Recuperación mejorada de petróleo utilizando una combinación de biosurfactantes

Ilustramos los métodos involucrados en el cribado y la identificación de los microbios productores de biosurfactantes. También se presentan métodos para la caracterización cromatográfica y la identificación química de los biosurfactantes, determinando la aplicabilidad industrial del biosurfactante en la mejora de la recuperación de aceite residual.

Los biosurfactantes son compuestos tensoactivos capaces de reducir la tensión superficial entre dos fases de diferentes polaridades. Los biosurfactantes han surgido como alternativas prometedoras a los tensioactivos químicos debido a la menor toxicidad, la alta biodegradabilidad, la compatibilidad ambiental y la tolerancia a condiciones ambientales extremas. Aquí, ilustramos los métodos utilizados para la detección de microbios capaces de producir biosurfactantes. Los microbios productores de biosurfactantes se identificaron mediante el colapso de gotas, la propagación del aceite y los ensayos de índice de emulsión. La producción de biosurfactantes se validó determinando la reducción de la tensión superficial del medio debido al crecimiento de los miembros microbianos. También describimos los métodos involucrados en la caracterización e identificación de biosurfactantes. Se realizó cromatografía en capa delgada del biosurfactante extraído seguido de tinción diferencial de las placas para determinar la naturaleza del biosurfactante. LCMS, ¹H NMR y FT-IR se utilizaron para identificar químicamente el biosurfactante. Ilustramos además los métodos para evaluar la aplicación de la combinación de biosurfactantes producidos para mejorar la recuperación de aceite residual en una columna de paquete de arena simulada.

Los biosurfactantes son las moléculas anfipáticas tensoactivas producidas por microorganismos que tienen la capacidad de reducir la superficie y la tensión interfacial entre dos fases¹. Un biosurfactante típico contiene una parte hidrofílica que generalmente se compone de una fracción de azúcar o una cadena peptídica o aminoácido hidrófilo y una parte hidrofóbica que se compone de una cadena de ácidos grasos saturados o insaturados². Debido a su naturaleza anfipática, los biosurfactantes se ensamblan en la interfaz entre las dos fases y reducen la tensión interfacial en el límite, lo que facilita la dispersión de una fase en la otra ^1,3. Varios tipos de biosurfactantes que se han reportado hasta ahora incluyen glicolípidos en los que los carbohidratos están vinculados a ácidos alifáticos o hidroxi-alifáticos de cadena larga a través de enlaces éster (por ejemplo, ramnolípidos, trehalolipípidos y soforolipídicos), lipopéptidos en los que los lípidos se unen a cadenas polipeptídicas (por ejemplo, surfactina y liquenina) y biosurfactantes poliméricos que generalmente se componen de complejos polisacáridos-proteínas (por ejemplo, emulsano, liposan, alasan y lipomanano)⁴. Otros tipos de biosurfactantes producidos por los microorganismos incluyen ácidos grasos, fosfolípidos, lípidos neutros y biosurfactantes de partículas⁵. La clase de biosurfactantes más estudiada son los glicolípidos y entre ellos la mayoría de los estudios se han reportado sobre ramnolípidos⁶. Los ramnolípidos contienen una o dos moléculas de ramnosa (que forman la parte hidrofílica) unidas a una o dos moléculas de ácido graso de cadena larga (generalmente ácido hidroxi-decanoico). Los ramnolípidos son glicolípidos primarios reportados primero a partir de Pseudomonas aeruginosa⁷.

Los biosurfactantes han ido ganando cada vez más atención en comparación con sus contrapartes químicas debido a varias propiedades únicas y distintivas que ofrecen⁸. Estos incluyen mayor especificidad, menor toxicidad, mayor diversidad, facilidad de preparación, mayor biodegradabilidad, mejor formación de espuma, compatibilidad ambiental y actividad en condiciones extremas⁹. La diversidad estructural de los biosurfactantes (Figura S1) es otra ventaja que les da una ventaja sobre las contrapartes químicas¹⁰. Generalmente son más efectivos y eficientes a concentraciones más bajas, ya que su concentración crítica de micelas (CMC) suele ser varias veces menor que los tensioactivos químicos¹¹. Se ha informado que son altamente termoestables (hasta 100 °C) y pueden tolerar un pH más alto (hasta 9) y altas concentraciones de sal (hasta 50 g/L)¹² , por lo que ofrecen varias ventajas en los procesos industriales, que requieren exposición a condiciones extremas¹³. La biodegradabilidad y la menor toxicidad los hacen adecuados para aplicaciones ambientales como la biorremediación. Debido a las ventajas que ofrecen, han estado recibiendo una mayor atención en diversas industrias como la industria alimentaria, agrícola, detergente, cosmética y petrolera¹¹. Los biosurfactantes también han ganado mucha atención en la remediación de petróleo para la eliminación de contaminantes del petróleo y contaminantes tóxicos¹⁴.

Aquí informamos la producción, caracterización y aplicación de biosurfactantes producidos por Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 y Paenibacillus sp. IITD108. Los pasos involucrados en la detección, caracterización y aplicación de una combinación de biosurfactantes para mejorar la recuperación de petróleo se describen en la Figura 1.

Figura 1: Un método para mejorar la recuperación de petróleo utilizando una combinación de biosurfactantes. Se muestra el flujo de trabajo paso a paso. El trabajo se llevó a cabo en cuatro pasos. Primero, las cepas microbianas fueron cultivadas y examinadas para la producción de biosurfactante mediante varios ensayos, que incluyeron el ensayo de colapso de gotas, el ensayo de propagación de aceite, el ensayo de índice de emulsión y la medición de la tensión superficial. Luego, los biosurfactantes se extrajeron del caldo libre de células y su naturaleza se identificó mediante cromatografía de capa delgada y se identificaron aún más utilizando LCMS, NMR y FT-IR. En el siguiente paso, los biosurfactantes extraídos se mezclaron y se determinó el potencial de la mezcla resultante para mejorar la recuperación de petróleo utilizando la técnica de columna de paquete de arena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El cribado de estas cepas microbianas para producir biosurfactantes se realizó mediante colapso por gota, propagación de aceite, ensayo de índice de emulsión y determinación de la reducción de la tensión superficial del medio libre de células debido al crecimiento de los microbios. Los biosurfactantes fueron extraídos, caracterizados e identificados químicamente por LCMS, ^{RMN 1}H y FT-IR. Finalmente, se preparó una mezcla de biosurfactantes producidos por estos microbios y se utilizó para recuperar el aceite residual en una columna de paquete de arena simulada.

El presente estudio solo ilustra los métodos involucrados en la detección, identificación, caracterización estructural y aplicación de la combinación de biosurfactantes para mejorar la recuperación de petróleo residual. No proporciona una caracterización funcional detallada de los biosurfactantes producidos por las cepas microbianas^15,16. Se realizan varios experimentos, como la determinación crítica de micelas, el análisis termogravimétrico, la humectabilidad de la superficie y la biodegradabilidad para la caracterización funcional detallada de cualquier biosurfactante. Pero dado que este documento es un documento de métodos, el enfoque está en la detección, identificación, caracterización estructural y aplicación de la combinación de biosurfactantes para mejorar la recuperación de petróleo residual; estos experimentos no se han incluido en este estudio.

1. Crecimiento de cepas microbianas

1. Pesar 2 g de caldo de Luria en polvo y añadir a 50 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml. Mezclar el contenido hasta que el polvo se disuelva completamente y hacer el volumen a 100 ml con agua destilada.
2. Del mismo modo, prepare dos matraces más de 100 ml de caldo de Luria y coloque tapones de algodón en el cuello de los matraces.
3. Cubra los tapones de algodón con papel de aluminio y autoclave los matraces durante 15 min a 121 °C y 15 psi para esterilizar el medio.
4. Después del autoclave, deje que el medio se enfríe a temperatura ambiente.
5. Para la preparación del cultivo primario de una cepa, elija una sola colonia de una placa de LA utilizando un lazo de inoculación e inocule en un tubo de ensayo que contenga 5 ml de caldo estéril de Luria.
6. Incubar el tubo de ensayo durante la noche a 30 °C a 180 rpm.
7. Inocular los matraces que contienen 100 ml de caldo de Luria en autoclave agregando 1 ml de cultivos de semillas cultivados durante la noche a los matraces dentro del gabinete de flujo de aire laminar.
8. Incubar los matraces en una incubadora rotativa a 30 °C y 180 rpm durante 7 días.
9. Después de completar el período de incubación, cosecha los matraces y transfiere el caldo de cultivo a los tubos de la centrífuga. Centrifugar el cultivo a 4.500 x g durante 20 min en una centrífuga refrigerada a 4 °C.
10. Vierta suavemente el sobrenadante libre de células en un vaso de precipitados fresco y úselo en ensayos de detección para la producción de biosurfactantes.

2. Ensayos de cribado para la producción de biosurfactantes

NOTA: En las siguientes secciones, se utilizó surfactante comercial (Saponina) como control positivo, mientras que agua y medios no ininoculados se utilizaron como control negativo.

1. Ensayo de colapso de gotas
   1. Tome un portaobjetos de vidrio limpio y cubra la superficie del portaobjetos con 200 μL de aceite.
   2. Agregue 20 μL del sobrenadante libre de células al centro del aceite y déjelo sin molestar durante 2-3 min.
      NOTA: Si la gota colapsa, puntúe el sobrenadante positivo para la presencia de biosurfactante.
2. Ensayo de propagación de aceite
   1. Tome 20 ml de agua destilada doble en una placa de Petri (75 mm de diámetro) y agregue 200 μL de petróleo crudo a la superficie del agua.
   2. Agregue 20 μL de sobrenadante libre de células al centro del aceite y déjelo sin molestar durante 1 min.
      NOTA: Si se forma una zona de desbroce debido al desplazamiento del petróleo, puntúe el sobrenadante positivo para la presencia del biosurfactante.
3. Ensayo de índice de emulsión (ensayo E₂₄ )
   1. Agregue 4 ml de gasolina (gasolina) y sobrenadante sin celdas cada uno en un tubo de ensayo de vidrio limpio.
   2. Vórtice la mezcla vigorosamente durante 3 minutos y déjela sin molestar durante las próximas 24 h.
   3. Después de 24 h, determine el índice E₂₄ como porcentaje de la altura de la capa emulsionada (cm) con respecto a la altura de toda la columna líquida (cm).
      
      NOTA: Si se observa una emulsión (aceite en agua o agua en aceite) después de 24 h, es probable que el sobrenadante contenga el biosurfactante.
4. Medición de tensión superficial
   NOTA: La tensión superficial se midió utilizando el método del anillo du Noüy¹⁷. El instrumento utilizado en este experimento (ver Tabla de Materiales) es muy sensible, así que asegúrese de una limpieza adecuada del recipiente de vidrio y la sonda.
   1. Encienda el sistema y haga doble clic en el software asociado para abrirlo.
   2. Limpie el recipiente de vidrio con el líquido cuya tensión superficial se va a determinar.
   3. Agregue el líquido (40 ml) en el recipiente y monte el recipiente en el soporte del recipiente.
   4. Desbloquee el soporte de la sonda y monte la sonda en él. Ahora bloquee el soporte de la sonda presionando el botón Bloquear en el controlador manual.
   5. Usando el controlador manual, ajuste la altura de la plataforma de tal manera que la sonda esté a unos 2-3 mm de distancia de la superficie del líquido.
   6. Ahora use el software para medir la tensión superficial. Haga clic en Archivo ubicado en el panel superior izquierdo de la pantalla. Haga clic en Abrir espacio de trabajo. Aparecerá una ventana emergente.
   7. Desplácese hacia abajo y haga doble clic en el icono K100: Tensión superficial e interfacial .
   8. Ahora, haga clic en el icono Archivo ubicado en la esquina superior izquierda de la pantalla. Haga clic en Nueva base de datos. Introduzca el nombre para guardar los datos y haga clic en Aceptar.
   9. Nuevamente, haga clic en Archivo > Nuevo anillo de medición > SFT >. Introduzca el nombre de la medición. Asegúrese de que la plantilla de configuración muestre el anillo SFT.
   10. Rellene los detalles en la ventana Configuración de medición seleccionando la sonda y el recipiente que se está utilizando para la medición. Además, complete los detalles del líquido y la fase gaseosa.
       NOTA: La fase líquida será agua, mientras que la fase gaseosa será aire. La densidad de la fase líquida es la densidad del sobrenadante libre de células. Esto se puede determinar tomando el peso de 50 ml del líquido y calculando la densidad como Kg / m³.
   11. Ahora haga clic en la pestaña Procedimiento y complete los siguientes detalles: Velocidad de detección: 6 mm / min, Sensibilidad de detección: 0.005 g, Velocidad de búsqueda: 6 mm / min, Sensibilidad de búsqueda: 0.005 g, Velocidad de medición: 3 mm / min, Sensibilidad de medición: 0.001 g, Profundidad de inmersión: 3 mm, Distancia de retorno: 10%, corrección: Harkins & Jordan, valores máximos: 5. Haga clic en Aceptar.
   12. En la ventana emergente, seleccione la base de datos para almacenar datos y haga clic en Aceptar.
       NOTA: Se puede crear una nueva base de datos aquí o agregar nuevas mediciones a los datos existentes.
   13. Ahora haga clic en el botón Reproducir ubicado en la parte superior central de la pantalla. El sistema comenzará a ejecutar el script. Después de que el sistema se estabilice, detectará la superficie. Sumerja la sonda en el líquido, mueva la sonda hacia adelante y hacia atrás y detecte la tensión en la lámina formada.
   14. Para obtener los resultados, haga clic en el icono Medición en el lado medio izquierdo de la pantalla. Haga clic en Datos y anote la tensión superficial determinada.
   15. Después de completar la medición, baje la altura de la plataforma y desbloquee y desmonte la sonda y el recipiente del instrumento.
       NOTA: Para determinar la disminución de la tensión superficial debido a la producción de biosurfactantes, se debe utilizar LB no ininoculado como control.

3. Extracción de biosurfactantes

1. Ajuste el pH del sobrenadante libre de células a 2 usando 2 N HCl. Guarde la mezcla a 4 °C durante la noche.
2. Agregue el mismo volumen de mezcla de cloroformo-metanol (2:1) al sobrenadante y mezcle vigorosamente durante 20 min.
3. Deje la mezcla sin perturbaciones para que se produzca la separación de fases.
4. Retire la fase superior que contiene agua y metanol y deje que la fase inferior que contiene el biosurfactante se evapore en una campana extractora de humos.
5. Después de la evaporación de la fase orgánica, vuelva a disolver el biosurfactante crudo de color miel en 3 ml de cloroformo y utilice esta mezcla para una mayor identificación y caracterización del biosurfactante.

4. Estudios de estabilidad de la emulsión

1. Estabilidad de la emulsión a diferentes temperaturas
   1. Tome 5 ml de sobrenadantes libres de células en diferentes tubos de ensayo.
   2. Agregue 5 ml de gasolina a cada tubo de ensayo y mezcle vigorosamente mediante vórtice durante 3 min.
   3. Incubar los tubos de ensayo durante la noche en diferentes baños de agua a diferentes temperaturas (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C y 70 °C).
   4. Después de 24 h, estime los índices de emulsión como se mencionó anteriormente.
2. Estabilidad de la emulsión a diferentes valores de pH
   1. Tome 5 ml del sobrenadante libre de células en tubos de ensayo limpios.
   2. Ajuste el pH de los sobrenadantes libres de células (2, 4, 6, 8 y 10) utilizando 1 N HCl y 1 N NaOH.
   3. Agregue una cantidad igual de gasolina a los tubos de ensayo y mezcle vigorosamente mediante vórtice durante 3 minutos.
   4. Deje los tubos de ensayo sin perturbar a temperatura ambiente durante 24 h.
   5. Estime el índice de emulsión como se mencionó anteriormente.
3. Estabilidad de la emulsión a diferentes concentraciones de sal
   1. Tome 5 ml del sobrenadante libre de células en tubos de ensayo limpios.
   2. Añadir diferentes cantidades de sal (NaCl) a los sobrenadantes (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L y 80 g/L).
   3. Disuelva las sales en los sobrenadantes libres de células mediante vórtice durante 3 min.
   4. Agregue una cantidad igual de gasolina a los tubos de ensayo y mezcle vigorosamente mediante vórtice durante 3 minutos.
   5. Deje los tubos de ensayo sin perturbar a temperatura ambiente durante 24 h.
   6. Estimar el índice de emulsión después de 24 h.

5. Determinación de la naturaleza del biosurfactante

1. TLC del biosurfactante extraído
   1. Spot 20 μL de los biosurfactantes en placas TLC. Punto 2 μL a la vez.
   2. Detecte los biosurfactantes en tres placas TLC diferentes.
   3. Preparar una mezcla de 100 ml del eluyente que contiene cloroformo:metanol (2:1) y añadir el eluyente a la cámara TLC. Cierre la tapa de la cámara y deje que se sature durante 20 min.
   4. Después de secar las placas, coloque las placas TLC dentro de la cámara saturada con una mezcla de metanol cloroformo y ejecute la TLC.
   5. Después de que el eluyente haya llegado a la parte superior de la placa TLC (a 1 cm de distancia de la parte superior), saque las placas y déjelas secar al aire.
2. Tinción para la detección de lípidos
   1. Tome una cámara TLC limpia y agregue algunos (5-10) gránulos de yodo en la cámara fresca y sature la cámara durante 5 a 10 minutos.
   2. Coloque la placa TLC dentro de la cámara y observe el desarrollo de las manchas amarillas. Si aparecen las manchas, puntúe el biosurfactante positivo para la presencia del componente lipídico.
3. Tinción para la detección de péptidos o aminoácidos
   1. Prepare una solución de ninhidrina disolviendo 0,4 g de ninhidrina en 20 ml de butanol. Agregue 0.6 ml de ácido acético glacial 100% a la mezcla.
   2. Rocíe la placa TLC con solución de ninhidrina y déjela secar al aire durante 2 min. Calentar la placa a 110 °C y observar el desarrollo del color.
      NOTA: Si aparecen las manchas azules, puntúe el biosurfactante positivo para la presencia de cualquier cadena peptídica o aminoácido.
4. Tinción para la detección de carbohidratos
   1. Preparar una solución de p-anisaldehído añadiendo 2 mL de p-anisaldehído a 48 mL de ácido acético glacial que contenga 1 mL de H₂SO₄. Añadir 0,6 ml de ácido acético a la mezcla.
   2. Rocíe la mezcla uniformemente en una placa TLC y déjela secar al aire durante 2 min.
   3. Incubar la placa a 110 °C y vigilar el desarrollo de manchas.
      NOTA: Si aparecen las manchas verdes o marrones, califique el biosurfactante como positivo para la presencia de carbohidratos.

6. Identificación química del biosurfactante

1. LCMS del biosurfactante
   1. Disolver 25 mg del biosurfactante extraído en 1 ml de cloroformo.
   2. Realice LCMS (en una configuración de pulverización de bloqueo con una frecuencia de escaneo de referencia de 10 s) utilizando una columna C18.
   3. Utilice cloroformo:metanol (1:1) como fase móvil e inyecte 2 μL de la muestra en la columna a un caudal de 0,1 mL/min.
   4. Ajuste los parámetros experimentales a: polaridad: ES positivo, voltaje capilar: 3 kV, temperatura de la fuente: 80 °C, temperatura de dessolvación: 300 °C, caudal de gas de dessolvación: 7.000 L/h y caudal de gas trampa: 0,40 mL/min.
   5. Escanee los rangos de 100 a 1.200 Da durante un tiempo de detección de 20 minutos y estudie los iones en modo ES positivo.
   6. Analice los valores m/z utilizando cualquier software de espectrometría de masas cuantitativamente.
   7. Para el análisis, inicie sesión en el software.
   8. Haga clic en Búsqueda por lotes e introduzca la lista de las masas obtenidas. Estudie los resultados en un modo de carga positiva y use M + H y M + Na como aductos. Mantenga la precisión a 10 PPM y marque en la estructura de la pantalla.
   9. Haga clic en Buscar y, de la lista de compuestos, seleccione el que tenga el nivel de PPM más bajo.
2. ¹ H RMN del biosurfactante
   NOTA: ¹H NMR del biosurfactante se realizó utilizando un espectrómetro de RMN de 400 MHz (ver Tabla de Materiales).
   1. Disolver 5 mg del biosurfactante en 1 ml de cloroformo deuterado (CdCl₃).
   2. Transfiera la mezcla a un tubo de RMN. Tapa el tubo correctamente e inserta el tubo en la llave inglesa. Ajuste la altura del tubo con el tubo ajustador.
   3. Coloque el tubo junto con la llave inglesa en la máquina de RMN y siga los pasos que se mencionan a continuación para obtener un espectro de RMN.
   4. Para seleccionar el tipo de tubo de muestra: sx N, donde N es la posición donde se colocó el tubo (por ejemplo, sx 13, si el tubo se colocó en la^13ª posición) en el software asociado.
   5. Escriba edc y presione Entrar para crear una nueva carpeta donde se puedan almacenar los datos.
   6. Aparecerá una ventana emergente. Seleccione el disolvente haciendo clic en CdCl ₃ en la lista e introduzca el nombre de la muestra.
   7. Para iniciar el protocolo, escriba "getprosol"; para bloquear el disolvente, escriba "lock cdcl3".
   8. Escriba "topshim" para ajustar la muestra y, finalmente, escriba "rga;zgefp" para adquirir los datos. Esto iniciará el protocolo.
   9. Una vez obtenidos los espectros, escriba "apk;abs n" y pulse Intro para la corrección de fase y línea de base.
   10. Para seleccionar los picos primarios, escriba "pp" y presione Entrar. Para seleccionar solo picos intensos, ingrese "mi" y escriba la intensidad por encima de la cual se deben seleccionar los picos. El valor predeterminado será 0,2.
   11. Para integrar los picos, haga clic en Integrar y coloque el cursor en el lado izquierdo del pico a integrar y mientras mantiene presionado el cursor haga clic y arrastre el cursor alrededor del pico.
   12. Guarde los datos haciendo clic en Archivo en la esquina superior izquierda y luego haga clic en Guardar.
   13. La muestra se puede expulsar de la máquina escribiendo "sx ej".
   14. Analizar los picos y determinar el entorno de los átomos de H.
3. Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier del biosurfactante
   NOTA: FT-IR del biosurfactante extraído se realizó utilizando un espectrofotómetro disponible comercialmente en modo ATR (ver Tabla de Materiales).
   1. Encienda el espectrofotómetro y compruebe la purga, el desecante y el detector.
   2. Para recolectar un espectro, primero recolecte el espectro de fondo sin una muestra en su lugar.
   3. Tome el biosurfactante extraído y séquelo por completo. Coloque el biosurfactante seco directamente sobre el cristal de diamante, aplique presión y presione el punto de contacto ATR.
   4. En el software, seleccione el número de escaneos (ingrese 30) y escanee el espectro de 400 ^cm-1 a 4,000 ^cm-1.
   5. Haga clic en Aceptar para agregar el espectro de muestra a la ventana espectral.
   6. Haga clic en Archivos > Guardar > Guardar como e ingrese el nombre del archivo seguido de la extensión .spa y haga clic en Aceptar.

7. Aplicación de biosurfactante (recuperación mejorada de petróleo)

NOTA: En este experimento, se utilizó agua destilada doble como control negativo y se utilizó 10% SDS, 10% Tween 80 y 10% saponina comercial como controles positivos.

1. Tome el vidrio y selle la salida inferior con lana de vidrio y cuentas de vidrio.
2. Empaque la columna con tierra arenosa de tal manera que se pueda agregar algo de líquido en la parte superior del suelo y el flujo a través se pueda recolectar en la parte inferior. Monte la columna en el soporte y agregue algunas cuentas de vidrio en la parte superior del suelo.
3. Inunde la columna con 50 ml de solución de salmuera y recoja el flujo para determinar el volumen de poros.
   volumen de poro = volumen de salmuera añadido en la parte superior - volumen de flujo a través recogido.
4. Retire la salmuera de la columna forzando el paso del petróleo crudo a través de ella después de agregarla desde la parte superior de la columna. Recoja el volumen de la salmuera y el aceite que sale de la columna para determinar el volumen inicial de saturación de aceite. El volumen de la salmuera liberada de la columna será el volumen de saturación de aceite inicial o el aceite original en su lugar.
5. Deje la columna sin molestar durante 24 h.
6. Después de 24 h, inunde la columna con 10 volúmenes porosos de salmuera y recoja el aceite que sale de la columna para estimar la recuperación secundaria de petróleo. El aceite que queda en la columna después de la recuperación secundaria de petróleo corresponde al aceite residual.
7. Prepare una mezcla de biosurfactantes agregando volúmenes iguales del biosurfactante extraído (extraído después del paso 3.5) al vaso de precipitados de vidrio. Agregue los biosurfactantes a la parte superior de la columna e incube la columna durante 24 h.
8. Después de 24 h, mida la cantidad de aceite y agua para determinar la recuperación de aceite adicional o mejorada. El volumen del aceite liberado de la columna corresponderá al aceite residual recuperado.
9. Estimar la recuperación mejorada de petróleo con la siguiente ecuación:
   

Tres cepas bacterianas (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 y Paenibacillus sp. IITD108) fueron examinadas para la producción de biosurfactantes mediante varios ensayos, que incluyeron ensayo de colapso de gotas, ensayo de desplazamiento de aceite, ensayo de índice de emulsión y reducción de tensión superficial. Los sobrenadantes libres de células de las tres cepas bacterianas y una solución de surfactante químico resultaron en un colapso de gota y, por lo tanto, se calificaron como positivos para la presencia de los biosurfactantes (Figura 4a). Por otro lado, la gota de agua no colapsó y, por lo tanto, se obtuvo una puntuación negativa para la presencia del biosurfactante. El surfactante comercial y los sobrenadantes libres de células de los tres cultivos bacterianos también tuvieron éxito en el desplazamiento de la capa de aceite en el ensayo de propagación de aceite y, por lo tanto, obtuvieron una puntuación positiva para la presencia de biosurfactante (Figura 4b). El agua, por otro lado, no pudo desplazar ningún aceite y, por lo tanto, obtuvo una puntuación negativa. En los ensayos de índice de emulsión, se observó una emulsión estable en tubos de ensayo que contenían surfactante comercial y los sobrenadantes de las tres cepas microbianas. Sin embargo, no se observó emulsión en el tubo de ensayo que contenía medio de cultivo no ininoculado (Figura 4c). Esto nuevamente sugirió que Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 y Paenibacillus sp. IITD108 producen biosurfactantes. La confirmación de la producción de biosurfactante se obtuvo midiendo la tensión superficial del caldo libre de células y comparándola con el control no ininoculado. Se encontró que los biosurfactantes de Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 y Paenibacillus sp. IITD108 reducen la tensión superficial del medio de 58.89 mN/m a 45.41 mN/m, 45.82 mN/m y 28.43 mN/m, respectivamente (Figura 5).

Las mediciones de IFT se realizaron utilizando el método de extracción de anillo. Los biosurfactantes de las tres cepas fueron capaces de reducir significativamente las tensiones interfaciales entre varias fases acuosas y orgánicas (Tabla S1). La tensión superficial y las mediciones de tensión interfacial confirman que las tres cepas producen biosurfactantes.

La extracción con disolvente de biosurfactantes de los cultivos libres de células de Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 y Paenibacillus sp. IITD108 dio lugar a concentraciones de biosurfactantes de 820 mg/L, 560 mg/L y 480 mg/L, respectivamente.

Como se observa en la Figura 4C, la emulsión formada por el biosurfactante fue agua en microemulsión de aceite. Los ensayos de estabilidad de la emulsión mostraron que los biosurfactantes exhibieron una buena estabilidad bajo diversas condiciones ambientales (Figura 6). Las emulsiones producidas fueron muy estables a través de diversas temperaturas (Figura 6a), valores de pH (Figura 6b) y concentraciones de sal (Figura 6c) probadas.

Se realizó cromatografía de capa delgada para determinar la naturaleza de los biosurfactantes. La tinción de las placas con vapor de yodo dio lugar al desarrollo de manchas amarillas en todos los biosurfactantes y el control (Biosurfactante de Bacillus sp. IITD 106 (Figura 7a). Esto indicó que los biosurfactantes contenían una fracción lipídica. No se obtuvieron manchas de color azul en ninguna de las placas TLC al teñirse con ninhidrina (Figura 7b). Esto demostró que los biosurfactantes no contenían ninguna fracción peptídica. Se observaron manchas azules y verdes en todas las placas de TLC, cuando se tiñen con tinción de anisaldehído (Figura 7c). Esto demostró que los biosurfactantes contenían una fracción de carbohidratos. A partir de los resultados de TLC, se concluyó que todos los biosurfactantes eran glicolípidos.

La identificación química de los biosurfactantes utilizando LCMS reveló que el Rhodococcus sp. IITD102 y el Lysinibacillus sp. IITD104 producen el mismo tipo de biosurfactante, que fue identificado como ácido hidroxidecanoico di-rhamnopiranosico con una masa de 480.25 Da. La estructura del biosurfactante fue apoyada por datos de ^RMNy FT-IR de 1 H (Figura 8).

En el espectro ^{de RMN 1}H, los cambios químicos obtenidos en 7.2 representaron los protones de los grupos carboxílicos. Los cambios químicos correspondientes a protones del grupo metilo se obtuvieron en el rango de 1-2 ppm. Los desplazamientos correspondientes a protones unidos a grupos alquilo se obtuvieron a 2,3 ppm. Los espectros FT-IR de los biosurfactantes extraídos de Rhodococcus sp. IITD102 y Lysinibacillus sp. IITD104 mostraron la presencia de picos fuertes en el número de onda 3.290 ^cm-1, lo que confirma la presencia del grupo funcional OH. Un pequeño pico en el número de onda 2.951 ^cm-1 corresponde al estiramiento CH. Un pico fuerte a 1.620 ^cm-1 representó la presencia del grupo carboxílico en los biosurfactantes. Otros picos que se obtuvieron en 1.530, 1.410, 1.200 y 1.060 confirmaron la presencia de grupos funcionales alquilo, CH₃, C-O-C y C-CH₃ , respectivamente. Tanto los datos de RMN como los de FT-IR respaldaron la estructura del biosurfactante determinada a partir de estudios de LCMS. LCMS de biosurfactante crudo de Paenibacillus sp. IITD108 (Figura 9) mostró que produce un ramnolípido que contiene tres cadenas lipídicas que forman el núcleo hidrofóbico a granel del biosurfactante. El biosurfactante fue identificado como ácido 2decanoil)-αL rhamnopiranosil-3-hidroxidecanoico con una masa de 802 Da. Los resultados de LCMS fueron respaldados por datos de ^RMNy FT-IR de 1 H.

La configuración para la recuperación mejorada de petróleo se muestra en la Figura 2.

Figura 2: Configuración experimental para la recuperación mejorada de petróleo utilizando la técnica de columna de paquete de arena. La columna llena de tierra estaba montada en el soporte. La salida inferior estaba sellada con lana de vidrio y cuentas de vidrio. Después de la recuperación secundaria, el aceite residual dentro de la columna se sometió a una recuperación mejorada de aceite mediante la adición de la mezcla de biosurfactantes a la misma. El tubo colocado en la parte inferior de la columna se utilizó para recoger la fracción eluida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el experimento simulado de recuperación mejorada de aceite, de los 50 ml de salmuera agregados a la parte superior de la columna, se recolectaron 12 ml en el flujo y, por lo tanto, el volumen de poros se estimó en 38 ml. Cuando el aceite fue forzado a través de la columna, 33 ml de salmuera se liberaron de la columna. Esto representó el volumen inicial de saturación de aceite. La recuperación secundaria utilizando 10 volúmenes de salmuera de poros dio como resultado la elución de 10 ml de aceite. El aceite residual que quedaba en la columna era de 23 ml. El agua que contenía la mezcla de biosurfactantes fue capaz de recuperar 13 ml de aceite de la columna (Figura 3).

Figura 3: Recuperación de petróleo mejorada simulada utilizando una columna de paquete de arena. El volumen inicial de saturación de aceite tanto de la columna de control como de la de prueba fue de alrededor de 33 ml. Durante la recuperación secundaria de petróleo, se recuperaron alrededor de 10 ml de aceite tanto de las columnas de control como de las de prueba. Las diferencias en los perfiles de recuperación de la prueba y las columnas de control se observaron solo durante la recuperación del aceite residual dejado en la columna. La mezcla de biosurfactantes dio como resultado una recuperación adicional de 13 ml del aceite residual que quedaba de la columna de prueba, mientras que en la columna de control solo se recuperaron 1,03 ml de aceite en este paso. Esto demuestra que la mezcla de biosurfactantes tiene un gran potencial para mejorar la recuperación de aceite residual de los yacimientos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esto representó una mejor recuperación de petróleo. Por lo tanto, el agua que contenía la mezcla de biosurfactantes fue capaz de recuperar el 56,52% del aceite residual de la columna (Tabla 1). Por otro lado, las soluciones de 10% SDS, 10% Tween 80 y 10% saponina pudieron recuperar el 85%, 68% y 73% de aceite residual de la columna.

donde PV = volumen de poro determinado después de la saturación inicial de la columna con salmuera, OOIP = aceite original en su lugar, IOSV = volumen de saturación inicial de aceite, POS = Porcentaje de saturación de aceite, S_v = volumen de salmuera agregado para la recuperación secundaria, SOR = aceite secundario recuperado después de la inundación de salmuera, ROC = aceite residual en la columna después de la recuperación secundaria, ROS = saturación de aceite residual, ROR = Aceite residual recuperado después de una inundación de biosurfactante, AOR = aceite adicional recuperado

Tabla 1: Recuperación mejorada de petróleo simulada en una columna de paquete de arena.

Figura 4: Ensayos de detección para la producción de biosurfactantes (a) Ensayo de colapso de gotas: La gota de agua no colapsó después de agregarse a la superficie recubierta de aceite, mientras que el surfactante químico y los sobrenadantes libres de células de las tres cepas bacterianas resultaron en el colapso de la gota. b) Ensayo de desplazamiento de aceite: La gota de agua no dio lugar al desplazamiento del aceite, mientras que el surfactante químico y los sobrenadantes libres de células de las tres cepas bacterianas desplazaron las capas de aceite (c) Ensayo de índice de emulsión: Los sobrenadantes libres de células y la solución de surfactante comercial dieron lugar a la formación de un índice de emulsión estable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Reducción de la tensión superficial debido a la producción de biosurfactantes. La determinación de la reducción de la tensión superficial del medio debido al crecimiento microbiano confirmó la producción de biosurfactante por parte de los miembros microbianos. Debido al crecimiento de Rhodococcus sp. IITD 102 y Lysinibacillus sp. IITD 104, la tensión superficial del medio se redujo de 59 mN/m a 45 mN/m. Debido al crecimiento de Paenibacillus sp. IITD 108, la tensión superficial del medio se redujo de 59 mN/m a 28 mN/m. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6: Estabilidad de la emulsión a varias (a) temperaturas, (b) valores de pH y (c) concentraciones de sal. Todas las emulsiones generadas utilizando los sobrenadantes de las tres cepas microbianas y la mezcla de surfactante comercial muestran una gran estabilidad bajo diferentes condiciones ambientales. Dentro de los rangos de temperatura, pH y concentración de sal probados, los índices de emulsión determinados fueron similares y no se observó una reducción importante de la EI a valores más altos de los diferentes factores, lo que implica que el biosurfactante puede usarse en condiciones ambientales extremas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Caracterización TLC de biosurfactantes (a) Placas teñidas con vapor de yodo: Varias manchas desarrolladas en la placa TLC muestran que los biosurfactantes extraídos son una mezcla de varios compuestos que contienen un grupo lipídico. Las manchas marcadas con flecha azul representan los biosurfactantes, que se han teñido positivamente para la presencia de fracción lipídica. Las otras manchas representan el resto de los compuestos presentes en la mezcla del biosurfactante crudo. (b) Placas teñidas con ninhidrina: No aparecieron manchas púrpuras cuando las placas se tiñeron con ninhidrina. Esto representó la ausencia de aminoácidos en la mezcla de biosurfactantes y (c) Placas teñidas con anisaldehído: Aparecieron manchas de color verde claro y amarillo en la placa TLC y estas representan los compuestos que contienen azúcares. Las manchas marcadas con flechas negras representan los biosurfactantes que se han teñido de positivo para la presencia de la fracción de carbohidratos. Las manchas que se tiñen tanto con yodo como con anisaldehído representan compuestos que contienen fracciones de lípidos y carbohidratos y posiblemente podrían ser un biosurfactante glicolípido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Caracterización química del biosurfactante extraído de Rhodococcus sp. IITD 102 y Lysinibacillus sp. IITD 104. a) representa los espectros FT-IR de los biosurfactantes extraídos de Rhodococcus sp. IITD 102 y Lysinibacillus sp. IITD 104, b) representa los espectros de RMN H¹ de los biosurfactantes extraídos de Rhodococcus sp. IITD 102 y Lysinibacillus sp. IITD 104, y c) muestra la estructura de los biosurfactantes brutos extraídos de Rhodococcus sp. IITD 102 y Lysinibacillus sp. IITD 104. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Caracterización química del biosurfactante extraído de Paenibacillus sp. IITD 108. a) representa los espectros FT-IR de los biosurfactantes extraídos de Paenibacillus sp. IITD 108, b) representa los espectros de RMN ^{de 1}H de los biosurfactantes extraídos de Paenibacillus sp. IITD 108, y c) muestra la estructura de los biosurfactantes crudos extraídos de Paenibacillus sp. IITD 108. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura S1: Estructura de diferentes tipos de biosurfactantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla S1: Efecto de los biosurfactantes sobre la tensión interfacial (IFT) entre el agua y los hidrocarburos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los biosurfactantes son uno de los grupos más versátiles de componentes biológicamente activos que se están convirtiendo en alternativas atractivas a los tensioactivos químicos. Tienen una amplia gama de aplicaciones en numerosas industrias, como detergentes, pinturas, cosméticos, alimentos, productos farmacéuticos, agricultura, petróleo y tratamiento de agua debido a su mejor humectabilidad, menor CMC, estructura diversificada y respeto al medio ambiente¹⁸. Esto ha llevado a un mayor interés en descubrir más cepas microbianas capaces de producir biosurfactantes. Aquí, ilustramos los métodos para la detección, identificación y aplicación de una mezcla de biosurfactantes producidos por Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 y Paenibacillus sp. IITD 108, para mejorar la recuperación de petróleo. La producción de biosurfactantes se examinó mediante el colapso de la gota, la propagación del aceite, el ensayo del índice de emulsión y se confirmó midiendo la reducción de la tensión superficial del medio debido al crecimiento microbiano. Varios informes sobre la producción de biosurfactantes glicolípidos (ramnolípidos y trehalolipids) a partir de Rhodococcus están disponibles en la literatura 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. han reportado la producción y optimización de un biosurfactante lipopéptido de Paenibacillus sp. alvei ARN63²⁵. Bezza et al. han reportado biodegradación de pireno por un biosurfactante lipopéptido producido por Paenibacillus dendritiformis CN5²⁶. La producción de biosurfactantes (lipopéptidos y glicolípidos) también ha sido reportada por otras cepas de Paenibacillus 27,28,29,30,31. Se ha informado que varias especies de Lysinibacillus producen biosurfactantes 32,33,34. Se ha informado que Lysinibacillus sphaericus produce ramnolípido capaz de solubilizar pesticidas hidrófobos³⁵.

Una de las ventajas que ofrecen los biosurfactantes sobre sus contrapartes químicas es su estabilidad en condiciones ambientales extremas. Los biosurfactantes producidos por Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 y Paenibacillus sp. IITD 108 fueron ensayados por su estabilidad bajo diferentes rangos de temperatura, pH y concentraciones de sal y se encontró que eran estables bajo valores extremos de estos parámetros. Anteriormente, Habib et al. reportaron un lipopéptido producido por Rhodococcus sp. degradador de hidrocarburos que mostró estabilidad en diferentes rangos de temperaturas, valores de pH y concentraciones de sal³⁶. Se ha informado que el aumento de la concentración de sales inorgánicas aumenta la estabilidad de la emulsión³⁷. La tendencia de los coloides a aglomerarse o separarse es una función de las fuerzas atractivas (fuerzas de Van der Walls) y repulsivas (fuerzas electrostáticas) que están involucradas durante la interacción de partículas³⁸. Los cristales de sal al disolverse en agua establecen sus propias cargas eléctricas y los iones liberados se adsorben sobre las gotas de emulsión. Al aumentar la concentración de sal, la expansión y la repulsión de la segunda capa se reducen. Además, cuanto mayor sea la densidad de carga de un ion, menor será la longitud de la capa eléctrica. Por lo tanto, los cationes divalentes como Na²⁺ dan como resultado la formación de emulsiones más estables en comparación con los cationes monovalentes³⁹.

Otra ventaja que tienen los biosurfactantes sobre los tensioactivos químicos es que son biodegradables⁴⁰. Zeng et al. han comparado las capacidades de degradación del surfactante sintético Triton X 100, los sulfonatos lineales de alquilbenceno (LAS) y el ramnolípido y encontraron que el biosurfactante ramnolípido estaba completamente degradado, mientras que LAS y Tritón X 100 solo se degradaron parcialmente⁴¹. Liu et al. también informan que, a diferencia de los tensioactivos sintéticos CTAB, Triton X 100 y SDS, el ramnolípido no presenta toxicidad y podría degradarse fácilmente por B. subtilis y otros microorganismos del compost⁴².

Se encontró que los biosurfactantes producidos por las tres cepas microbianas eran glicolípidos. Rhodococcus ha sido reportado previamente para producir glicolípidos por varios grupos de investigación 20,21,23. Informes similares sobre la producción de biosurfactantes glicolípidos por Lysinibacillus y Paenibacillus también están disponibles en la literatura ^{31,32,35,43,44}. La identificación química de los biosurfactantes reveló que eran ramnolípidos. Los ramnolípidos son la clase de biosurfactantes glicolípidos que contienen una o dos unidades de ramnosa conectadas a una cadena lipídica⁴⁵. Son el tipo de biosurfactantes más estudiado. Se ha informado que varias cepas microbianas producen ramnolípidos 7,46,47,48,49. Se ha informado que los ramnolípidos exhiben un alto potencial para mejorar la recuperación de petróleo residual 50,51,52,53. En nuestro estudio, encontramos que la mezcla de biosurfactantes producidos por Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 y Paenibacillus sp. IITD 108 recuperó con éxito alrededor del 56.52% del aceite residual en una prueba de columna de paquete de arena simulada. Esto demostró que la mezcla de biosurfactantes se puede utilizar para la recuperación de aceite residual de los depósitos subterráneos. En una prueba similar de paquete de arena, Sun et al. han informado que el biosurfactante tuvo éxito en la recuperación del 50% del aceite residual⁵⁴. También se ha informado que los biosurfactantes que contienen caldo libre de células de Bacillus subtilis son efectivos para recuperar el 33% del aceite residual⁵⁵. La recuperación de petróleo residual del 27% y 26%-36% también ha sido reportada por Darvishi et al. y Wahabi et ^al.56,57.

La evaluación económica de los biosurfactantes para la recuperación de petróleo residual de los yacimientos muestra que la utilización de biosurfactantes en EOR es económicamente una opción viable. Moutinho et al. informaron que el costo típico de un biosurfactante comercial (ramnolípidos) es de alrededor de 59.6 USD por kg⁵⁸. En otro estudio, también se ha informado que la concentración de biosurfactante de 28 mg / L de biosurfactante mejoró la recuperación de aceite residual y condujo a la producción de 52,5 m³ de aceite adicional⁵⁹. Los estudios mostraron que la concentración de biosurfactante de 10 mg / L fue suficiente para movilizar la recuperación de petróleo. Según los datos reportados, la cantidad de biosurfactante requerida para producir 52,5 m³ de aceite adicional es de alrededor de 0,525 kg. El costo total de producción de 52,5 m³ de petróleo es de aproximadamente US$ 21463, de los cuales sólo US$30 es el costo de producción del biosurfactante. Los datos muestran que el costo porcentual del biosurfactante en la producción de petróleo por barril es de solo 0.0000139%.

Nuestros resultados sugieren que la combinación de los biosurfactantes se puede utilizar de manera eficiente para recuperar el aceite residual de los reservorios. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la mejora de la recuperación del aceite residual del yacimiento utilizando una mezcla de biosurfactantes producidos por diferentes cepas microbianas. Aunque nuestro estudio describe claramente los métodos involucrados en el cribado, la caracterización estructural y la aplicación de biosurfactantes en la recuperación mejorada de petróleo, el estudio no proporciona una caracterización funcional detallada de los biosurfactantes, que afectan su eficiencia en diversas aplicaciones. La concentración crítica de micelas, que es la medida de la eficiencia de cualquier surfactante en la formación de las micelas y especifica la concentración limitante del surfactante para su uso significativo, no se ha determinado en el presente estudio⁶⁰. Del mismo modo, tampoco se ha descrito la estabilidad térmica del biosurfactante, que determina su aplicabilidad en condiciones de reservorio para EOR⁶¹. Los biosurfactantes en algunas aplicaciones también se utilizan como agentes antibiofilm. Su humectabilidad superficial juega un papel importante en la determinación de su naturaleza antibiopelícula. Tampoco se han realizado estudios de humectabilidad superficial en el presente trabajo⁶². Otras características funcionales importantes en diversas aplicaciones de biosurfactantes, que incluyen su biodegradabilidad y la naturaleza antimicrobiana tampoco se han determinado en este estudio^63,64. Así, nos hemos centrado en la caracterización estructural de los biosurfactantes. Dependiendo de la aplicación objetivo, se puede realizar una caracterización funcional como la estabilidad, la biodegradabilidad y la actividad antimicrobiana.

En el ensayo de colapso de gotas y el ensayo de propagación de aceite, para aumentar la visibilidad, es mejor usar un aceite que tenga algo de color. En el ensayo de propagación de aceite, la emulsión debe observarse después de 24 h. Las espumas ligeras, si se forman, se desintegran en 24 h. Los tensiómetros son instrumentos muy sensibles, por lo tanto, durante las mediciones de tensión superficial, el recipiente y la sonda deben limpiarse adecuadamente antes de cada medición para evitar cualquier error debido a la transferencia de las últimas mediciones. La extracción de biosurfactante implica la adición de una mezcla de metanol de cloroformo al sobrenadante libre de células. El paso debe realizarse en una campana extractora de humos, o el matraz debe cubrirse con papel de aluminio inmediatamente después de la transferencia de la mezcla de extracción. Durante la recuperación secundaria en un experimento EOR, la solución de salmuera debe agregarse en exceso hasta que no salga más aceite de la columna.

El método discute el alcance de la mezcla de biosurfactantes en la recuperación de aceite residual de las columnas. El proceso depende de muchos factores. La etapa de crecimiento de los microbios en la que se cosechan los cultivos iniciales. Se ha informado de que algunos biosurfactantes se producen en la fase logarítmica, mientras que otros se han producido en la fase estacionaria. Los cultivos deben cosecharse en consecuencia en la etapa particular en que la producción de biosurfactantes ha alcanzado su máximo. Los ensayos de detección de biosurfactantes son menos sensibles, por lo tanto, todos los ensayos deben realizarse antes de llegar a una conclusión sobre la capacidad de producción de biosurfactantes de una cepa en particular. La purificación del biosurfactante debe realizarse antes de la caracterización química del biosurfactante si la concentración de biosurfactante es baja en el biosurfactante crudo. Los experimentos mejorados de recuperación de petróleo dependen en gran medida del tipo de suelo utilizado para empacar la columna. El suelo debe estar completamente seco y debe ser tamizado para eliminar gránulos más grandes y otros contaminantes sólidos. Se debe preferir una mezcla de suelo arenoso y suelo seco de jardín (en igual proporción) para empacar la columna. La salida de la columna debe sellarse correctamente con lana de vidrio y cuentas de vidrio para evitar fugas de tierra de la columna durante el transcurso del experimento.

El método descrito es útil para determinar la importancia de los biosurfactantes producidos y sus mezclas en la recuperación de aceite adicional en un experimento simulado de columna de paquete de arena. Los diferentes biosurfactantes tienen diferentes especificidades porque contienen diferentes grupos funcionales⁶⁵. Una combinación de biosurfactantes permitirá la solubilización de diversos hidrocarburos y, por lo tanto, aumentará la recuperación de petróleo residual de los yacimientos. El método descrito ayudará a determinar el potencial de las mezclas de biosurfactantes en aplicaciones de campo, como la recuperación mejorada de petróleo de pozos de petróleo.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Los autores desean dar las gracias al Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India por su apoyo financiero.