被鉴定为二鼠李糖吡喃酸羟基癸酸，质量为480.25 Da。生物表面活性剂的结构由 ¹H NMR和FT-IR数据支持（图8）。

在 ¹H NMR光谱中，在7.2处获得的化学位移代表了羧基的质子。对应于甲基质子的化学位移在1-2 ppm的范围内获得。在2.3 ppm下获得与烷基连接的质子相对应的位移。从 红球菌 属IITD102和 赖西尼巴西菌 属IITD104中提取的生物表面活性剂的^FT-IR光谱显示波数为3，290 cm-1处存在强峰，这证实了OH官能团的存在。波数为2，951 ^cm-1 的小峰对应于CH拉伸。1，620 ^cm-1 处的强峰表示生物表面活性剂中存在羧基。在1，530，1，410，1，200和1，060处获得的其他峰分别证实了烷基，CH₃，C-O-C和C-CH₃ 官能团的存在。NMR和FT-IR数据都支持从LCMS研究中确定的生物表面活性剂的结构。来自 Paenibacillus sp. IITD108的粗生物表面活性剂的LCMS（图9）表明它产生含有三个脂质链的鼠李脂，形成生物表面活性剂的本体疏水核心。生物表面活性剂被鉴定为2癸酰基）-αL鼠李糖基-3-羟基癸酸，质量为802 Da。 ^LCMS的结果得到了1 H NMR和FT-IR数据的支持。

提高石油采收率的设置如图 2所示。

图 2:使用砂包柱技术提高石油采收率的实验设置。 装满土壤的柱子安装在支架上。底部出口用玻璃棉和玻璃珠密封。经过二次回收后，通过向塔内加入生物表面活性剂混合物来提高油的回收率。放置在柱底部的管用于收集洗脱的馏分。 请点击此处查看此图的大图。

在模拟的增强采油实验中，在柱顶加入50 mL盐水中，在流出中收集了12 mL，因此，孔体积估计为38 mL。当油被迫通过色谱柱时，33 mL盐水从色谱柱中释放出来。这表示初始油饱和量。使用 10 孔体积的盐水进行二次回收，洗脱了 10 mL 油。柱中残留的油为23 mL。含有生物表面活性剂混合物的水能够从色谱柱中回收13 mL油（图3）。

图 3:使用砂包柱模拟提高采收率。 对照柱和试验柱的初始油饱和容积均约为33 mL。在二次采油期间，从对照柱和试验柱中回收了约10 mL的油。只有在回收塔中残留的残余油时，才观察到测试柱和控制柱的回收曲线的差异。生物表面活性剂混合物进一步回收了从测试柱中留下的13 mL残余油，而在对照柱中，此步骤中仅回收了1.03 mL油。这表明，生物表面活性剂混合物在提高储集层残余油的采收率方面具有巨大的潜力。 请点击此处查看此图的大图。

这代表了石油采收率的提高。因此，含有生物表面活性剂混合物的水能够从色谱柱中回收56.52%的残余油（表1）。另一方面，10%SDS，10%吐温80和10%皂苷的溶液能够从色谱柱中回收85%，68%和73%的残油。

其中PV =用盐水初始柱饱和后确定的孔隙体积，OOIP =原油到位，IOSV =初始油饱和体积，POS =油饱和度百分比，S_v =为二次采收后的盐水体积，SOR =盐水驱后回收的二次油，ROC =二次采收后的柱中残油，ROS =残油饱和，ROR =生物表面活性剂驱油后回收的残油， AOR = 回收的额外油

表 1:在砂包柱中模拟增强的石油采收率。

图4:用于生物表面活性剂生产的筛选测定 （a）滴剂塌陷测定:水滴在添加到油涂层表面后没有塌陷，而三种细菌菌株的化学表面活性剂和无细胞上清液导致滴坠塌陷。（b） 驱油试验:水滴不会导致油的置换，而三种细菌菌株的化学表面活性剂和无细胞上清液取代了油层（c） 乳化指数测定:无细胞上清液和商用表面活性剂溶液都形成稳定的乳化指数。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:由于生物表面活性剂生产而导致的表面张力降低。 由于微生物生长而导致的介质表面张力降低的测定证实了微生物构件产生的生物表面活性剂。由于 红球菌 属IITD 102和 Lysinibacillus 属IITD 104的生长，培养基的表面张力从59 mN / m降低到45 mN / m。由于IITD 108属 Paenibacillus 的生长，培养基的表面张力从59 mN / m降低到28 mN / m 。

图 6:乳液在各种 （a） 温度、（b） pH 值和 （c） 盐浓度下的稳定性。 使用三种微生物菌株的上清液和商用表面活性剂的混合物产生的所有乳液在不同的环境条件下都显示出极大的稳定性。在测试的温度，pH和盐浓度范围内，确定的乳液指数相似，并且在不同因素的较高值下未观察到EI的显着降低，这意味着生物表面活性剂可以在极端环境条件下使用。 请点击此处查看此图的大图。

图7:生物表面活性剂的TLC表征（a）用碘蒸气染色的板:在TLC板上形成的各种斑点表明提取的生物表面活性剂是含有脂质基团的各种化合物的混合物。用蓝色箭头标记的斑点代表生物表面活性剂，其染色阳性，以发现脂质部分的存在。其他斑点代表粗生物表面活性剂混合物中存在的其余化合物。（b） 用茚三酮染色的板:用茚三酮染色的板材时，没有出现紫色斑点。这表示生物表面活性剂混合物中没有任何氨基酸，（c）用茴香醛染色的板:TLC板上出现浅绿色和黄色斑点，这些代表含有糖的化合物。用黑色箭头标记的斑点代表生物表面活性剂，其染色阳性，以确认碳水化合物部分的存在。用碘和茴香醛染色的斑点代表含有脂质和碳水化合物部分的化合物，可能是糖脂生物表面活性剂。 请点击此处查看此图的大图。

图8:从红球菌属IITD 102和Lysinibacillus属IITD 104中提取的生物表面活性剂的化学表征。 （a） 表示从视黄球菌属 IITD 102 和赖西尼巴西菌属 IITD 104 中提取的生物表面活性剂的 FT-IR 光谱，（b） 表示从红球菌属 IITD¹⁰² 和利西尼巴西菌属 IITD 104 中提取的生物表面活性剂的 H 1 NMR 光谱，以及 （c） 显示从红球菌属 IITD 102 和赖西尼巴西菌属 IITD 104 中提取的粗生物表面活性剂的结构。请点击此处查看此图的大图。

图9:从IITD 108型Paenibacillus sp. IITD中提取的生物表面活性剂的化学表征。 （a）代表从IITD 108属Paenibacillus提取的生物表面活性剂的FT-IR光谱，（b）代表从Paenibacillus属IITD ¹⁰⁸中提取的生物表面活性剂的1 H NMR光谱，（c）表示从Paenibacillus属IITD 108中提取的粗生物表面活性剂的结构。请点击此处查看此图的大图。

图S1:不同类型的生物表面活性剂的结构。请点击此处下载此文件。

表S1:生物表面活性剂对水和碳氢化合物之间界面张力（IFT）的影响。请按此下载此表格。

生物表面活性剂是最通用的生物活性成分之一，正在成为化学表面活性剂的有吸引力的替代品。它们具有更好的润湿性，较低的CMC，多样化的结构和环保性，因此在洗涤剂，油漆，化妆品，食品，制药，农业，石油和水处理等众多行业中具有广泛的应用¹⁸.这导致人们越来越有兴趣发现更多能够生产生物表面活性剂的微生物菌株。在这里，我们说明了筛选，鉴定和应用由红球菌IITD 102，Lysinibacillus sp. IITD 104和Paenibacillus sp. IITD 108产生的生物表面活性剂混合物的方法，以提高石油采收率。通过滴落塌陷，油铺展，乳液指数测定筛选生物表面活性剂生产，并通过测量微生物生长引起的介质表面张力降低来确认。关于红球菌生产糖脂生物表面活性剂（鼠李脂和海藻脂）的各种报告可在文献^{19，20，21，22，23，24}中找到。Najafi等人报道了从Paenibacillus sp. alvei ARN63²⁵生产和优化脂肽生物表面活性剂。Bezza等人报道了由树突状芘产生的脂肽生物表面活性剂CN5²⁶的生物降解。生物表面活性剂生产（脂肽和糖脂）也被其他菌株^{27，28，29，30，31}报道。据报道，各种Lysinibacillus可产生生物表面活性剂^32，33，34。据报道，麦氏裂头蚴可产生能够溶解疏水性农药³⁵的鼠李糖脂。

与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂的优势之一是它们在极端环境条件下的稳定性。对红球菌属IITD 102、利西尼巴西菌IITD 104和IITD108幼孢杆菌生产的生物表面活性剂进行测定，测定其在不同温度、pH值和盐浓度范围内的稳定性，并在这些参数的极值下稳定。此前，Habib等人报道了一种由碳氢化合物降解红球菌属产生的脂肽，该肽在不同的温度范围，pH值和盐浓度³⁶上显示出稳定性。据报道，增加无机盐浓度可增加乳液³⁷的稳定性。胶体团聚或分离的趋势是粒子相互作用过程中涉及的吸引力（范德壁力）和排斥力（静电力）的函数³⁸。盐晶体溶解到水中时建立自己的电荷，释放的离子吸附到乳液液滴上。在增加盐浓度时，第二层的膨胀和排斥减少。此外，离子的电荷密度越高，电层的长度就越小。因此，与一价阳离子³⁹相比，二价阳离子如Na^{2 +}导致形成更稳定的乳液。

与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂的另一个优点是它们是可生物降解的⁴⁰。Zeng等人比较了合成表面活性剂Triton X 100、直链烷基苯磺酸盐（LAS）和鼠李糖脂的降解能力，发现鼠李脂生物表面活性剂完全降解，而LAS和Triton X 100仅部分降解⁴¹.Liu等人还报告说，与合成表面活性剂CTAB、Triton X 100和SDS相比，鼠李脂没有毒性，并且容易被 枯草芽孢杆菌 和其他堆肥微生物降解⁴²。

所有三种微生物菌株产生的生物表面活性剂都被发现是糖脂。Rhodococcus先前被各种研究小组报道产生糖脂^20，21，23。关于Lysinibacillus和Paenibacillus生产糖脂生物表面活性剂的类似报告也可在文献^31，32，^35，43，44中找到。生物表面活性剂的化学鉴定显示它们是鼠李脂。鼠李糖脂是一类糖脂生物表面活性剂，其含有一个或两个连接到脂质链⁴⁵的鼠李糖单元。它们是研究最多的生物表面活性剂类型。据报道，各种微生物菌株产生鼠李脂^{7，46，47，48，49}。据报道，鼠李糖脂在提高残余油回收率方面表现出很高的潜力^{50，51，52，53}。在我们的研究中，我们发现由红球菌属IITD 102，利西尼巴西菌属IITD 104和Paenibacillus属IITD 108产生的生物表面活性剂混合物在模拟砂包柱测试中成功回收了约56.52%的残余油。这表明生物表面活性剂的混合物可用于从地面储层中回收残余油。在类似的砂包试验中，Sun等人报告说，生物表面活性剂成功地回收了50%的残余油⁵⁴。据报道，含有枯草芽孢杆菌无细胞肉汤的生物表面活性剂也可有效回收33%的残余油⁵⁵。Darvishi等人和Wahabi等人也报告了27%和26%-36%的残余油采收率。^56，57。

对用于回收储层残余油的生物表面活性剂的经济评价表明，在提高额尔中利用生物表面活性剂在经济上是一种可行的选择。Moutinho等人报告说，商业生物表面活性剂（鼠李糖脂）的典型成本约为^每公斤589.6美元。在另一项研究中，还报告了生物表面活性剂浓度为28 mg / L的生物表面活性剂提高了残余油的采收率，并导致生产了52.5 m³ 的额外油⁵⁹。研究表明，10 mg/L的生物表面活性剂浓度足以调动石油采收率。根据报告的数据，生产52.5米³ 的附加油所需的生物表面活性剂量约为0.525千克。5250万³ 种油的总生产成本约为21463美元，其中只有30美元是生物表面活性剂的生产成本。数据显示，生物表面活性剂在每桶石油产量中的成本百分比仅为0.0000139%。

我们的结果表明，生物表面活性剂的组合可以有效地用于从储层中回收残余油。据我们所知，这是第一份关于使用不同微生物菌株产生的生物表面活性剂混合物提高储层残余油回收率的报告。虽然我们的研究清楚地描述了生物表面活性剂在提高石油采收率中筛选，结构表征和应用的方法，但该研究没有提供生物表面活性剂的详细功能表征，这影响了它们在各种应用中的效率。临界胶束浓度，其是衡量任何表面活性剂在形成胶束方面的效率并指定表面活性剂用于其有意义用途的限制浓度，在本研究⁶⁰中尚未确定。类似地，生物表面活性剂的热稳定性，其决定了其在储层条件下对EOR的适用性，⁶¹也未被描述。生物表面活性剂在某些应用中也用作抗生素。它们的表面润湿性在决定其抗菌膜性质方面起着重要作用。表面润湿性研究在本工作中也尚未进行⁶²。在生物表面活性剂的各种应用中重要的其它功能特性，包括它们的生物降解性和抗微生物性质，在本研究中也尚未确定^63，64。因此，我们专注于生物表面活性剂的结构表征。根据目标应用，可以进行功能表征，例如稳定性，生物降解性和抗菌活性。

在滴坍试验和油扩散测定中，为了增加能见度，最好使用具有一定颜色的油。在油扩散测定中，应在24小时后观察乳液。轻质泡沫如果形成，将在24小时内分解。张力计是非常灵敏的仪器，因此在表面张力测量期间，每次测量前应正确清洁容器和探头，以避免由于最后一次测量的残留而导致的任何误差。生物表面活性剂的提取涉及将氯仿甲醇混合物添加到无细胞上清液中。该步骤应在通风橱中进行，或者在转移提取混合物后立即用铝箔覆盖烧瓶。在EOR实验的二次回收期间，应过量加入盐水溶液，直到没有进一步的油从色谱柱中出来。

该方法讨论了生物表面活性剂混合物在从色谱柱中回收残油中的范围。该过程取决于许多因素。收获初始培养物的微生物的生长阶段。据报道，一些生物表面活性剂是在对数阶段生产的，而另一些则是在静止阶段生产的。应在生物表面活性剂生产达到最大值的特定阶段相应地收获培养物。生物表面活性剂筛选测定不太敏感，因此所有测定都应在得出有关特定菌株的生物表面剂生产能力的结论之前进行。如果生物表面活性剂在粗生物表面活性剂中的浓度较低，则应在生物表面活性剂的化学表征之前进行生物表面活性剂的纯化。提高石油采收率实验高度依赖于用于填充色谱柱的土壤类型。土壤必须完全干燥，并应过筛以去除较大的颗粒和其他固体污染物。沙质土壤和干燥花园土壤的混合物（比例相等）应优选用于填充柱。塔出口必须用玻璃棉和玻璃珠正确密封，以避免在实验过程中从塔中泄漏污垢。

所描述的方法可用于确定在模拟的砂堆积柱实验中产生的生物表面活性剂及其混合物在回收额外油中的意义。不同的生物表面活性剂具有不同的特异性，因为它们含有不同的官能团⁶⁵。生物表面活性剂的组合将使各种碳氢化合物的溶解成为可能，因此将增加储层的残余石油采收率。所描述的方法将有助于确定生物表面活性剂混合物在现场应用中的潜力，例如提高油井的石油采收率。

作者声明没有利益冲突。

作者要感谢印度政府生物技术部的财政支持。