Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

Bu makale, kriyo-EM deneyleri için donma işlemine dalmadan önce, 70 ° C'ye kadar yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) deneyleri için numune ızgaraları genellikle biyolojik numunelerin depolanması için en uygun sıcaklıkta, çoğunlukla 4 ° C'de ve bazen oda sıcaklığında hazırlanır. Son zamanlarda, düşük sıcaklıkta çözülen protein yapısının, özellikle termofilik arkelerden gelen proteinler için işlevsel olarak alakalı olmayabileceğini keşfettik. Kriyo-EM analizi için daha yüksek sıcaklıklarda (70 ° C'ye kadar) protein örnekleri hazırlamak için bir prosedür geliştirilmiştir. Daha yüksek sıcaklıklarda hazırlanan numunelerden elde edilen yapıların işlevsel olarak alakalı ve sıcaklığa bağlı olduğunu gösterdik. Burada, örnek olarak 55 °C kullanarak numune ızgaralarını yüksek sıcaklıkta hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Deney, ek bir santrifüj tüpü kullanılarak modifiye edilmiş bir vitrifikasyon aparatı kullandı ve numuneler 55 ° C'de inkübe edildi. Ayrıntılı prosedürler, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ızgarada ince bir buz tabakası elde etmek için ince ayarlandı. Başarılı ve başarısız deneylere örnekler verilmiştir.

Protein komplekslerinin yapılarını çözmek için kriyo-EM teknolojisi, özellikle yüksek çözünürlüklü yapıların elde edilmesi yönünde gelişmeye devam etmiştir ^1,2. Bu arada, vitrifikasyon prosesinden önce pH veya ligandlar gibi numune koşullarının değiştirilmesiyle uygulama alanı da genişletilmiştir³, bu da numune ızgaralarının hazırlanmasını ve ardından dalma dondurma ^4,5'i içerir. Bir diğer önemli koşul sıcaklıktır. X-ışını kristalografisi gibi kriyo-EM deneyleri düşük sıcaklıklarda yapılmasına rağmen, kriyo-EM ile çözülen yapı, vitrifikasyondan önceki çözelti durumundaki yapıyı yansıtır. Yakın zamana kadar, tek parçacık analizi (SPA) kriyo-EM çalışmalarının çoğu, vitrifikasyon^6'dan önce buz üzerinde (yani 4 ° C'de) tutulan örnekleri kullanır, ancak bir dizi çalışma oda sıcaklığında 7,8,9,10 veya 42 ° C ¹¹ kadar yüksek numuneler kullanır. Yakın tarihli bir raporda, termofilik arkeon Sulfolobus solfataricus'tan (Sso) ketol-asit redüktoizomeraz (KARI) enziminin sıcaklığa bağlı çalışmalarını 4 ° C ila 70 ° C¹² arasında altı farklı sıcaklıkta gerçekleştirdik. Çalışmalarımız, fonksiyonel olarak ilgili sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamanın önemli olduğunu ve kriyo-EM'nin aynı protein kompleksinin yapısını çoklu sıcaklıklarda çözmek için pratik olarak mümkün olan tek yapısal yöntem olduğunu göstermektedir.

Yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon için en büyük zorluk, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ince buz elde etmektir. Burada, Sso-KARI ¹² ile ilgili önceki çalışmamızda yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için kullanılan ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Okuyucuların veya izleyicilerin kriyo-EM deneyleri için genel numune hazırlama ve veri işleme prosedürlerinde zaten deneyimli olduklarını varsayıyoruz ve yüksek sıcaklıkla ilgili yönleri vurguluyoruz.

NOT: Bu protokol, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) örneklerini belirli sıcaklıklarda, özellikle 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda hazırlamak için modifiye edilmiş bir ticari vitrifikasyon aparatı kullanmayı amaçlamaktadır. Genel deney düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol örnek olarak 55 ° C kullanır. Diğer sıcaklıklardaki özel koşullar için lütfen referans^12'deki Ek Tablo 2'ye bakın.

1. Vitrifikasyon aparatının hazırlanması

1. Kapalı ucunda 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1 cm'lik bir delik açın.
2. Tüpü, Şekil 2'de gösterildiği gibi, ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin.
   NOT: Amaç, tüm odaya ulaşmadan önce su buharını borudan ısı eşanjörüne yönlendirerek su yoğuşmasını en aza indirmektir.
3. Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın (örneğin, Şekil 3'te gösterildiği gibi 55 ° C) ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 ° C'ye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin.

2. Numunenin ve aletlerin ısıtılması

1. Su banyosunu bir ocak üzerine yerleştirin ve ocak plakasını istenen sıcaklığa ayarlayın (burada 55 ° C). Suyun 55 ° C'ye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin.
2. Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce ocak plakasının kenarındaki pipet ucunu 2 dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın.
   NOT: Vitrifikasyon aparatı haznesi için en yüksek sıcaklık ayarı 60 °C'dir. Cyro-EM deneyi için daha yüksek sıcaklık ızgaraları hazırlamak üzere (örneğin, 70 ° C), numune 80 ° C'de su banyosunda inkübe edilir ve numune sıcaklığı ile vitrifikasyon aparatı sıcaklığı arasındaki ortalamanın, numunenin ızgaradaki gerçek sıcaklığı olduğu tahmin edilir (bu durumda 70 ° C). Bu tahminle ilgili daha fazla ayrıntı ve sınırlama için Tartışma bölümüne bakın.

3. Lekeleme deneyine hazırlık

1. Işıtma, 30 s için 25 mA'da delikli karbon destekli bir ızgarayı boşaltır veya kullanılan cihaza bağlı olarak değerlere alternatif olarak boşaltır.
2. Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile 2 dakika veya daha uzun süre inkübe edin.
3. Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile doldurun. Etan'ın taşmasına izin vermeyin.
   NOT: Bu adım yaklaşık 10 dakika sürer ve donmayı önlemek için lekeleme deneyi ile hemen takip edilmelidir.
4. Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç 5 dakika önce vitrifikasyon aparatı haznesine yerleştirin.
   NOT: Filtre kağıdının hazneye çok erken yerleştirilmesi çok ıslanmasına neden olur.

4. Lekelenme deneyi

NOT: Izgarayı tutarken, ızgaranın sabit olduğundan ve cımbızla minimum temas alanı olduğundan emin olun (Şekil 4). Bu, etan'ın en iyi soğutma verimliliğini korumak ve vitröz olmayan buzdan kaçınmak için yapılır.

1. Numunenin 7-9 μL'sini ızgaraya uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Ardından 1-2 s bekleyin, 1-1.5 s için lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın.
2. Izgarayı sıvı etandan, sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın.
   NOT: Bu adım çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir, çünkü cımbız hala sıcaktır, bu nedenle tüm soğutma tankı şu anda buharla doludur.

5. Izgaralar için kalite kontrolü

1. Izgaraları kırpın ve bir kriyo-EM cihazına yükleyin.
2. Izgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını taramak için kriyo-EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz işlevini kullanın.
   NOT: Çoğu zaman, ızgaralar çok kurudur veya buz tabakası çok kalındır. Yüksek sıcaklıklarda hazırlanan ızgaraların başarı oranı, oda sıcaklığında veya 4 °C'dekinden önemli ölçüde daha düşüktür. İyi ızgaraların ve tatmin edici olmayan ızgaraların temsili sonuçları bir sonraki bölümde gösterilmiştir.
3. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini çeşitli koşullarla (bekleme süresi, lekelenme süresi vb.) tekrarlayın. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın.

6. Veri toplama

1. Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir kriyo-EM cihazına aktarın.
2. Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin.
   NOT: Önceki yayınımızda gösterildiği gibi, yapının çözünürlüğü yüksek sıcaklık^12'den etkilenmez.

Düşük büyütmeye genel bakış Şekil 5A,B'de gösterilmiştir. Panel A, başarılı bir ızgara örneğidir. Sol üstten (daha kalın) sağ alta (daha ince veya boş) bir buz gradyanı vardır. Böyle bir ızgara, mavi ve yeşil kutular gibi veri toplama için uygun orta alanda uygun bir buz tabakası kalınlığı bulmayı kolaylaştırır. B ızgarası çok kuru. Izgaradaki kareler parlak kontrasta sahiptir, bu da buz tabakasının çok ince olduğu veya hiç buz tabakası olmadığı anlamına gelir. Yalnızca kırmızı oklarla gösterilen iki kare veri toplama için uygundur.

Ayrıca, farklı ızgaralardan gelen düşük doz görüntülerin örnekleri Şekil 5C, D'de gösterilmiştir. C panelindeki görüntü, buzun çoğunun kristalin formda olduğunu, veri toplama için uygun olmadığını göstermektedir. Öte yandan, panel D'deki görüntü, buz tabakasının çoğunlukla veri toplama için uygun, amorf bir durumda olduğunu göstermektedir.

Lütfen bunun yüksek sıcaklıklarda ızgara hazırlığına odaklanan kısa bir makale olduğunu unutmayın. Kılavuz yalnızca veri toplama örneğini içerir. İyi bir ızgara, kesin bir şans olmasa da, yüksek çözünürlüklü bir yapıyı çözmek için iyi veriler üretmek için iyi bir şansa sahiptir. Bu makalede açıklanan örnekler için gerçek kriyo-EM verileri ve nihai yapılar, yayınlanan makale^12'de zaten açıklanmıştır. Kısacası, veri toplama için yeterince iyi ızgaralar elde ettik, her biri altı farklı sıcaklıktaki iki Sso-KARI kompleksinin yapılarını çözdük ve her kompleks için farklı sıcaklıklardaki yapıları ve aynı sıcaklıktaki iki kompleks arasındaki yapıları karşılaştırdık. Sonuçlar, her kompleksin yapısının sıcaklığa bağlı olduğunu ve sıcaklığa bağlı değişikliklerin iki kompleks arasında farklı olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, birbirini izleyen yapısal değişiklikler, sıcaklığa bağlı numune ızgarası hazırlığının başarısı için güçlü bir gösterge olan ardışık sıcaklık değişimleriyle iyi ilişkilidir.

Şekil 1: Yüksek sıcaklıkta kriyo-EM numune hazırlama için genel deney düzeneği. Gösterilen ürünler arasında vitrifikasyon aparatı, inkübatör, zamanlayıcı, pipet ucu yerleştirme, soğutma tankı ve cımbız bulunur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Vitrifikasyon aparatı haznesinin modifikasyonu. Kırmızı ok¹² ile belirtildiği gibi ultrasonik sprey çıkışına 50 mL'lik bir tüp monte edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Deney sırasında vitrifikasyon aparatının görünümü. Ekranda sıcaklık 55 ° C'de ve nem% 100'de gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Izgarayı kapmak için cımbız kullanma. Cımbızların ızgarayı mümkün olduğunca az temasla kavraması önerilir, ancak işlem sırasında ızgarayı sabit bir şekilde tutabilmelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Temsili sonuçlar: Cryo-EM ile ızgara kontrolü. (A,B) ızgaranın genel durumunu gösterir. (C, D) farklı ızgaralardan düşük doz görüntülerin örneklerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolün 1. adımında, santrifüj tüpünün iyi monte edildiğinden ve deney devam ederken düşmediğinden emin olun. Haznede, filtre kağıdının adsorpsiyon kapasitesini değiştirebilecek çok sayıda su damlacığının birikmesi nedeniyle, vitrifikasyon aparatı haznesi denge sıcaklığına ulaştıktan sonra deneyin toplam süresinin 30 dakikayı geçmemesi önerilir. Çalışma süresi 30 dakikayı aşarsa, operatörün filtre kağıdını değiştirmesi ve kabinin sıcaklık ve nemi tekrar dengelemesini beklemesi gerekir. Protokolün 8. adımında, önerilen 7-9 μL'lik numune hacmi normalden daha büyüktür, çünkü aksi takdirde, numune yüksek sıcaklıkta hızla buharlaşır ve ızgarada boş karelere yol açar. Öte yandan, uygulanan numunenin 9 μL'yi geçmemesi şiddetle tavsiye edilir. Aksi takdirde, lekelenmeden önce cımbızın hareket ettirilmesi işlemi sırasında numunenin damlaması çok muhtemeldir. Genel olarak, bu tekniğin başarısının anahtarı, ızgaraların istikrarlı ve hızlı bir şekilde kavranması ve her zaman sınırlı eylemin doğru ve istikrarlı bir şekilde uygulanmasıdır. Ayrıca, her deney turunun yalnızca bir belirli yüksek sıcaklıkla ilgilenmesi önerilir. Deneyi başka bir sıcaklıkta gerçekleştirmeye devam etmeden önce, tüm sistemler tamamen kurtarılmalı ve sıfırlanmalıdır.

Odanın yüksek sıcaklığı ve yüksek nemi nedeniyle, pencere genellikle deneyin başlatılmasında zorluklara yol açan sisle kaplıdır. Pencereyi temizlemek için biraz sabun köpüğü kullanılması önerilir. Izgaralar iyi değilse, olası nedenler yukarıda açıklanan adımların tam olarak izlenmemesi ve / veya adımların çok uzun sürmesidir. Numune ızgaralarının hazırlanmasını hassasiyet ve çabuklukla tekrarlamaya çalışın. Tekrarlardan sonra ızgaralar hala iyi değilse, koşulları ayarlamaya çalışın. Bu deneyde gözlemlenen daha sık görülen sorun, yüksek sıcaklıkta ızgarada buz olmamasıdır. Eğer öyleyse, lekelenme süresini daha da azaltmaya çalışın. Öte yandan, buz çok kalınsa, lekelenme süresini artırmaya çalışın.

Yüksek sıcaklık kriyo-EM'nin bir sınırlaması, vitrifikasyon aparatı üzerindeki maksimum ısıtma sıcaklığının 60 ° C olmasıdır. Daha yüksek sıcaklığa ulaşmak için, numune 60 ° C'nin (örneğin, 80 ° C) üzerinde ısıtıldı ve numune sıcaklığı ile vitrifikasyon sıcaklığı arasındaki ortalamanın, numunenin ızgaradaki gerçek sıcaklığı olduğu tahmin edildi (bu durumda 70 ° C). Bu tahmine dayanarak bazı yanlışlıklar olabilir. Gelecekteki olası bir çözüm, dalma-dondurmadan hemen önce ızgara sıcaklığını doğru bir şekilde ölçmek için bir termokupl oluşturmaktır. Diğer bir potansiyel sınırlama, proteinin yüksek sıcaklıklarda stabilitesidir. Proteinin planlanan kriyo-EM deneyi için sıcaklıkta stabil olmasını sağlamak için dairesel dikroizm kullanan ayrı bir deney yapılmalıdır.

Diğer bir sınırlama, ticari olarak temin edilebilen sadece iki tip vitrifikasyon aparatının, yukarıda belirtildiği gibi 37 ° C'nin üzerine ve 60 ° C'ye kadar ısıtılabilmesidir (örneğin, Thermo Fischer Vitrobot ve Leica EM-GP). Diğer satıcıların vitrifikasyon aparatları oda sıcaklığı ile sınırlıdır veya sadece 4 °C ile 37 °C arasında ayarlanabilir. Bununla birlikte, araştırma gruplarının gelecekte genişletilmiş sıcaklık aralıklarına sahip kendi dalma cihazlarını inşa etmeleri mümkündür.

Protokolümüz, şebekeleri oda sıcaklığından daha yüksek sıcaklıklarda hazırlamak amacıyla mevcut protokoller ^4,5,6'dan değiştirilmiştir. Burada açıklanan modifikasyonları yapmadan, kriyo-EM görüntü toplama için uygun iyi yüksek sıcaklıktaki numune ızgaraları yapma başarısı çok düşüktür.

2019'daki iki makale, protein yapılarının, protein fonksiyonlarının sıcaklığa bağımlılığı ile ilişkili olarak, TRP kanalı TRPV3¹¹ için 4 °C ila 42 °C ve Sso-KARI ¹² için 4 °C ila 70 °C aralığında sıcaklığa bağlı olduğunu göstermiştir. Bu raporların kriyo-EM araştırmalarında bir değişikliği teşvik etmesi muhtemeldir, çünkü gelecekteki daha fazla çalışma işlevsel olarak ilgili sıcaklıklarda, genellikle 37 ° C'de gerçekleştirilecektir. Saflaştırılmış proteinin bu sıcaklıktaki stabilitesi bir endişe kaynağı olabilir. Bununla birlikte, protein örneğinin bu sıcaklıkta protokolümüze göre sadece 2 dakika kuluçkaya yatırılması gerekmektedir. Alternatif olarak, tomografi ve sub-tomo ortalaması kullanılarak hücrelerdeki proteinlerin görüntülenmesiyle fizyolojik koşullar sağlanabilir. Ayrıca, kriyo-EM, muhtemelen 40 ° C ila 80 ° C aralığında, yüksek sıcaklıklarda ortaya çıkan proteinin mekanizmasını ve ara ürünlerini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmaların hepsi burada açıklanan protokolden yararlanacaktır.

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Yazarlar, yararlı tavsiyeler için Thermo Fisher Scientific'ten Dr. Hervé Remigy'ye teşekkür eder. Kriyo-EM deneyleri Academia Sinica Cryo-EM Tesisi'nde (ASCEM) gerçekleştirildi. ASCEM, Academia Sinica (Hibe No. AS-CFII-108-110) ve Tayvan Protein Projesi (Hibe No. AS-KPQ-109-TPP2). Yazarlar ayrıca numune hazırlama konusundaki yardımları için Bayan Hui-Ju Huang'a teşekkür eder.