דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף ^{החומרים1}. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)², הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או ^שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.

אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאליות הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את קורס המחלה ^{האנושית6}. כמה מהמודלים החייתיים הנחקרים כיום אינם מציגים את הפגמים הנוירולוגיים הקיימים ^{בחולים7}. לפיכך, המנגנונים שבביד הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות עדיין אינם מובנים במלואם.

מחקרים אחרונים יצרו IPSCs מחולים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות והשתמשו בתאים אלה כדי להשיג תאים עצביים ספציפיים לחולה. לדוגמה, פגמים גנטיים הקשורים למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, נמצאו כגורמים לסטיות בביו-אנרגטיקה ^תאית8,9, סינתזת ^{חלבונים10} וסידן הומאוסטזיס9,11. דיווחים אלה סיפקו רמזים מכניים חשובים על הליקוי העצבי המתרחש במחלות מיטוכונדריאליות, וסללו את הדרך לגילוי תרופות למחלות חשוכות מרפא ^אלה12.

תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), לעומת זאת, אינן מאפשרות לחקור את המורכבות האדריכלית והארגון האזורי של איברים ^{תלת-ממדיים13}. לשם כך, השימוש באורגנוידים מוחיים תלת-ממדיים הנגזרים מ- ^iPSCs14 ספציפי למטופל עשוי לאפשר לחוקרים להשיג מידע חשוב נוסף ובכך לעזור לנתח כיצד מחלות מיטוכונדריאליות משפיעות על התפתחותה ותפקודה של מערכת ^{העצבים15}. מחקרים המעסיקים אורגנוידים במוח שמקורם ב- IPSC כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות מתחילים לחשוף את המרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות.

אורגנוידים חוט השדרה נושא מוטציות הקשורות למחלה המיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית, ותסמונת פרקים דמויי שבץ (MELAS), הראו נוירוגנזה פגומה ובידול נוירון מוטורי ^מושהה16. אורגנוידים קליפת המוח נגזרים מחולים עם המחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, הראו גודל מופחת, פגמים ביצירת ניצני אפיתל עצביים, ואובדן ארכיטקטורה קליפת ^המוח17. אורגנוידים במוח מחולי תסמונת לי הראו כי פגמים המחלה ליזום ברמה של תאי אבות עצביים, אשר לא יכול להתחייב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי, גרימת הסתעפות עצבית חריגה ^{מורפוגנזה18}. לכן, אבות עצביים עשויים לייצג יעד טיפולי תאי למחלות מיטוכונדריאליות, ואסטרטגיות לקידום תפקודם המיטוכונדריאלי עשויות לתמוך בהתפתחות התפקודית של מערכת העצבים.

השימוש באורגנוידים במוח עשוי לעזור לחשוף את הרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. מחלות מיטוכונדריאליות נחשבות בעיקר ניוון עצבי ^מוקדם5. עם זאת, פגמים נוירו-התפתחותיים קיימים גם בחולים המושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, כולל עיכוב התפתחותי ופגיעה ^{קוגניטיבית19}. אורגנוידים מוחיים ספציפיים לחולה עשויים לעזור לטפל בהיבטים אלה ולפרט כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות המוח האנושי. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה יכול גם לשחק תפקיד פתוגנטי במחלות נוירולוגיות נפוצות יותר, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת ^{הנטינגטון4}. לפיכך, לפרט את ההשפעה של פגמים מיטוכונדריאליים נוירו-פיתוח באמצעות organoids המוח עשוי גם להיות אינסטרומנטלי לחקר מחלות אלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור שניתן להשתמש בהם לביצוע מודל מחלות של מחלות מיטוכונדריאליות.

הערה: השימוש ב- IPSCs אנושי עשוי לדרוש אישור אתי. iPSCs בשימוש במחקר זה נגזרו מאנשים בקרה בריאה לאחר אישור אתי מקומי (#2019-681). כל נהלי תרבית התא חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, בזהירות חיטוי כל ריאגנטים ומתכלים לפני המעבר מתחת למכסה המנוע. IPSCs אנושי המשמש לבידול צריך להיות מספר מעבר מתחת 50 כדי למנוע סטיות גנומיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש על תרבות נרחבת. המצב pluripotent של התאים צריך להיות מאומת לפני יצירת organoid, למשל, על ידי ניטור הביטוי של סמנים הקשורים pluripotency כגון NANOG או OCT4. בדיקות Mycoplasma צריכות להתבצע כל שבוע כדי להבטיח תרבויות ללא מיקופלסמה.

1. דור האורגנוידים במוח

1. תרבות של IPSCs אנושיים
   1. תרבות IPSCs אנושי בתנאים ללא הזנה במדיום iPSC (ראה את טבלת החומרים) על לוחות מצופים 6-באר ולשמור אותם בחממה תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% _CO2.
      הערה: נשיאת תאי מאכיל עלולה לעכב את ההבחנה האורגנוידת. מעבר התאים לפחות פעם אחת בתנאים ללא מאכילה.
   2. מעבר IPSCs ב 80% השפעה באמצעות מדיום ניתוק ללא אנזימים ביחסים הנעים בין 1:4 ל 1:12. כדי להגביר את הישרדות התאים, הוסיפו מעכב 10 מיקרומטרי קינאז חלבון הקשור לרו (ROCK) (Y27632) לאחר כל פיצול.
2. נתק את ה- IPSCs (80% השפעה)-יום 0.
   1. הכן בידול קליפת המוח בינוני I (CDMI) (טבלה 1). מדיום CDMI לפני המלחמה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (22 °F) לפני הוספתו לתאים.
   2. לשטוף את הבארות המכילות את iPSCs עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים ופסולת.
   3. הוסף 500 μL של ריאגנט A (טבלת חומרים) מחמם מראש לכל באר ודגר במשך 5 דקות ב 37 °C (7 °F). בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק תאים.
   4. הוסף 1 מ"ל של iPSC בינוני כדי לדלל reagent A כדי לנטרל את פעילותה.
   5. השתמש בצינור 1000 μL כדי לנתק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   6. צנטריפוגות בעדינות IPSCs ב 125 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F).
   7. בזהירות לשאוף supernatant כדי למנוע הפרעה גלולה התא.
   8. תגדיל מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של CDMI כדי להשיג השעיה של תא בודד, ולספור את מספר התא.
   9. הכן את מדיום הזריעה עם 9,000 iPSCs לכל 100 μL ב- CDMI בתוספת מעכב 20 מיקרומטר ROCK, מעכב WNT-קטנין 3 מיקרומטר (IWR1) ו 5 μM SB431542.
   10. הוסף 100 μL של מדיום זריעה לבאר לצלחת V-תחתון 96-well.
   11. שמור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% _CO2.
3. דור נוירוספירה
   1. ביום הראשון, שימו לב כי נוצרים אגרגטים של תאים עגולים (נוירוספירות) עם גבולות חלקים מוגדרים. שים לב לתאים המתים סביב האגרגטים. המשך לתרבות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% _CO2.
   2. ביום 3, להסעיר את הצלחת על ידי הקשה על הצדדים שלוש פעמים כדי לנתק תאים מתים.
   3. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 20 מעכב רוק μM, 3 μM IWR1, ו 5 μM SB431542 לכל באר.
   4. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
   5. ביום 6, בזהירות להסיר 80 μL של מדיום על טבעי מכל באר. הימנעו מלגעת בתחתית הבאר.
   6. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 3 μM IWR1 ו 5 μM SB431542 לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
   7. חזור על שלבים 5 ו- 6 כל 3 ימים עד יום 18.
4. העברת נוירוספרות
   1. ביום 18, הכן את בידול קליפת המוח בינוני II (CDMII) (טבלה 1) והוסף 10 מ"ל ללוח תרבית תאים אולטרה-נמוך בגודל 100 מ"מ.
   2. השתמש פיפטה 200 μL עם קצה מנותק כדי להעביר את הנוירוספרות העגולות מן צלחת 96-well ללוח תרבית תא מצורף 100 מ"מ אולטרה נמוך.
      הערה: להיות עדין כדי למנוע פגיעה בנוירוספירות על ידי מוודא את פתיחת הקצה רחב מספיק וכי האגרגטים אינם שואפים מהר מדי.
   3. הסר 5 מ"ל של בינוני מהצלחת המכילה את הנוירוספירות ולהוסיף 5 מ"ל של CDMII טרי.
      הערה: הליך זה מסייע להפחית את כמות מדיום CDMI שייתכן שנשאה מהעברת נוירוספירות.
   4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית ב-70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
      הערה: בדוק חזותית את הנוירוספירות למחרת. להגביר את המהירות של שייקר מסלולית אם הנוירוספירות מגושמות זו לזו או מחוברות לתחתית הלוח.
   5. כל 3 ימים, שאפו בזהירות את המדיום העל-טבעי והחליפו אותו ב-CDMII טרי. השאירו כמות קטנה של המדיום כדי למנוע מהנוירוספירות להתייבש.
   6. ביום 35, הכן בידול קליפת המוח בינוני III (CDMIII) (טבלה 1).
      הערה: יש להמיס את רכיב המטריצה ב- CDMIII קר.
   7. שאפו את המדיום מהצלחת והוסיפו 10 מ"ל של CDMIII קר.
      הערה: זה יעיל יותר להשתמש במדיום קר, כך רכיב המטריצה יכול לצפות את organoids מבלי ליצור גושים.
   8. לאחר שינוי המדיום, מניחים את הצלחת בחזרה על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 °C (5%) ו 5% _CO2.
   9. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים בהתאם לקצב הצמיחה, כפי שצוין על ידי צבע המדיום.
   10. ביום 70, הכן את ההבחנה הקליפתית בינונית IV (CDMIV) (טבלה 1). השתמש במדיום CDMIV עד להגעה לגיל הרצוי של organoids. במהלך תקופה זו, לשמור את הצלחת על שייקר מסלולית להגדיר ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח (37 °C (37 °C (5% _CO2).
   11. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים, בהתאם לקצב הצמיחה.

2. חיסונים של אורגנוידים במוח

1. הכנת רקמות
   1. הכן פתרון paraformaldehyde 4%, והנח אותו מתחת למכסה המנוע בטיחות.
      הערה: ללבוש ציוד בטיחות אישי בעת טיפול PFA.
   2. לאסוף organoids המוח ולהעביר אותם בעדינות עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל קהה לצלחת 6-באר מלא PFA.
      הערה: השתמש organoids מעל 40 ימים כדי לאפשר הדמיה של מבנים עם מורכבות תאית גבוהה יותר.
   3. שמור את האורגנוידים בתמיסת PFA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   4. הסר בזהירות את PFA עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל, ולשטוף את organoids קבוע שלוש פעמים באמצעות PBS.
   5. יש לאחסן את האורגנוידים הקבועים ב-4 °C ב- PBS עד לשימוש נוסף.
2. הכנת פרוסות אורגנויד במוח
   1. מכינים תמיסה של 3% אגר ומחממים לאט עד להנזלה.
   2. מניחים את התבנית (הקצה החתוך של מזרק 10 מ"ל) על פיסת נייר סינון סופג (צד חלק למעלה). מניחים עליו טיפת אגר.
   3. מוציאים במהירות אורגנואיד אחד מהצלחת בעלת 6 הבאר עם מרית ומסירים PBS מוגזמים עם נייר סינון.
      הערה: היזהר לא לגעת organoid ישירות עם נייר מסנן.
   4. מניחים את האורגנויד על טיפת אגר.
   5. חזור על הליך זה עם עד שלושה organoids.
      הערה: עבוד מהר כדי למנוע התגבשות של אגר במהלך שלב זה.
   6. ממלאים את התבנית באגר עד שכל האורגנוידים מכוסים במלואם.
   7. המתינו עד שהאגר יתחיל להתמצק, ולאחר מכן מעבירים בעדינות את כל התבנית המכילה את האורגנוידים, כולל נייר המסנן הסופג, לאלמנט קירור.
      הערה: אם אלמנט קירור אינו זמין, לאחסן את organoids במשך כמה דקות במקרר ב 4 °C (70 °F).
   8. בינתיים, היכונו להליך החתך: הניחו סכין גילוח (ניקה עם אצטון ונשטפו במים מזוקקים כפולים) לתוך מחזיק הוויברטום, הר על האמבטיה, ולמלא אותו עם PBS.
   9. מוציאים את התבנית מהאגר (המוצק) ומשתמשים באזמל כדי לקצץ אותו ליצירת קובייה.
   10. חברו את קוביית אגר המכילה את האורגנוידים על צלחת המוביל של הוויברטום עם ג'ל דבק (ראו טבלת החומרים), ומניחים אותה באמבטיה המכילה PBS.
   11. כוונן את הוויברטום (ראה טבלת החומרים) כדי לחתוך פרוסות בעובי של 150 מיקרומטר.
       הערה: הגדרות ויברטום (זווית נכונה, משרעת, תדירות ומהירות הלהב) עשויות להיות דומות לאלה המשמשות לחתוך רקמת מוח קבועה המופקת מבעלי חיים מוקדמים לאחר ההולכה. עם זאת, ההגדרות האידיאליות תלויות מאוד בסוג הוויברטום ויש לקבוע בצעד הראשון כדי למנוע עיוות או אפילו קריעת הרקמה בעת חיתוך.
   12. התחל את הליך החיתוך. השתמשו בפיפטה מזכוכית או במרית כדי להעביר בעדינות כל פרוסה חתוכה טרייה לצלחת 24-well מלאה ב-PBS.
   13. לאחסן את הצלחת המכילה פרוסות ב 4 °C (עד כמה ימים) עד עיבוד נוסף.
   14. מעבירים את הפרוסות מהצלחת עם פיפטה מזכוכית או מרית על מגלשות מיקרוסקופ. השתמש במינימום של 2 פרוסות לשקופית.
   15. הסר בזהירות את אגר ועודף PBS עם מזרק.
   16. אפשר לפרוסות להתייבש עד שהן נצמדות לשקופיות.
       הערה: בעוד שקופיות מיקרוסקופ ניתן לאחסן בתאי פלסטיק מלא PBS ב 4 °C (4 °F), הם צריכים להיות מוכתמים בהקדם האפשרי לאחר הליך חיתוך.
3. כתמים אימונוהיסטוכימיים
   1. הכן את פתרון החסימה (טבלה 1).
   2. השתמש בעט PAP כדי לצייר גבול הידרופובי סביב הפרוסות בשקופית כדי לעזור לשמור את כל הפתרונות בשקופיות.
   3. בזהירות להוסיף את פתרון חסימה על השקופית, ודגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F). כדי למנוע השמדת הרקמה, לא להוסיף את הפתרון ישירות על גבי הפרוסות.
   4. שאפו את פתרון החסימה והחלו את הנוגדן הראשי הרצוי מדולל בתמיסת החסימה.
   5. לדגור את השקופית לילה בחדר לח ב 4 °C (5 °F).
   6. יש לשטוף את השקופית שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת.
   7. לדגור את הפרוסות עם הנוגדן המשני הספציפי מדולל בתמיסת החסימה ולבצע הכתמת Hoechst (1:2,500) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: זכור לבצע פקדים שליליים כדי לאשר שאין איגוד לא ספציפי או פלואורסצנטיות אוטומטית.
   8. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת בחושך.
   9. מוסיפים טיפה אחת של מדיום הרכבה לפרוסה, מניחים כיסוי על קצה הטיפה, ומניחים לאט את הכיסוי כלפי מטה לכיוון הפרוסה כדי למנוע בועות אוויר.
   10. אפשר למגלשה לנוח לילה בטמפרטורת החדר. החל לק על גבול כיסוי כדי לאטום עוד יותר את השקופית. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב- 4 °C (70 °F).
4. תיעוד של כתמים
   1. כדי לסרוק תמונות גדולות לתפירה, השתמש במיקרוסקופ רחב-שדה ממונע המצויד (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים) במטרה באיכות גבוהה; ערכת מסנני DAPI (למשל, עירור (EX): 340-380 ננומטר, מראה דיכרואית (DM): 400 ננומטר, מסנן מחסום (BA): 435-485 ננומטר); ערכת מסננים פלואורסצין איזוטיוצינט (למשל, EX: 465-495 ננומטר, DM: 505 ננומטר, BA: 515-555 ננומטר); ערכת מסננים Alexa594 (למשל, ET 575/40; T 600 LPXR; ח"כ 623/24); מצלמה דיגיטלית; תוכנת רכישה בעלת ביצועים גבוהים המאפשרת תפרים אוטומטיים ופעולות מחסנית.
   2. לטיפול בתמונה, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור קבצי tif של 8 סיביות, לחתוך תפרים, להתאים ניגודיות ובהירות, למזג את הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום) והוספת סרגלי קנה מידה.
   3. כדי לסרוק פרטים, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ממונע המצויד במטרה באיכות גבוהה, לייזר UV (EX: 408 ננומטר), לייזר ארגון (EX: 488 ננומטר), לייזר הליום-ניאון (EX: 543), תוכנת הדמיה למיקרוסקופ קונפוקלי.
   4. לטיפול בתמונה בפרטים, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור תחזיות בעוצמה המרבית של ערימות z קונפוקליות (לדוגמה, מקטעים אופטיים של 0.6 מיקרומטר כל אחד), יצירת קבצי tif של 8 סיביות, התאמת ניגודיות ובהירות, מיזוג הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום), הוספת סרגלי קנה מידה.
   5. השתמש בעורך גרפי כדי לסדר את האיור.

3. פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח

1. הכנת אורגנוידים לפרופיל ביו-אנרגטי
   1. הכן את פתרון הפפאין וה- DNase בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   2. מעבירים 3-5 אורגנוידים לצלחת 6-באר. לשטוף אותם פעמיים עם PBS קדם-קדם.
   3. הוסף 2 מ"ל של פתרון פפאין פעיל מחמם מראש המכיל DNase. בעזרת להב, חותכים את האורגנוידים לחתיכות קטנות.
   4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית שנקבע ב-27 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית תאים (ב-37 °C (ב-37 °C(5%_CO2), ודגרה למשך 15-20 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי בשלב האורגנויד. אורגנוידים בשלב מוקדם יכולים לשמש כפי שהם. עבור organoids מעל 3 חודשים, מומלץ לחתוך את organoids לתוך 2-3 חתיכות לפני ניתוק ודגרה את החלקים במהירות נדנדה להגדיר על 27 סל"ד במשך 15-20 דקות ב 37 °C (75 °F). הליך זה יכול לעזור להסיר רקמה נמקית שעשויה להיות נוכחת באורגנוידים בשלב מאוחר יותר.
   5. לאסוף את הרקמות מעוכל לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של CDMIV בינוני תרבות organoid (טבלה 1).
   6. טריטוריאט את הרקמה עם פיפטה מפלסטיק 10 מ"ל על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-15 פעמים. תן לרקמה הלא מזוהה להתיישב לתחתית הצינור.
   7. בזהירות להעביר את השעיית התא לצינור 15 מ"ל, הימנעות כל חתיכות של רקמה לא מזוהה. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר (למשל, צינורות עגולים פוליסטירן עם כובעי מסננת התא).
   8. גלולה את התאים על ידי centrifuging ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. להעריך את מספר התא ואת האיכות באמצעות כחול טריפן.
   10. צלחת את המספר הרצוי (~ 20,000 / טוב) של תאים על מצופה 96-היטב מיקרו-לוחות. שנה את הבינוני 6-8 שעות לאחר ציפוי למדיום עצבי (טבלה 1).
   11. לדגור על המיקרו-לוח מצופה 96-well באינקובטור _CO2 (37 °C(37 °C, 5% _CO2) למשך 4 ימים.
2. פרופיל ביו-אנרגטי
   1. ביום 3 לאחר שתשובו לתאים המנותקים, הוסיפו 200 מיקרו-אל של פתרון כיול לכל באר בחלק התחתון של המיקרו-לוח בן 96 הבארות, והנחו את מחסנית החיישן הירוק העליון על המיקרו-לוח hydrated.
      הערה: הנח את מחסנית החיישן על גבי המיקרו-לוח בכיוון הנכון, וודא שפתרון הכיול מכסה את כל החיישנים.
   2. לדגור על מיקרו-לוחית 96-באר hydrated באינקובטור שאינו _CO2 ב 37 °C (50 °F) לילה.
   3. הפעל את המנתח כדי לאפשר למכשיר להתייצב ב 37 °C (50 °F) לילה.
   4. ביום 4 לאחר ההשתלה, בדוק את התרבות האורגנויד מנותק על 96-well microplate מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי התאים מופיעים כמו monolayer confluent.
   5. הכן את אסאי מדיום (טבלה 1).
   6. הסר בינוני עצבי מכל בארות עם pipette מבלי לגעת בתחתית הבאר כדי למנוע נזק לתא. לחלופין, בזהירות הפוך את כל הצלחת ולאחר מכן לייבש אותו על נייר נקי. עבוד במהירות כדי למנוע מוות בתא.
   7. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL 200 μL של אסאי מדיום. הוסף את מדיום אסאי לנפח סופי של 180 μL לבאר. לדגור על 96-היטב microplate בחממה שאינה _CO2 ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה.
   8. הכן 10 פתרונות μM של מעכבי מיטוכונדריאליים במדיום אסאי. שים לב כי הריכוז הסופי לאחר הזרקה הוא 1 μM.
   9. טען את מחסנית החיישן המוצבת במיקרו-לוח hydrated עם פתרונות פי 10 של מעכבי המיטוכונדריה.
      1. הוסף 18 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 1 לתוך יציאה A.
      2. הוסף 19.8 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה B.
      3. הוסף 21.6 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה C.
      4. הוסף 23.4 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 3 לתוך יציאה D.
   10. מניחים את המחסנית הטעון במיקרו-לוח hydrated בחממה שאינה _CO2 ב 37 °C (7 °F) עד תחילת ההסתה.
   11. הגדר פרוטוקול פועל בתוכנת המכשיר (טבלה 2).
   12. לחץ על התחל. קח את המחסנית הטעונה מהחממה שאינה _CO2 והנח אותה במנתח לכיול.
       הערה: ודאו שהצלחת מוכנסת לכיוון הנכון וללא המכסה.
   13. לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוח הכיול. קח את המיקרו-לוחית 96-well מהחממה שאינה _CO2 והכנס אותו למנתח. לחץ על CONTINUE כדי להתחיל את המדידות.
   14. כאשר הריצה מסתיימת, להסיר את 96-היטב תרבית התא microplate מן המנתח ולאסוף את המדיום מכל בארות מבלי להפריע לתאים.
       הערה: המדיום יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (20 °F) ולהשתמש מאוחר יותר למדידת כמות הלקטאט ששוחררו על ידי התאים במדיום באמצעות ערכת בדיקות לקטט מתאימה.
   15. לשטוף את התאים עם 200 μL של 1x PBS בכל באר.
   16. לאחר הסרת PBS, להקפיא את הצלחת ב -20 °C (50 °F).
       הערה: ניתן להשתמש בלוח הקפוא כדי לכמת תאים, חלבונים או DNA בכל באר של המיקרו-פלט. כימות זה יהיה צורך לנרמל את שיעורי הביו-אנרגטית המתקבלים. בצע את הוראות היצרן לבדיקות כימות תאים, חלבונים או דנ"א.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור החזק של organoids עגול (איור 1A). האורגנוידים שנוצרו מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים (SMI312) ודנדריטים (חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2)) (איור 1B). אורגנוידים בוגרים מכילים לא רק תאים עצביים (MAP2-חיובי) אלא גם תאי גליה (למשל, חיוביים עבור סמן האסטרוציטים S100 חלבון מחייב סידן B (S100ß)) (איור 1B).

על ידי ניתוח אורגנוידים במוח פרוס באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לזהות ולנטר את ההפצה והארגון המפורטים של סוגי תאים שונים ומבנים תאיים. זה יכול לספק תובנה חדשה כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות מערכת העצבים. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר אקסונים עצביים (SMI312-חיובי) ודנדריטים (MAP2-חיובי) (איור 2A) או על המופע ההדדי של תאים עצביים (MAP2-חיובי) ותאי גליה (S100ß-חיובי) (איור 2A). תמונות קונפוקליות עשויות גם לסייע לחקור בפירוט רב יותר את ההפצה והארגון של אבות עצביים ((אזור קביעת מין Y) תיבה-2 (SOX2)-חיובי) ביחס לנוירונים (בטא-III טובולין (TUJ1)-חיובי) (איור 2B). לבסוף, אורגנוידים במוח יכולים להיות מוכתמים עבור סמנים ספציפיים למיטוכונדריה (כגון חלבון הממברנה המיטוכונדריאלית החיצוני, טרנסלוקאז של הממברנה החיצונית 20 kDa subunit (TOM20)) (איור 2C).

הפרוטוקול המתואר מאפשר לחוקרים לבצע פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח. באמצעות הליך זה, ניתן למדוד הן את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי באמצעות קצב צריכת החמצן (OCR ) (איור 2D) והן את חילוף החומרים הגליקוליטי באמצעות קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) (איור 2E). פרופיל ביו-אנרגטי מאפשר ניטור האופן שבו תאים עשויים לשנות את פרופילי זיהוי האופטי (OCR) וה-ECAR שלהם בתגובה לניהול רציף של מעכבי מיטוכונדריאליים.

ראשית, מעכב סינתאז ATP, אוליגומיצין, ניתן ליישם. אוליגומיצין גורם לירידה בפרופיל זיהוי האופטי (איור 2D), ולכן מזהה את זיהוי האופטי (OCR) הדרוש לייצור ATP. עם טיפול אוליגומיצין, ייתכן גם עלייה מפצה ECAR (איור 2E), מציע כי התאים יכולים upregulate גליקוליזה כדי למנוע את הלחץ המטבולי שנגרם על ידי הירידה בחילוף החומרים המיטוכונדריאלי. היישום הכפול הבא של פרוטון ינופור, קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורומיתוקסיפניל הידרזון (FCCP), גורם לאובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. מכיוון שמולקולות החמצן חופשיות כעת לנוע, הדבר גורם לעלייה מהירה ב-OCR (איור 2D)..

שינויים אלה בפרופיל זיהוי האון או-פי -או-זיהו את יכולת ההחלמה המקסימלית של התאים. הניהול הסופי של רוטנון פלוס אנטימצין A גורם לבלוק של הובלת האלקטרונים, ולכן, ירידה תלולה ב- OCR (איור 2D). ECAR עשוי להראות תנודות לאחר הטיפול עם FCCP ורוטנון בתוספת אנטימיצין A (איור 2E), בהתאם לקיבולת הגליקוליטית השיורית של התאים. פרופילי זיהוי OCR ו- ECAR עשויים להשתנות באופן דרמטי באורגנוידים במוח הנגזרים מחולים מיטוכונדריאליים.

איור 1: יצירת אורגנוידים במוח מ- IPSCs אנושיים. (A) ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המשמש לייצור אורגנוידים במוח עם תמונות שידור מתאימות. יום 0 מתאים לניתוק של IPSCs וזריעה בצלחת 96-well עם V-bottom באמצעות CDMI בתוספת מעכב ROCK, מעכב WNT, ו SB431542. ביום 18, נוירוספירות מועברות מצלחות 96-באר כדי 100 מ"מ מנות תרבית התא עם CDMII בתוספת N2. מנקודה זו ואילך, התרבויות ממוקמות על שייקר מסלולית. ביום 35, המדיום עובר מ- CDMII ל- CDMIII, המכיל גם רכיב מטריצה מומס (טבלה 1). מהיום ה-70 ואילך, CDMIII עובר ל- CDMIV בתוספת B27. תמונה נוירוספרית מייצגת צולמה ביום ה-12 באמצעות מצלמת מיקרוסקופ עם הגדלה של פי 10. תמונה אורגנויד מוקדמת צולמה ביום 22 באמצעות מצלמת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4. תמונה אורגנויד בוגרת צולמה ביום 40 באמצעות מצלמת מיקרוסקופ עם הגדלה פי 4. (B) ניתן לדמיין את המבנה הכללי ואת הארגון התאי של אורגנוידים במוח באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה. תמונות שדה רחב תפורות מייצגות מוצגות כדי לדמיין את הקשרים בין דנדריטים (MAP2-חיובי) ואקסונים (SMI312-חיובי), ובין תאים עצביים (MAP2-חיובי) ואסטרוציטים משוערים (S100ß-חיובי). התאים היו מוכתמים עם הוהצ'סט כדי לחשוף את הגרעינים. כל התמונות צולמו באמצעות אורגנוידים במוח בני 78 יום. העמודה השמאלית מציגה את שכבת העל של שלושה ערוצים (מיזוג). סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: iPSC = תאי גזע פלוריפוטנטים מושרים; CDM = מדיום בידול קליפת המוח; רוק = רו קינאז; MAP2 = חלבון הקשור למיקרוטובול 2; S100ß= S100 חלבון מחייב סידן B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הדמיה ופרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הארגון המפורט והארכיטקטורה של organoids ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כל התמונות צולמו באמצעות אורגנוידים במוח בני 78 יום, והותקמו עם הוצ'סט כדי לחשוף את הגרעינים. העמודה השמאלית מציגה את שכבת העל של שלושה ערוצים (מיזוג). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (A) תחזיות מיקוד מורחב מייצג (44-48 מישורים אופטיים, 0.6 מיקרומטר כל אחד) המתייחסות ליחסי הגומלין בין דנדריטים (MAP2-חיובי, ראשי חץ) ואקסונים (SMI312-חיובי, חצים), ובין תאים עצביים (MAP2-חיובי, ראשי חץ) ואסטרוציטים משוערים (S100ß-חיובי, חצים). (ב) תחזיות מיקוד מורחב מייצג (14-31 מישורים אופטיים, 0.6 מיקרומטר כל אחד) המציגות את התפלגות הנוירונים (TUJ1-חיובי, ראשי חץ) ביחס לאבות עצביים (SOX2-חיובי, חצים). (C) תחזיות ממוקדות מייצגות (20 מישורים אופטיים, 0.6 מיקרומטר כל אחד) המציגות את ההתפלגות בתוך נוירונים (TUJ1-חיובי, ראשי חץ) של המיטוכונדריה (הדמיה באמצעות נוגדנים נגד חלבון הממברנה המיטוכונדריאלית החיצוני TOM20, חצים). (ד) נשימה מיטוכונדריאלית של organoids המוח ניתן לפקח על סמך הפרופיל של OCR לאחר ניהול רציף של מעכבי מיטוכונדריאלי שונים (ראה טקסט לפרטים). (ה) פעילות גליקוליטית של אורגנוידים במוח ניתן לפקח על בסיס ECAR על ניהול רציף של מעכבי מיטוכונדריאלי (ראה טקסט לפרטים). עבור פרופיל ביו-אנרגטי, כ 10-15 organoids המוח היו מנותקים כדי להשיג מספיק תאים לתשובה על 96-היטב microplate. הסורגים מציינים את ה- SEMs בהתבסס על התוצאות שהושגו בשני ניסויים עצמאיים. קיצורים: MAP2 = חלבון הקשור למיקרוטובול 2; S100ß = S100 חלבון מחייב סידן B; TUJ1 = בטא-III טובולין; SOX2 = (אזור קביעת מין Y) תיבה-2; TOM20 = translocase של הממברנה החיצונית 20 kDa subunit; OCR = קצב צריכת חמצן; ECAR = שיעור החמצה חוץ תאית; אוליגום. = אוליגומיצין; FCCP = קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורומיתוקסיפניל הידרזון; R = רוטנון; נמלה = אנטימיצין A; SEMs = שגיאה סטנדרטית של אמצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרטי מדיה ופתרונות המשמשים ליצירת אורגנוידים.

טבלה 2: הגדרת פרוטוקול עבור פרופיל ביו-אנרגטי. תיאור השלבים ואורךם תוך דקות באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave של סוסון הים. קיצורים: FCCP = קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורום-אוקסיפניל הידרודרזון; רוטה = רוטנון; אנטי A = אנטימיצין A.

מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה ^בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומים. למעשה, פתרון המטריצה פשוט מומס למדיום תרבית התא. יתר על כן, אין צורך להעסיק bioreactors יקר, כמו organoids ניתן תרבית בתרבות רקמות סטנדרטית 6-היטב לוחות ממוקם על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הליך זה מאפשר גם טיפוח מקביל של מספר לוחות המכילים organoids שונים הנגזרים מקווים בודדים שונים, ובכך להגדיל את התפוקה של הניסויים ולאפשר ניטור של הבדלים פוטנציאליים המתעוררים בפרופילי הצמיחה של organoids שונים. בדקנו פרוטוקול זה באמצעות IPSCs שונים המופקים מבקרות בריאות ואנשים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, עם תוצאות עקביות.

עבור מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות, חיוני להשתמש בסמנים שונים כדי לדמיין את המורפולוגיה והארגון של הרשת המיטוכונדריאלית. הליך זה מאפשר לחקור אם מספר מיטוכונדריאלי, מורפולוגיה או הפצה עשויים להשתנות באורגנוידים במוח הנגזרים מחולים עם מחלות מיטוכונדריאליות. נוכחות וארגון של אבות עצביים בתוך organoids המוח יכול להיות בעל חשיבות מכרעת עבור מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. לאחרונה גילינו כי מוטציות הגורמות למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, משבשות את הארכיטקטורה התאית ואת ההפצה של תאי אבות עצביים בתוך organoids המוח נגזר ^{המטופל18}.

לביצוע פרופיל ביו-אנרגטי, התאמנו שיטה שתוארה בעבר להערכת הביו-אנרגטיקה של תאי גזע ^{פלוריפוטנטיים21}. פרוטוקול שנערך לאחרונה תיאר כיצד לבצע פרופיל ביו-אנרגטי של organoids נגזר המעי הדק של העכבר, המעי הגס האנושי, וגידולים המעי ^הגס22. עם זאת, אורגנוידים אלה הם די קטנים בהשוואה organoids המוח, ולכן, פרוטוקול אחר, כגון זה שדווח כאן, נדרש עבור organoids המוח. לאחרונה השתמשנו בפרוטוקול זה להערכת הפרופיל הביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח האדם הנושאים מוטציות בגן חלבון לוקוס 1 (SURF1) הגורם למחלה המיטוכונדריאלית החמורה, תסמונת ^לי18. מצאנו כי פרופיל זיהוי האופטי הושפע במיוחד באורגנוידים של תסמונת לי, כפי שמוצג על ידי ירידה משמעותית ברמת זיהוי האו-פלילי של הבזל, קצב ייצור ה- ATP ושיעור הנשימה ^{המקסימלי18}.

לסיכום, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים במוח האנושי ומתארים כיצד לבצע ניסויים שיהיו חשובים לחקר מנגנוני המחלה שבביד מחלות מיטוכונדריאליות. אורגנוידים במוח האדם עשויים גם להיות בעלי חשיבות קריטית להבהרת המגוון המיטוכונדריאלי במוח האנושי ותפקידה בבריאות האדם ^{ובמחלות23}. חשוב להבהיר כי אורגנוידים במוח שנוצרים עם פרוטוקולים זמינים כרגע, כולל אחד המתואר כאן, עדיין לשאת מגבלות. אלה כוללים, למשל, את חוסר כלי דם והיעדר אוכלוסיית ^{מיקרוגליה24}. היבטים אלה צריכים להילקח בחשבון כדי לפרש את התוצאות כראוי.

לדוגמה, חוסר כלי הדם ומיקרוגליה יכול להגביל מנגנוני פיצוי שעשויים להיות במקום vivo. אורגנוידים במוח שמקורם בחולה עשויים אפוא להפגין פגמים חזקים יותר מאלה שנצפו ^{בחולים17,18}. יתר על כן, למרות שחזור כללי של פרוטוקול ^זה20, הטרוגניות מיישר לקו ניתן לראות. לכך, בעת ביצוע מחקרי מידול מחלות, תמיד חשוב לכמת באופן שיטתי את אחידות השליטה ואורגנוידים המטופל על ידי הערכת דפוסי המורפולוגיה (גודל, שכבה) והפצה של סמנים מולקולריים על פני organoids שונים.

לבסוף, לא ניתן ליצור אורגנוידים במוח מ- iPSC יחיד, המגבילים את ההיתכנות של הקרנה גנטית בקנה מידה גדול עם CRISPR/ Cas9. בהתחשב בקצב המחקר, סביר להניח כי חלק מהמגבלות הנוכחיות של הפרוטוקול המתואר כאן יוכרעו בקרוב. פרוטוקולים ממוטבים יהפכו לזמינים. מודלים תלת-ממדיים אלה של מחלות מיטוכונדריאליות יאפשרו בסופו של דבר גילוי של טיפולים הניתנים ליישום למחלות מיטוכונדריאליות, שהן מזיקות, ולמחלות חשוכות מרפא עם צרכים רפואיים מאוד לא ממומשים.

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים מתחרים.

אנו מודים למרים בנינג על התמיכה הטכנית. אנו מכירים בתמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ל- A.P.), ספארק ומכון הבריאות של ברלין (BIH) (קרנות אימות BIH ל- A.P.), הקרן המאוחדת למחלות מיטוכונדריאליות (UMDF) (מענק הקונסורציום הבינלאומי של תסמונת לי ל- A.P.), דיסלדורף של בית החולים האוניברסיטאי (Forschungskommission UKD ל- A.P.), ומשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (ה: ביו חוקר צעיר להעניק AZ 031L0211 לא.פ.). העבודה במעבדה של C.R.R. נתמכה על ידי DFG (עבור 2795 "סינפסות תחת לחץ", Ro 2327/13-1).