Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

В этой статье представлен подробный протокол подготовки сеток для образцов при температурах до 70 °C перед погружением замораживания для крио-ЭМ-экспериментов.

Сетки образцов для экспериментов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) обычно готовят при температуре, оптимальной для хранения биологических образцов, в основном при 4 °C и иногда при комнатной температуре. Недавно мы обнаружили, что структура белка, решенная при низкой температуре, может быть функционально неактуальной, особенно для белков из термофильных архей. Была разработана процедура подготовки образцов белка при более высоких температурах (до 70 °C) для крио-ЭМ-анализа. Мы показали, что структуры из образцов, полученных при более высоких температурах, функционально значимы и зависят от температуры. Здесь мы опишем подробный протокол подготовки пробных сеток при высокой температуре, используя в качестве примера 55 °C. В эксперименте использовали витрификационный аппарат, модифицированный с использованием дополнительной центрифужной трубки, и образцы инкубировали при 55 °C. Подробные процедуры были точно настроены, чтобы свести к минимуму конденсацию пара и получить тонкий слой льда на сетке. Приведены примеры успешных и неудачных экспериментов.

Крио-ЭМ-технология решения структур белковых комплексов продолжала совершенствоваться, особенно в направлении получения структур высокого разрешения ^1,2. В то же время ландшафт его применения также был расширен за счет изменения условий отбора проб, таких как рН или лиганды, до процесса витрификации³, который включает в себя подготовку сеток образцов с последующим погружным замораживанием ^4,5. Еще одним важным условием является температура. Хотя крио-ЭМ-эксперименты, такие как рентгеновская кристаллография, выполняются при низких температурах, структура, решаемая крио-ЭМ, отражает структуру в состоянии раствора до витрификации. До недавнего времени в большинстве крио-ЭМ-исследований анализа одиночных частиц (SPA) использовались образцы, которые хранятся на льду (т.е. при 4 °C) до витрификации⁶, хотя в ряде исследований используются образцы при комнатной температуре около 7,8,9,10 или до 42 °C ¹¹. В недавнем отчете мы провели температурно-зависимые исследования фермента кетол-кислотной редуктоизомеразы (KARI) из термофильного археона Sulfolobus solfataricus (Sso) при шести различных температурах от 4 ° C до 70 ° C¹². Наши исследования показывают, что важно готовить сетки образцов при функционально значимых температурах и что крио-ЭМ является единственным структурным методом, который практически осуществим для решения структуры одного и того же белкового комплекса при нескольких температурах.

Основная трудность для витрификации при высоких температурах заключается в минимизации конденсации пара и достижении тонкого льда. Здесь мы сообщаем о подробном протоколе, используемом для подготовки сеток образцов при высоких температурах в нашем предыдущем исследовании Sso-KARI ¹². Мы предполагаем, что читатели или зрители уже имеют опыт в общих процедурах подготовки образцов и обработки данных для крио-ЭМ-экспериментов, и подчеркиваем аспекты, относящиеся к высокой температуре.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол направлен на использование модифицированного коммерческого витрификационного аппарата для подготовки образцов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) при определенных температурах, особенно выше 37 °C. Общая экспериментальная установка показана на рисунке 1. В качестве примера протокол использует 55 °C. Конкретные условия при других температурах см. в Дополнительной таблице 2 в ссылке¹².

1. Подготовка витрификационного аппарата

1. Сделайте отверстие размером 1 см в трубке центрифуги объемом 50 мл на ее закрытом конце.
2. Поместите трубку в камеру витрификационного аппарата на выходе ультразвуковой воды, как показано на рисунке 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму конденсацию воды, направляя водяной пар в теплообменник через трубку, прежде чем достичь всей камеры.
3. Установите температуру витрификационного аппарата на указанную температуру (например, 55 °C, как показано на фиг.3) и позвольте камере устройства витрификации достичь 55 °C и 100% относительной влажности. Дайте ему постоять не менее получаса, чтобы стабилизировать условия перед началом эксперимента.

2. Разогрев образца и инструментов

1. Поставьте водяную баню на конфорку и установите конфорку на нужную температуру (здесь 55 °C). Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что вода достигает 55 °C.
2. Высиживайте образец на водяной бане и разогрейте наконечник пипетки на краю конфорки в течение 2 мин или дольше перед экспериментом по промоканию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая температура для камеры витрификационного аппарата составляет 60 °C. Для подготовки высокотемпературных решеток для эксперимента с циро-ЭМ (например, 70°С) образец инкубируют на водяной бане при 80°С, и среднее значение между температурой образца и температурой витрификационного аппарата оценивается как фактическая температура образца на сетке (в данном случае 70°С). Смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации и ограничений на эту оценку.

3. Подготовка к эксперименту по блоттингу

1. Тлеющий разряд представляет собой дырявую углеродную сетку при 25 мА в течение 30 с, или альтернативную значениям в зависимости от используемого устройства.
2. Инкубировать пинцет сеткой в витрификационном аппарате в течение 2 мин или дольше.
3. Наполните контейнер с этаном этаном в соответствии со стандартными процедурами. Не допускайте переполнения этана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 10 минут и должен немедленно сопровождаться экспериментом по промоканию, чтобы избежать замерзания.
4. Поместите фильтровальную бумагу для витрификации в камеру витрификационного аппарата не ранее, чем за 5 минут до эксперимента по промоканию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение фильтровальной бумаги в камеру слишком рано приведет к тому, что она станет слишком влажной.

4. Эксперимент с блоттингом

ПРИМЕЧАНИЕ: При удержании сетки убедитесь, что сетка стабильна и имеет минимальную площадь контакта с пинцетом (рисунок 4). Это делается для поддержания наилучшей эффективности охлаждения этана и избегания нестекретного льда.

1. Используйте наконечник пипетки, чтобы нанести 7-9 мкл образца на сетку. Затем подождите 1-2 с, промокните 1-1,5 с и быстро окуните образец в жидкий этан.
2. Перенесите сетку из жидкого этана в криокроб, который хранится в жидком азоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен очень осторожно, потому что пинцет все еще горячий, поэтому весь охлаждающий бак в это время полон пара.

5. Проверка качества сеток

1. Обрежьте сетки и загрузите их на крио-ЭМ-инструмент.
2. Используйте экран дисплея крио-ЭМ-прибора и функцию низкой дозы программного обеспечения для скрининга состояния льда на сетке и распределения образца по сетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто сетки очень сухие, или слой льда слишком толстый. Успешность сеток, приготовленных при высоких температурах, значительно ниже, чем при комнатной температуре или 4 °C. Репрезентативные результаты хороших и неудовлетворительных сеток показаны в следующем разделе.
3. Если качество полученной сетки не очень хорошее, повторите процесс подготовки сетки с различными условиями (такими как время ожидания, время промокания и т. Д.). Если качество полученной сетки хорошее, повторите те же шаги, чтобы сделать сетки при другой температуре.

6. Сбор данных

1. Перенесите сетки хорошего качества на крио-ЭМ-прибор высокого разрешения.
2. Осуществлять сбор и анализ данных в соответствии с установленными процедурами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в нашей предыдущей публикации, разрешение конструкции не зависит от высокой температуры¹².

Обзор низкого увеличения показан на рисунке 5A,B. Панель A является примером успешной сетки. Есть градиент льда сверху слева (толще) до нижнего правого (тоньше или пустее). Такая сетка облегчает поиск подходящей толщины ледяного слоя в средней области, подходящей для сбора данных, такой как синие и зеленые квадраты. Сетка B слишком сухая. Квадраты в сетке имеют яркий контраст, что означает, что слой льда слишком тонкий или его вообще нет. Только два квадрата, обозначенные красными стрелками, подходят для сбора данных.

Кроме того, примеры изображений низких доз из различных сеток показаны на рисунке 5C,D. Изображение на панели C показывает, что большая часть льда находится в кристаллической форме, не подходящей для сбора данных. С другой стороны, изображение на панели D показывает, что слой льда в основном находится в аморфном состоянии, пригодном для сбора данных.

Обратите внимание, что это короткая статья, посвященная подготовке сетки при высоких температурах. Сетка содержит только образец для сбора данных. Хорошая сетка имеет хороший шанс, хотя и не определенный шанс, генерировать хорошие данные для решения структуры с высоким разрешением. Реальные крио-ЭМ данные и конечные структуры для примеров, описанных в этой статье, уже описаны в опубликованной статье¹². Короче говоря, мы получили сетки, достаточно хорошие для сбора данных, решили структуры двух комплексов Sso-KARI при шести различных температурах каждый и сравнили структуры из разных температур для каждого комплекса, а также структуры между двумя комплексами с одинаковой температурой. Результаты показывают, что структура каждого комплекса зависит от температуры и что температурно-зависимые изменения различаются между двумя комплексами. Важно отметить, что последовательные структурные изменения хорошо коррелируют с последовательными изменениями температуры, что является убедительным показателем успеха подготовки пробоотборной сетки, зависящей от температуры.

Рисунок 1: Общая экспериментальная установка для высокотемпературной крио-ЭМ пробоподготовки. Показанные предметы включают в себя витрификационный аппарат, инкубатор, таймер, размещение наконечника пипетки, охлаждающий бак и пинцет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Модификация камеры витрификационного аппарата. Трубка объемом 50 мл установлена на выходе ультразвукового распыления, как указано красной стрелкой¹². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Внешний вид витрификационного аппарата во время эксперимента. Экран показывает температуру при 55 °C и влажность при 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Использование пинцета для захвата сетки. Рекомендуется, чтобы пинцет захватывал сетку с как можно меньшим контактом, но он должен быть в состоянии стабильно удерживать сетку в процессе операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативные результаты: Проверка сетки с помощью Cryo-EM. (A,B) показать общее состояние сетки. (C,D) показывают примеры изображений низких доз из различных сеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На шаге 1 протокола убедитесь, что трубка центрифуги установлена хорошо и не падает во время эксперимента. В связи с накоплением в камере большого количества капель воды, которые могли изменить адсорбционную способность фильтровальной бумаги, рекомендуется, чтобы общее время эксперимента не превышало 30 мин после того, как камера витрификационного аппарата достигла температуры равновесия. Если время работы превышает 30 мин, оператору необходимо заменить фильтровальную бумагу и подождать, пока в салоне снова сбалансируют температуру и влажность. На этапе 8 протокола предлагаемый объем образца в 7-9 мкл больше, чем обычно, поскольку в противном случае образец быстро испаряется при высокой температуре, что приводит к пустым квадратам на сетке. С другой стороны, настоятельно рекомендуется, чтобы применяемый образец не превышал 9 мкл. В противном случае весьма вероятно, что образец будет капать вниз в процессе перемещения пинцета перед промоканием. В целом, залогом успеха этой техники является стабильное и быстрое захват сеток и правильное и стабильное выполнение каждого ограниченного по времени действия. Кроме того, рекомендуется, чтобы каждый раунд экспериментов имел дело только с одной конкретной высокой температурой. Прежде чем приступить к выполнению эксперимента при другой температуре, все системы должны быть полностью восстановлены и сброшены.

Из-за высокой температуры и высокой влажности камеры окно часто покрывается туманом, что приводит к трудностям при запуске эксперимента. Для очистки окна рекомендуется использовать немного мыльных пен. Если сетки не являются хорошими, возможные причины заключаются в том, что описанные выше шаги не выполняются точно и/или что шаги занимают слишком много времени. Постарайтесь повторить подготовку пробных сеток с точностью и быстротой. Если сетки все еще не годятся после повторов, то попробуйте скорректировать условия. Более частой проблемой, наблюдаемой в этом эксперименте, является отсутствие льда на сетке при высокой температуре. Если это так, постарайтесь еще больше сократить время промокания. С другой стороны, если лед слишком толстый, постарайтесь увеличить время промокания.

Ограничением высокотемпературного крио-ЭМ является то, что максимальная температура нагрева на витрификационном аппарате составляет 60 °C. Для достижения более высокой температуры образец нагревали выше 60°С (например, 80°С), а среднее значение между температурой образца и температурой витрификации оценивалось как реальная температура образца на сетке (в данном случае 70°С). Может быть некоторая неточность, основанная на этой оценке. Возможным будущим решением является создание термопары для точного измерения температуры сетки непосредственно перед погружением-замерзанием. Другим потенциальным ограничением является стабильность белка при высоких температурах. Отдельный эксперимент с использованием кругового дихроизма следует провести, чтобы убедиться, что белок стабилен при температуре для запланированного крио-ЭМ-эксперимента.

Другим ограничением является то, что только два типа коммерчески доступных витрификационных устройств могут быть нагреты до температуры выше 37 ° C и до 60 ° C, как упоминалось выше (например, Thermo Fischer Vitrobot и Leica EM-GP). Витрификационные аппараты других производителей либо ограничены комнатной температурой, либо регулируются только между 4 °C и 37 °C. Тем не менее, исследовательские группы могут построить свои собственные погружные устройства с расширенными температурными диапазонами в будущем.

Наш протокол модифицирован по сравнению с существующими протоколами ^4,5,6, с целью подготовки сеток при температурах выше комнатной. Без внесения изменений, описанных здесь, шанс на успех для создания хороших высокотемпературных сеток образцов, подходящих для сбора крио-ЭМ изображений, очень мал.

Две работы в 2019 году продемонстрировали, что белковые структуры зависят от температуры, в корреляции с температурной зависимостью функций белка, в диапазоне от 4 °C до 42 °C для канала TRP TRPV3¹¹ и от 4 °C до 70 °C для Sso-KARI ¹². Эти отчеты, вероятно, будут способствовать изменению крио-ЭМ исследований в том, что больше будущих исследований будет проводиться при функционально значимых температурах, обычно при 37 ° C. Стабильность очищенного белка при этой температуре может быть проблемой. Тем не менее, требуется инкубировать образец белка при этой температуре всего в течение 2 минут в соответствии с нашим протоколом. Альтернативно, физиологические условия могут быть достигнуты путем визуализации белков в клетках с использованием томографии и субтомоусреднения. Кроме того, крио-ЭМ может быть использован для изучения механизма и промежуточных продуктов белка, разворачивающегося при высоких температурах, вероятно, в диапазоне от 40 °C до 80 °C. Все эти исследования выиграют от протокола, описанного здесь.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Авторы благодарят доктора Эрве Ремиджи из Thermo Fisher Scientific за полезные советы. Крио-ЭМ-эксперименты проводились в Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM поддерживается Academia Sinica (Грант No. AS-CFII-108-110) и Тайваньский протеиновый проект (грант No. AS-KPQ-109-TPP2). Авторы также благодарят г-жу Хуэй-Цзюй Хуан за помощь в подготовке проб.