Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal hastalıklar metabolizmanın en büyük doğuştan gelen hata sınıfını temsil eder ve şu anda tedavi edilemez. Bu hastalıklar, alttaki mekanizmaları aydınlatılmaya devam eden nörogelişimsel kusurlara neden olur. Önemli bir engel, hastalarda görülen erken başlangıçlı nöronal bozukluğu yeniden özetleyen etkili modellerin eksikliğidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki gelişmeler, hastalıkların sinir sisteminin gelişimi ve organizasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilecek üç boyutlu (3D) beyin organoidlerinin üretilmesini sağlar. Bu yazarlar da dahil olmak üzere araştırmacılar, son zamanlarda mitokondriyal bozuklukları modellemek için insan beyin organoidlerini tanıttılar. Bu makale, insan iPSC türevi beyin organoidlerinin sağlam üretimi ve mitokondriyal biyoenergetik profilleme ve görüntüleme analizlerinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol bildirmektedir. Bu deneyler, metabolik ve gelişimsel işlev bozukluklarını araştırmak için beyin organoidlerinin kullanılmasına izin verecek ve mitokondriyal hastalıkların nöronal patolojisini inceleyecek önemli bilgiler sağlayabilir.

Mitokondriyal hastalıklar metabolizmanın en büyük doğuştan gelen hata sınıfını temsil ^eder1. Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)², solunum zinciri montajı, mitokondriyal dinamikler ve mitokondriyal DNA transkripsiyonu veya replikasyonu3 dahil olmak üzere farklı mitokondriyal süreçleri bozan genetik mutasyonlardan kaynaklanırlar3. Enerji gereksinimi olan dokular özellikle mitokondriyal disfonksiyondan ^etkilenir4. Buna göre, mitokondriyal hastalıkları olan hastalarda tipik olarak erken başlangıçlı nörolojik belirtiler gelişir.

Şu anda mitokondriyal hastalıklardan etkilenen çocuklar için herhangi bir tedavi ^{bulunmamaktadır5}. Mitokondriyal hastalıkların ilaç gelişimi için önemli bir engel, insan hastalığı seyrini yeniden özetleyen etkili modellerin ^{eksikliğidir6}. Şu anda çalışılan hayvan modellerinin birçoğu hastalarda mevcut nörolojik kusurları ^göstermez7. Bu nedenle, mitokondriyal hastalıkların nöronal patolojisinin altında kalan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Son çalışmalar mitokondriyal hastalıklardan etkilenen hastalardan iPSC'ler üretti ve bu hücreleri hastaya özgü nöronal hücreler elde etmek için kullandı. Örneğin, mitokondriyal hastalık olan Leigh sendromu ile ilişkili genetik kusurların hücresel biyoenergetiklerde ^8,9, protein sentezinde10 ve kalsiyum homeostaz9,11'de sapmalara neden olduğu bulunmuştur. Bu raporlar, mitokondriyal hastalıklarda meydana gelen nöronal bozukluk hakkında önemli mekanistik ipuçları sunarak, bu tedavi edilemez hastalıklar için ilaç keşfinin önünü ^açtı12.

Bununla birlikte, iki boyutlu (2D) kültürler, 3D organların mimari karmaşıklığının ve bölgesel organizasyonunun araştırılmasını ^sağlamaz13. Bu amaçla, hastaya özgü iPSC'lerden türetilen 3D beyin organoidlerinin ^{kullanımı14} , araştırmacıların ek önemli bilgiler edinmelerine ve böylece mitokondriyal hastalıkların sinir sisteminin gelişimini ve işlevini nasıl etkilediğinin incelenebilmesine yardımcı ^olabilir15. Mitokondriyal hastalıkları araştırmak için iPSC türevi beyin organoidleri kullanan çalışmalar, mitokondriyal hastalıkların nörogelişimsel bileşenlerini ortaya çıkarmaya başlıyor.

Mitokondriyal hastalık, mitokondriyal ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri atak sendromu (MELAS) ile ilişkili mutasyonlar taşıyan omurilik organoidleri, kusurlu nörogenez ve gecikmiş motor nöron farklılaşması ^gösterdi16. Mitokondriyal hastalığı olan Leigh sendromu olan hastalardan elde edilen kortikal organoidler, küçültülmüş boyut, nöral epitel tomurcuk neslinde kusurlar ve kortikal mimari kaybı ^gösterdi17. Leigh sendromu hastalarından beyin organoidleri, hastalık kusurlarının mitokondriyal metabolizmaya bağlanamayan nöral progenitör hücreler düzeyinde başlatıldığını, anormal nöronal dallanma ve ^{morfogenez18'e} neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, nöral progenitörler mitokondriyal hastalıklar için hücresel bir terapötik hedefi temsil edebilir ve mitokondriyal fonksiyonlarını teşvik eden stratejiler sinir sisteminin fonksiyonel gelişimini destekleyebilir.

Beyin organoidlerinin kullanımı mitokondriyal hastalıkların nörogelişimsel bileşenlerini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Mitokondriyal hastalıklar esas olarak erken başlangıçlı nörodejenerasyon olarak kabul ^edilir5. Bununla birlikte, gelişimsel gecikme ve bilişsel bozukluk da dahil olmak üzere mitokondriyal hastalıklardan etkilenen hastalarda nörogelişimsel kusurlar da ^mevcuttur19. Hastaya özgü beyin organoidleri bu yönleri ele almaya yardımcı olabilir ve mitokondriyal hastalıkların insan beyin gelişimini nasıl etkileyebileceğini aydınlatabilir. Mitokondriyal disfonksiyon, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington ^{hastalığı4} gibi diğer daha yaygın nörolojik hastalıklarda da patogenetik bir rol oynayabilir. Bu nedenle, mitokondriyal kusurların beyin organoidlerini kullanarak nörogelişimdeki etkisinin aydınlatılması da bu hastalıkların incelenmesinde etkili olabilir. Bu makalede, mitokondriyal hastalıkların hastalık modellemesi için kullanılabilecek tekrarlanabilir beyin organoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

NOT: İnsan iPSC'lerinin kullanımı etik bir onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan iPSC'ler, yerel etik onayı takiben sağlıklı kontrol kişilerinden türetilmiştir (#2019-681). Tüm hücre kültürü prosedürleri steril bir hücre kültürü başlığı altında yapılmalı, kaputun altına aktarılmadan önce tüm reaktifler ve sarf malzemeleri dikkatlice dezenfekte edilmelidir. Farklılaşma için kullanılan insan iPSC'leri, geniş kültür üzerinde oluşabilecek potansiyel genomik sapmaları önlemek için 50'nin altında bir geçiş numarasına sahip olmalıdır. Hücrelerin pluripotent durumu organoid oluşturmadan önce, örneğin NANOG veya OCT4 gibi pluripotency ile ilişkili belirteçlerin ekspresyosu izlenerek doğrulanmalıdır. Mikoplazmasız kültürleri sağlamak için haftalık olarak mikoplazma testleri yapılmalıdır.

1. Beyin organoidlerinin üretimi

1. İnsan iPSC'lerinin kültürü
   1. iPSC ortamında besleyici içermeyen koşullar altında insan iPSC'lerini kültüre edin ( Malzeme Tablosuna bakın) kaplamalı 6 kuyulu plakalarda ve bunları 37 °C ve% 5 _CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutun.
      NOT: Besleyici hücrelerin taşınması organoid farklılaşmasına engel olabilir. Besleyici içermeyen koşullarda hücreleri en az bir kez geçiş.
   2. 1:4 ile 1:12 arasında değişen oranlarda enzimsiz kopma ortamını kullanarak iPSC'leri %80 iklüziyette geçiştirin. Hücre sağkalımini artırmak için, her bölünmeden sonra 10 μM Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (Y27632) ekleyin.
2. iPSC'leri ayrıştırın (%80 izdiah)-Gün 0.
   1. Kortikal Farklılaşma Ortamı I (CDMI) Hazırlayın (Tablo 1). Hücrelere eklemeden önce oda sıcaklığında (22-25 °C) ön ısıtma CDMI ortamı.
   2. Ölü hücreleri ve döküntüleri gidermek için iPSC'leri içeren kuyuları fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
   3. Her kuyuya 500 μL önceden ısıtılmış Reaktif A (Malzeme Masası) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre müfrezesini sağlamak için mikroskobun altına bakın.
   4. Aktivitesini nötralize etmek için reaktif A'yı seyreltmek için 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
   5. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri ayrıştırmak ve hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak için 1000 μL pipet kullanın.
   6. IPSC'leri oda sıcaklığında (22-25 °C) 5 dakika boyunca 125 x g'da hafifçe santrifüjlayın.
   7. Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice emiş edin.
   8. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için peletin 1 mL CDMI ile yeniden kullanın ve hücre numarasını sayın.
   9. 20 μM KAYA inhibitörü, 3 μM WNT-catenin inhibitörü (IWR1) ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş CDMI'da 100 μL başına 9.000 iPSC ile tohumlama ortamını hazırlayın.
   10. 96 kuyu v-alt plakaya kuyu başına 100 μL tohumlama ortamı ekleyin.
   11. Plakayı 37 °C ve %5 _CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutun.
3. Nörosfer üretimi
   1. 1. günde, tanımlanmış pürüzsüz kenarlıklara sahip yuvarlak hücre agregalarının (nörosferler) oluştuğunu gözlemleyin. Agregaların etrafındaki ölü hücrelere dikkat edin. 37 °C ve %5 _CO2'de inkübatörde kültüre devam edin.
   2. 3. günde, ölü hücreleri ayırmak için yanlara üç kez dokunarak plakayı ajite edin.
   3. Her kuyuya 20 μM KAYA inhibitörü, 3 μM IWR1 ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş 100 μL CDMI ekleyin.
   4. Plakayı 37 °C ve %5 _CO2'de inkübatöre geri verin.
   5. 6. günde, her kuyudan 80 μL'lik süpernatan ortamı dikkatlice çıkarın. Kuyunun dibine dokunmaktan kaçının.
   6. Her kuyuya 3 μM IWR1 ve 5 μM SB431542 ile desteklenmiş 100 μL CDMI ekleyin. Plakayı 37 °C ve %5 _CO2'de inkübatöre geri verin.
   7. 5. ve 6.
4. Nörosferlerin transferi
   1. 18. günde Kortikal Farklılaşma Orta II (CDMII) (Tablo 1) hazırlayın ve 100 mm ultra düşük ek hücre kültür plakasına 10 mL ekleyin.
   2. Yuvarlak nörosferleri 96 kuyu plakasından 100 mm ultra düşük ek hücre kültür plakasına aktarmak için ucu kesilmiş 200 μL pipet kullanın.
      NOT: Ucun açılmasının yeterince geniş olduğundan ve agregaların çok hızlı emişli olmadığından emin olarak nörosferlere zarar vermekten kaçınmak için nazik olun.
   3. Nörosferleri içeren plakadan 5 mL orta çıkarın ve 5 mL taze CDMII ekleyin.
      NOT: Bu prosedür, nörosferlerin transferinden taşınmış olabilecek CDMI ortamının miktarını azaltmaya yardımcı olur.
   4. Plakayı 37 °C ve %5 _CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün içinde 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
      NOT: Ertesi gün nörosferleri görsel olarak inceleyin. Nörosferler birbirine topaklanmışsa veya plakanın altına tutturulmuşsa yörüngesel çalkalayıcının hızını artırın.
   5. Her 3 günde bir, süpernatant ortamı dikkatlice emiş ve yeni CDMII ile değiştirin. Nörosferlerin kurumasını önlemek için az miktarda ortam bırakın.
   6. 35. günde Kortikal Farklılaşma Orta III (CDMIII) (Tablo 1) hazırlayın.
      NOT: Matris bileşeni soğuk CDMIII'de çözülmelidir.
   7. Ortamı plakadan epire edin ve 10 mL soğuk CDMIII ekleyin.
      NOT: Matris bileşeninin kümeler oluşturmadan organoidleri kaplayabilmesi için soğuk ortam kullanmak daha etkilidir.
   8. Ortamı değiştirdikten sonra, plakayı 37 °C ve% 5 _CO2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün içinde 70 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcıya geri yerleştirin.
   9. Ortamın renginde belirtildiği gibi, büyüme hızına bağlı olarak her 3-5 günde bir ortamı değiştirin.
   10. 70. günde Kortikal Farklılaşma Orta IV (CDMIV) (Tablo 1) hazırlayın. Organoidlerin istenilen yaşına gelene kadar CDMIV ortamını kullanın. Bu süre zarfında, plakayı nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörünün (%37 °C ve %5 _CO2) içinde 70 rpm'de ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcı üzerinde tutun.
   11. Büyüme hızına bağlı olarak ortamı her 3-5 günde bir değiştirin.

2. Beyin organoidlerinin immünostaining

1. Doku hazırlama
   1. %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve bir emniyet başlığının altına yerleştirin.
      NOT: PFA kullanırken kişisel güvenlik ekipmanlarını giyin.
   2. Beyin organoidlerini toplayın ve künt uçlu 3 mL plastik Pasteur pipetle pfa ile dolu 6 kuyulu bir plakaya hafifçe aktarın.
      NOT: Daha yüksek hücresel karmaşıklığa sahip yapıların görselleştirilmesine izin vermek için 40 günden eski organoidleri kullanın.
   3. Organoidleri oda sıcaklığında 1 saat pfa çözeltisinde tutun.
   4. PFA'yı 3 mL plastik Pasteur pipetle dikkatlice çıkarın ve sabit organoidleri PBS kullanarak üç kez yıkayın.
   5. Sabit organoidleri bir sonraki kullanıma kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
2. Beyin organoid dilimlerinin hazırlanması
   1. % 3 agar çözeltisi hazırlayın ve sıvılanıncaya kadar yavaşça ısıtın.
   2. Kalıbı (10 mL şırıngırın kesilmiş ucu) bir emici filtre kağıdı parçasına (pürüzsüz yan yukarı) yerleştirin. Üzerine bir damla agar yerleştirin.
   3. 6 kuyulu plakadan tek bir organoidi spatula ile hızla çıkarın ve filtre kağıdı ile aşırı PBS'yi çıkarın.
      NOT: Organoide doğrudan filtre kağıdı ile dokunmamaya dikkat edin.
   4. Organoidi agar damlasının üzerine yerleştirin.
   5. Bu işlemi en fazla üç organoid ile tekrarlayın.
      NOT: Bu adım sırasında agarın katılaşmasını önlemek için hızlı çalışın.
   6. Tüm organoidler tamamen kaplanana kadar kalıbı agar ile doldurun.
   7. Agar katılaşmaya başlayana kadar bekleyin ve ardından emici filtre kağıdı da dahil olmak üzere organoidleri içeren tüm kalıbı hafifçe bir soğutma elemanına aktarın.
      NOT: Bir soğutma elemanı kullanılamıyorsa, organoidleri 4 °C'de bir buzdolabında birkaç dakika saklayın.
   8. Bu arada, dilimleme prosedürüne hazırlanın: vibratozun tutucusuna bir jilet (asetonla temizlenmiş ve çift damıtılmış suyla yıkanmış) yerleştirin, banyoya monte edin ve PBS ile doldurun.
   9. Kalıbı (katılaşmış) agardan çıkarın ve bir küp oluşturmak için kırpmak için bir neşter kullanın.
   10. Vibratomu taşıyıcı plakasına organoidleri içeren agar küpünü yapışkan jel ile takın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve PBS içeren banyoya yerleştirin.
   11. Vibratomu ( Malzeme Tablosuna bakın) 150 μm kalınlığında dilimleri kesecek şekilde ayarlayın.
       NOT: Vibratom ayarları (bıçağın uygun açısı, genliği, sıklığı ve hızı) erken doğum sonrası hayvanlardan elde edilen sabit beyin dokusunu dilimlemede kullanılanlara benzer olabilir. Bununla birlikte, ideal ayarlar vibratomun türüne güçlü bir şekilde bağlıdır ve kesim yaparken dokunun bozulmasını ve hatta yırtılmasını önlemek için ilk adımda belirlenmelidir.
   12. Kesme işlemine başlayın. Taze kesilmiş her dilimi PBS ile dolu 24 kuyulu bir tabağa hafifçe aktarmak için bir cam pipet veya spatula kullanın.
   13. Dilimler içeren plakayı bir sonraki işleme kadar 4 °C'de (birkaç güne kadar) saklayın.
   14. Dilimleri bir cam pipet veya spatula ile plakadan mikroskop slaytlarına aktarın. Slayt başına en az 2 dilim kullanın.
   15. Agar ve fazla PBS'yi bir şırıngarla dikkatlice çıkarın.
   16. Dilimlerin slaytlara yapışana kadar kurumasını bekleyin.
       NOT: Mikroskop kaydıraklar PBS ile dolu plastik odalarda 4 °C'de saklanabilirken, dilimleme işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede boyanmalıdır.
3. İmmünohistokimyasal lekeleme
   1. Engelleme çözümünü hazırlayın (Tablo 1).
   2. Slaytlardaki tüm çözümlerin kalmasına yardımcı olmak için slayttaki dilimlerin etrafına hidrofobik bir kenarlık çizmek için pap kalem kullanın.
   3. Engelleme solüsyonlarını slayda dikkatlice ekleyin ve oda sıcaklığında (22-25 °C) 1 saat kuluçkaya yatırın. Dokuyu yok etmekten kaçınmak için çözeltiyi doğrudan dilimlerin üzerine eklemeyin.
   4. Blokaj çözeltisini epire edin ve istenen birincil antikoru blokaj çözeltisinde seyreltilmiş olarak uygulayın.
   5. Slaytı 4 °C'de nemlendirilmiş bir odada gece boyunca kuluçkaya yatırın.
   6. Slaydı her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
   7. Dilimleri blokaj çözeltisinde seyreltilmiş spesifik ikincil antikorla kuluçkaya yatırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca Hoechst lekeleme (1:2.500) gerçekleştirin.
      NOT: Spesifik olmayan bağlama veya otomatik floresan olmadığını onaylamak için negatif denetimler gerçekleştirmeyi unutmayın.
   8. Karanlıkta her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
   9. Dilime bir damla montaj ortamı ekleyin, damlanın kenarına bir kapak ucu yerleştirin ve hava kabarcıklarını önlemek için örtü kapağını yavaşça dilime doğru yerleştirin.
   10. Kaydırağın oda sıcaklığında gece boyunca dinlenmesine izin verin. Slaydı daha fazla mühürlemek için kapak kapağının sınırına oje sürün. Uzun süreli depolama için 4 °C'de saklayın.
4. Boyama belgeleri
   1. Büyük görüntüleri dikiş için taramak için, yüksek kaliteli bir amaç ile donatılmış motorlu bir dik geniş alan mikroskobu (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) yararlanın; DAPI filtre seti (örneğin, ekscitasyon (EX): 340-380 nm, dikroik ayna (DM): 400 nm, bariyer filtresi (BA): 435-485 nm); floresan izotiyosiyanat filtre seti (örneğin, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 filtre seti (örneğin, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); dijital kamera; otomatik dikişlere ve yığın işlemlerine izin sağlayan yüksek performanslı alım yazılımı.
   2. Görüntü işleme için, 8 bit tif dosyaları oluşturabilen, dikişleri kırpabilen, kontrastı ve parlaklığı ayarlayabilen, kanalları (örneğin mavi, yeşil ve kırmızı) birleştirebilen ve ölçek çubukları ekleyebilen bir görüntü işleme programı kullanın.
   3. Ayrıntıları taramak için, yüksek kaliteli bir amaç, bir UV lazer (EX: 408 nm), bir Argon lazer (EX: 488 nm), bir Helyum-Neon lazer (EX: 543), konfokal mikroskop için görüntüleme yazılımı ile donatılmış motorlu bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.
   4. Ayrıntıların görüntü işlemesi için, konfokal z yığınlarının maksimum yoğunluklu projeksiyonlarını (örneğin, her biri 0,6 μm optik bölümler) oluşturabilen, 8 bit tif dosyaları oluşturabilen, kontrastı ve parlaklığı ayarlayabilen, kanalları (örneğin, mavi, yeşil ve kırmızı) birleştirebilen, ölçek çubukları ekleyebilen bir görüntü işleme programı kullanın.
   5. Şekilleri düzenlemek için bir grafik düzenleyici kullanın.

3. Beyin organoidlerinin biyoenergetik profillenerek

1. Biyoenergetik profilleme için organoidlerin hazırlanması
   1. Üreticinin protokolüne uyarak papain ve DNase çözümünü hazırlayın.
   2. 3-5 organoidi 6 kuyulu bir tabağa aktarın. Önceden ısıtılan PBS ile iki kez yıkayın.
   3. DNase içeren 2 mL önceden ısıtilmiş aktif papain çözeltisi ekleyin. Bir bıçak kullanarak organoidleri küçük parçalara ayırın.
   4. Plakayı bir hücre kültürü inkübatörünün içinde (37 °C, %5 _CO2'de) 27 rpm'de ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin ve 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka süresi organoid evreye bağlıdır. Erken evre organoidler olduğu gibi kullanılabilir. 3 aydan büyük organoidler için, organoidlerin ayrışmadan önce 2-3 parçaya kesilmesi ve parçaların 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 27 rpm'de ayarlanmış bir sallanma hızında kuluçkaya yatması önerilir. Bu prosedür, ileri evre organoidlerde bulunabilecek nekrotik dokunun giderilmesine yardımcı olabilir.
   5. Sindirilen dokuları 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 5 mL organoid kültürü orta CDMIV ekleyin (Tablo 1).
   6. 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mL plastik pipet ile dokuyu üç katına çıkın. Bozulmamış dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
   7. Hücre süspansiyonu, herhangi bir ayrışma dokusu parçasından kaçınarak 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice aktarın. Çözeltiyi 40 μm hücre süzgeçten (örneğin, hücre süzgeç kapaklı polistiren yuvarlak dip tüpleri) filtreleyin.
   8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yaparak hücreleri peletin.
   9. Trypan mavisi kullanarak hücre numarasını ve kalitesini değerlendirin.
   10. Kaplamalı 96 kuyulu mikro plakalar üzerine istediğiniz sayıda (~20.000/well) plakalayın. Kaplamadan sonra orta 6-8 saat ortasını Nöronal Orta olarak değiştirin (Tablo 1).
   11. Kaplanmış 96 kuyulu mikro plakayı 4 gün boyunca bir _CO2 inkübatörde (37 °C, % 5 _CO2) kuluçkaya yatırın.
2. Biyoenergetik profil oluşturma
   1. Ayrışmış hücreleri yeniden biriktikten sonra 3. günde, 96 kuyulu mikro plakanın alt kısmının her kuyusuna 200 μL kalibrasyon çözeltisi ekleyin ve üst yeşil sensör kartuşunu hidratlı mikro plakanın üzerine yerleştirin.
      NOT: Sensör kartuşunu mikro plakanın üzerine doğru yönde yerleştirin ve kalibrasyon çözeltisinin tüm sensörleri kapsadığından emin olun.
   2. Hidratlı 96 kuyulu mikro plakayı bir gecede 37 °C'de _CO2 olmayan bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
   3. Cihazın bir gecede 37 °C'de stabilize olmasını sağlamak için analizörü açın.
   4. Yeniden kaplamadan sonraki 4. günde, hücrelerin birleştirilmiş monolayer olarak göründüğünden emin olmak için mikroskop altındaki 96 kuyulu mikro plaka üzerindeki ilişkisiz organoid kültürünü inceleyin.
   5. Tahlil Orta Hazırlanın (Tablo 1).
   6. Hücre hasarını önlemek için kuyunun dibine dokunmadan nöronal ortamı bir pipetle tüm kuyulardan çıkarın. Alternatif olarak, tüm plakayı dikkatlice ters çevirin ve ardından temiz kağıt üzerinde kurulayın. Hücre ölümünü önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
   7. Hücreleri önceden ısıtılan 200 μL Assay Medium ile iki kez yıkayın. Kuyu başına 180 μL'lik son hacme Assay Medium ekleyin. 96 kuyulu mikro plakayı 1 saat boyunca 37 °C'de _CO2 olmayan bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
   8. Tahlil ortamında mitokondriyal inhibitörlerin 10 μM çözeltilerini hazırlayın. Enjeksiyondan sonraki son konsantrasyonun 1 μM olduğunu unutmayın.
   9. Hidratlı mikro plakaya yerleştirilen sensör kartuşunu mitokondriyal inhibitörlerin 10x çözeltileriyle yükleyin.
      1. A portuna 18 μL mitokondriyal inhibitör 1 ekleyin.
      2. B portuna 19,8 μL mitokondriyal inhibitör 2 ekleyin.
      3. C portuna 21,6 μL mitokondriyal inhibitör 2 ekleyin.
      4. D portuna 23,4 μL mitokondriyal inhibitör 3 ekleyin.
   10. Yüklü kartuşu hidratlı mikro plakaya, test başlayana kadar 37 °C'de _CO2 olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
   11. Cihazın yazılımında çalışan bir protokol ayarlayın (Tablo 2).
   12. START tuşuna basın. Yüklü kartuşu _CO2 olmayan inkübatörden alın ve kalibrasyon için analizöre yerleştirin.
       NOT: Plakanın doğru yönde ve kapaksız olarak yerleştirildiğinden emin olun.
   13. Kalibrasyon adımı sona erdiğinde kalibrasyon plakasını çıkarın. 96 kuyulu mikro plakayı _CO2 olmayan inkübatörden alın ve analizöre yerleştirin. Ölçümleri başlatmak için DEVAM'a tıklayın.
   14. Çalışma bittiğinde, 96 kuyulu hücre kültürü mikro plakasını analizörden çıkarın ve hücreleri rahatsız etmeden ortamı tüm kuyulardan toplayın.
       NOT: Ortam -20 °C'de saklanabilir ve daha sonra uygun bir laktat tahlil kiti kullanılarak ortamdaki hücreler tarafından salınan laktat miktarını ölçmek için kullanılabilir.
   15. Hücreleri her kuyuda 200 μL 1x PBS ile yıkayın.
   16. PBS'yi çıkardıktan sonra plakayı -20 °C'de dondurun.
       NOT: Donmuş plaka, mikro plakanın her kuyusundaki hücreleri, proteinleri veya DNA'yı ölçmek için kullanılabilir. Elde edilen biyoenergetik oranları normalleştirmek için bu niceleme gerekli olacaktır. Hücre, protein veya DNA nicelleştirme tahlilleri için üreticinin yönergelerini izleyin.

Burada açıklanan protokol, yuvarlak organoidlerin sağlam bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır (Şekil 1A). Oluşturulan organoidler, aksonlara (SMI312) ve dendritlere (mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2)) özgü protein belirteçleri kullanılarak görselleştirilebilen olgun nöronlar içerir (Şekil 1B). Olgun organoidler sadece nöronal hücreler (MAP2-pozitif) değil, aynı zamanda glial hücreler (örneğin, astrosit belirteci S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100ß) için pozitif) içerir (Şekil 1B).

Konfokal mikroskopi kullanılarak dilimlenmiş beyin organoidlerinin analiz edilmesi ile farklı hücre tiplerinin ve hücresel yapıların ayrıntılı dağılımını ve organizasyonunun tanımlanması ve izlenmesi mümkündür. Bu, mitokondriyal hastalıkların sinir sistemi gelişimini nasıl etkileyebileceğine dair yeni bir fikir sağlayabilir. Örneğin, nöronal aksonları (SMI312-pozitif) ve dendritleri (MAP2-pozitif) (Şekil 2A) veya nöronal hücrelerin (MAP2-pozitif) ve glial hücrelerin (S100ß-pozitif) karşılıklı oluşumunu izlemek mümkündür (Şekil 2A). Konfokal görüntüler ayrıca nöronlara (beta-III tubulin (TUJ1)-pozitif) göre nöral progenitörlerin ((cinsiyet belirleyici bölge Y) kutu-2 (SOX2)-pozitif) dağılımını ve organizasyonunu daha ayrıntılı olarak araştırmaya yardımcı olabilir (Şekil 2B). Son olarak, beyin organoidleri mitokondriye özgü belirteçler için boyanabilir (dış mitokondriyal membran proteini, dış zarın translokaz 20 kDa alt birliği (TOM20)) (Şekil 2C).

Açıklanan protokol, araştırmacıların beyin organoidlerinin biyoenergetik profillerini gerçekleştirmelerini sağlar. Bu prosedürü kullanarak hem oksijen tüketim oranını (OCR) (Şekil 2D) kullanarak mitokondriyal metabolizmayı hem de hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) kullanarak glikolitik metabolizmayı ölçmek mümkündür (Şekil 2E). Biyoenergetik profilleme, hücrelerin mitokondriyal inhibitörlerin sıralı bir yönetimine yanıt olarak OCR ve ECAR profillerini nasıl değiştirebileceğini izlemeyi sağlar.

İlk olarak, ATP sintaz inhibitörü olan oligomisinin uygulanabilir. Oligomycin, OCR profilinde bir düşüşe neden olur (Şekil 2D)ve bu nedenle ATP üretimi için gereken OCR'yi tanımlar. Oligomycin tedavisi üzerine, ECAR'da telafi edici bir artış da olabilir (Şekil 2E), hücrelerin mitokondriyal metabolizmadaki azalmanın neden olduğu metabolik stresi önlemek için glikolizi yükseltebileceğini düşündürmektedir. Proton iyonoforesinin sonraki çift uygulaması olan karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), mitokondriyal membran potansiyelinin kaybına neden olur. Oksijen molekülleri artık hareket etmek için serbest olduğundan, bu OCR'de hızlı bir artışa neden olur (Şekil 2D).

OCR profilindeki bu değişiklikler hücrelerin maksimum solunum kapasitesini tanımlar. Rotenon artı antimisiyan A'nın son yönetimi elektron taşımacılığının bir bloğuna ve dolayısıyla OCR'de dik bir azalmaya neden olur (Şekil 2D). ECAR, hücrelerin artık glikolitik kapasitesine bağlı olarak FCCP ve rotenon artı antimycin A (Şekil 2E) ile tedaviden sonra dalgalanma gösterebilir. Mitokondriyal hastalardan elde edilen beyin organoidlerinde OCR ve ECAR profilleri önemli ölçüde değiştirilebilir.

Şekil 1: İnsan iPSC'lerinden beyin organoidlerinin üretilmesi. (A) İlgili iletim görüntülerine sahip beyin organoidleri üretmek için kullanılan protokolün şematik gösterimi. 0. Gün, bir ROCK inhibitörü, bir WNT inhibitörü ve SB431542 ile desteklenmiş CDMI kullanılarak V tabanlı 96 kuyulu bir plakada iPSC'lerin ve tohumlamanın ayrışmasına karşılık gelir. 18. günde, nörosferler 96 kuyu tabaklarından N2 ile desteklenmiş CDMII ile 100 mm hücre kültürü yemeklerine aktarılır. Bu noktadan sonra, kültürler bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde konumlandırılmıştır. 35. günde, ortam CDMII'den çözülmüş matris bileşeni de içeren CDMIII'ye geçer (Tablo 1). 70 günden itibaren CDMIII, B27 ile birlikte CDMIV'e geçilir. 12. günde 10x büyütmeli mikroskop kamerası kullanılarak temsili bir nörosfer görüntüsü çekildi. 22. günde 4x büyütmede mikroskop kamerası kullanılarak erken organoid bir görüntü çekildi. 40. günde 4x büyütmeli mikroskop kamerası kullanılarak olgun bir organoid görüntü çekildi. (B) Beyin organoidlerinin genel yapısı ve hücresel organizasyonu geniş alan mikroskopisi kullanılarak görselleştirilebilir. Dendritler (MAP2-pozitif) ve aksonlar (SMI312-pozitif) ile nöronal hücreler (MAP2-pozitif) ve tahmin edilen astrositler (S100ß-pozitif) arasındaki ilişkileri görselleştirmek için temsili dikişli geniş alan görüntüleri gösterilmiştir. Hücreler, çekirdekleri ortaya çıkarmak için Hoechst'e karşı konuldu. Tüm görüntüler 78 günlük beyin organoidleri kullanılarak çekildi. Sağ sütun üç kanalın kaplamasını gösterir (birleştirme). Ölçek çubukları = 500 μm. Kısaltmalar: iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre; CDM = Kortikal Farklılaşma Ortamı; ROCK = Rho kinaz; MAP2 = mikrotübül ilişkili protein 2; S100ß= S100 kalsiyum bağlayıcı protein B. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mitokondriyal hastalık modellemesi için beyin organoidlerinin görselleştirilmesi ve biyoenergetik profillenmesi. Konfokal mikroskopi kullanılarak organoidlerin detaylı organizasyonu ve mimarisi analiz edilebilir. Tüm görüntüler 78 günlük beyin organoidleri kullanılarak çekildi ve çekirdekleri ortaya çıkarmak için Hoechst ile karşı konuldu. Sağ sütun üç kanalın kaplamasını gösterir (birleştirme). Ölçek çubukları = 50 μm. (A) Dendritler (MAP2-pozitif, ok uçları) ve aksonlar (SMI312-pozitif, oklar) ve nöronal hücreler (MAP2-pozitif, ok uçları) ve varsayılan astrositler (S100ß pozitif, oklar) arasındaki etkileşimi ele alan temsili genişletilmiş odak projeksiyonları (44-48 optik düzlem, her biri 0,6 μm). (B) Nöronların (TUJ1 pozitif, ok uçları) sinir progenitörlerine (SOX2-pozitif, oklar) göre dağılımını gösteren temsili genişletilmiş odak projeksiyonları (her biri 14-31 optik düzlem, 0,6 μm). (C) Mitokondrilerin nöronları (TUJ1-pozitif, ok uçları) içindeki dağılımı gösteren temsili genişletilmiş odak projeksiyonları (her biri 20 optik düzlem, 0,6 μm) (dış mitokondriyal membran proteini TOM20, oklara karşı antikorlar kullanılarak görselleştirilmiştir). (D) Beyin organoidlerinin mitokondriyal solunumu, farklı mitokondriyal inhibitörlerin ardışık olarak verilmesinden sonra OCR profiline göre izlenebilir (ayrıntılar için metne bakın). (E) Mitokondriyal inhibitörlerin ardışık olarak verilmesi üzerine ECAR'a dayanarak beyin organoidlerinin glikolitik aktivitesi izlenebilir (ayrıntılar için metne bakın). Biyoenergetik profilleme için, yaklaşık 10-15 beyin organoidi, 96 kuyu mikro plakasına sıçramak için yeterli hücre elde etmek için ayrıştırıldı. Çubuklar, iki bağımsız deneyde elde edilen sonuçlara dayanarak SEM'leri gösterir. Kısaltmalar: MAP2 = mikrotübül ilişkili protein 2; S100ß = S100 kalsiyum bağlayıcı protein B; TUJ1 = beta-III tubulin; SOX2 = (cinsiyet belirleyici bölge Y) kutu-2; TOM20 = dış zarın translokazı 20 kDa alt birliği; OCR = oksijen tüketim oranı; ECAR = hücre dışı asitleşme oranı; Oligom. = oligomycin; FCCP = karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; R = rotenon; AntA = Antimycin A; SEM'ler = standart araç hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Organoid üretimi için kullanılan ortam ve çözümlerin ayrıntıları.

Tablo 2: Biyoenergetik profil oluşturma için protokol kurulumu. Seahorse Wave Desktop yazılımını kullanarak adımların ve dakika içinde uzunluklarının açıklaması. Kısaltmalar: FCCP = karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; Rot = rotenon; Anti A = Antimycin A.

Bu makale, insan iPSC türevi beyin organoidlerinin tekrarlanabilir neslini ve mitokondriyal hastalık modellemesi için kullanımlarını açıklamaktadır. Burada açıklanan protokol, önceden yayımlanmış bir ^çalışma20 temel alınarak değiştirilir. Mevcut protokolün en büyük avantajlarından biri, her organoidin bir iskele matrisine manuel olarak gömülmesini gerektirmemesidir. Aslında, matris çözeltisi hücre kültürü ortamına basitçe çözülür. Ayrıca, organoidler standart doku kültüründe kültürlendirilebildiğinden, inkübatörün içindeki bir orbital çalkalayıcıya yerleştirilmiş 6 kuyu plakaları pahalı biyoreaktörler çalıştırmaya gerek yoktur. Bu prosedür ayrıca, çeşitli bireysel çizgilerden elde edilen farklı organoidleri içeren çeşitli plakaların paralel olarak yetiştirilmesini sağlar, böylece deneylerin verimini artırır ve farklı organoidlerin büyüme profillerinde ortaya çıkan potansiyel farklılıkların izlenmesine izin verir. Bu protokolü, sağlıklı kontrollerden ve mitokondriyal hastalıklardan etkilenen bireylerden elde edilen farklı iPSC'leri tutarlı sonuçlarla test ettik.

Mitokondriyal hastalık modellemesi için, mitokondriyal ağın morfolojisini ve organizasyonuni görselleştirmek için farklı belirteçler kullanmak önemlidir. Bu prosedür, mitokondriyal hastalıkları olan hastalardan elde edilen beyin organoidlerinde mitokondriyal sayı, morfoloji veya dağılımın değiştirilip değiştirilmeyeceğinin araştırılmasını sağlar. Beyin organoidleri içindeki nöral progenitörlerin varlığı ve organizasyonu mitokondriyal bozuklukların modellanması için çok önemli olabilir. Yakın zamanda mitokondriyal hastalık olan Leigh sendromuna neden olan mutasyonların, hasta kaynaklı beyin organoidleri içindeki hücresel mimariyi ve sinirsel progenitör hücrelerin dağılımını bozduğunu ^keşfettik18.

Biyoenergetik profilleme yapmak için, pluripotent kök hücrelerin biyoenergetiklerini değerlendirmek için daha önce açıklanan bir yöntemi ^uyarladık21. Yakın tarihli bir protokolde fare ince bağırsağı, insan kolonu ve kolorektal tümörlerden elde edilen organoidlerin biyoenergetik profillemesinin nasıl ^{gerçekleştirilir22}. Bununla birlikte, bu organoidler beyin organoidlerine kıyasla oldukça küçüktür ve bu nedenle, beyin organoidleri için burada bildirilen gibi farklı bir protokole ihtiyaç vardır. Son zamanlarda şiddetli mitokondriyal hastalığa neden olan surfeit locus protein 1 geninde (SURF1) mutasyon taşıyan insan beyin organoidlerinin biyoenergetik profilini değerlendirmek için bu protokolü çalıştırdık, Leigh ^sendromu18. Bazal OCR seviyesinde, ATP üretim oranında ve maksimum solunum oranında önemli bir azalma ile gösterildiği gibi, OCR profilinin özellikle Leigh sendromu organoidlerinde etkilendiğini ^gördük18.

Sonuç olarak, burada insan beyin organoidlerinin sağlam üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve mitokondriyal hastalıkların altında kalan hastalık mekanizmalarının araştırılması için önemli olacak deneylerin nasıl yapılacağını açıklıyoruz. İnsan beyni organoidleri, insan beynindeki mitokondriyal çeşitliliği ve insan sağlığı ve hastalıklarındaki rolünün aydınlatılması için de kritik öneme sahip ^olabilir23. Burada açıklanan da dahil olmak üzere şu anda mevcut protokollerle oluşturulan beyin organoidlerinin hala sınırlamalar taşıdığını açıklığa kavuşturmak önemlidir. Bunlar, örneğin, damarlanma eksikliği ve mikroglia popülasyonunun ^{olmaması24'ü} içerir. Sonuçları doğru yorumlamak için bu hususların göz önünde bulundurulmalıdır.

Örneğin, vaskülat ve mikroglia eksikliği, in vivo olarak uygulanabilecek telafi edici mekanizmaları sınırlayabilir. Böylece hasta kaynaklı beyin organoidleri hastalarda gözlenenlerden daha güçlü kusurlar ^{gösterebilir17,18}. Ayrıca, bu protokolün genel bir tekrarlanabilirliğine ^rağmen20, çizgiden satıra heterojenlik gözlenebilir. Bu amaçla, hastalık modelleme çalışmaları yapılırken, morfoloji kalıplarını (boyut, tabaka) ve moleküler belirteçlerin farklı organoidler arasında dağılımını değerlendirerek kontrol ve hasta organoidlerinin homojenliğini sistematik olarak ölçmek her zaman önemlidir.

Son olarak, CRISPR/Cas9 ile büyük ölçekli genetik taramanın fizibilitesini sınırlayan tek bir iPSC'den beyin organoidleri üretmek mümkün değildir. Araştırmanın hızı göz önüne alındığında, burada açıklanan protokolün mevcut sınırlamalarından bazılarının yakında aşılması muhtemeldir. En iyi duruma getirilmiş protokoller kullanılabilir hale gelecektir. Mitokondriyal hastalıkların bu 3D modelleri, umarım zararlı olan mitokondriyal hastalıklar ve karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları olan tedavi edilemez hastalıklar için uygulanabilir tedavilerin nihai olarak keşfedilmesini sağlayacaktır.

Yazarlar rakip finansal veya finansal olmayan menfaatler beyan etmemektedir.

Teknik destek için Miriam Bünning'e teşekkür ederiz. Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark ve Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) (BH Doğrulama Fonları A.P.), Birleşik Mit'ten destek kabul ediyoruzOchondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) ve Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) (e: Bio genç araştırmacı A.P.'ye AZ 031L0211 verir). C.R.R. laboratuvarındaki çalışmalar DFG tarafından desteklendi (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).