Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

Çalışma, sentetik gen parçalarından protein tarama kampanyaları için klonlama yapmadan veya canlı hücreler kullanmadan büyük (μg-mg) miktarlarda DNA oluşturmak için bir protokol tanımlamaktadır. Minimal şablon enzimmatik olarak sindirilir ve daireselleştirilir ve daha sonra izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılarak yükseltilir. Hücresiz ifade reaksiyonları, teşvik edilmemiş ürünle gerçekleştirilebilir.

Bu protokol, hücre içermeyen ifade kullanılarak 24 saatten daha kısa bir sürede tahlil edilebilir proteinlerin hızlı bir şekilde prototiplenmesini sağlayan minimal bir DNA şablonunun tasarımını ve enzymatic amplifikasyon adımlarını açıklar. Bir satıcıdan DNA aldıktan sonra, gen parçası PCR ile yükseltilir, kesilir, daireselleştirilir ve kriyo-bankalıdır. Daha sonra bankalanmış DNA'nın küçük bir kısmı seyreltilir ve izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu (RCA) kullanılarak önemli ölçüde^{(10 6}x'e kadar) yükseltilir. RCA, başlangıç malzemesinin pikogram seviyelerinden minimum ifade şablonunun mikrogram miktarlarını verebilir (tüm başlangıç sentetik parçası kullanılıyorsa mg seviyeleri). Bu çalışmada, 20 pg'lik bir başlangıç miktarı, nihai ürünün 4 μg'sına neden oldu. Elde edilen RCA ürünü (minimal şablonun concatemer'ı) saflaştırma adımları olmadan doğrudan hücresiz reaksiyona eklenebilir. Bu yöntemin tamamen PCR tabanlı olması nedeniyle, otomatik sıvı taşıma sistemleri ile birleştiğinde gelecekteki yüksek verimli tarama çabalarını mümkün kılabilir.

Hücresiz gen ekspresyolü (CFE) birçok uygulama ile güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu tür uygulamalar hastalık tespiti¹,^2,3,4^,5,^6,mikro besin ve küçük molekül tespiti^7,8^,9,10,11,^12,biyo-üretim¹³,^{14,15,16,17 içerir ,18}, eğitim^19,20,21, zor protein üretimi^{17,22,23,24,25,26,27}ve varyant taraması^{23,28,29,30,31,32 ,33}. Bunun nedeni, hücresiz sistemlerin açık doğası ve verdikleri esnekliktir. Birçok büyük inceleme^makalesi,34 ,^{35 , 36 , 37},^38,39,40,41,42^,43^,44teknolojisinde tarihsel eğitim ve^geleceğebakış açıları^sunar.

Tipik bir hücresiz reaksiyon üç ana bileşenden oluşur: hücre özü, enerji karışımı ve genetik şablon. Aktif hücre özü transkripsiyon ve çeviri (TXTL) için gerekli tüm makineleri içerir ve çeşitli şekillerde işlenebilir³⁶. Enerji karışımındaki glikolitik ara ürünler, elektrolitler, amino asitler ve kofaktörler TXTL sürecini destekler. Hücresiz deneylerde önemli bir değişkenlik kaynağıdır⁴⁵ ve birçok şekilde hazırlanabilir^34,46. Genetik şablonun hazırlanması, geleneksel klonlama yöntemlerinin mükemmel ifade özelliklerine sahip plazmidlerle sonuçlanmasından bu yana daha az iyileşme görmüştür. Bu geleneksel yöntemlerin dezavantajı, bunları inşa etmek ve yaymak için gereken geri dönüş süresi ve biyolojik uzmanlık miktarıdır. Son optimizasyon çabaları, hücre özü hazırlama 47 ,⁴⁸için enerji karışımı hazırlama^{49 ,50}ile paralel olarak gerçekleştirilebilecek basit²⁴saatlik iş akışları ile sonuçlandı. Ancak, geleneksel klonlama CFE prototipleme zaman çizelgesine birden fazla gün ekler (Tablo 1)²³. Ticari gen parçasından hızlı bir şekilde güçlendirilmiş PCR ürünleri doğrudan^{kullanılabilir 51}, ancak bu, yaklaşık beş reaksiyona (geleneksel 15 μL hacim) karşılık gelen sadece 1 μg DNA üretildiği için prototipleme deneylerinin sayısını sınırlar. Bu ek daireselleştirme ve izotermal amplifikasyon adımları ile DNA'nın miligramdan fazla miktarı mümkündür (1 mg için ~ 5.000 reaksiyon). Bu, proteinlerin veya kombinatoryal enzim ağlarının (hücresiz metabolik mühendislik) yüksek verimli taramada yapılabilecek test sayısını önemli ölçüde artırır; ayrıca doğrusal şablon kütüphanesinin yüksek konsantrasyonda DNA olarak etkili bir şekilde korunmasını sağlar. Ayrıca, malzeme bilimi uygulamaları (protein bazlı lifler ve hidrojeller) için gereken daha büyük miktarlarda proteinin prototipini yapmak için daha fazla miktarda şablon gerekli olacaktır. Doğrusal şablonların bazı sınırlamaları BL21 DE3 Star'dan bir ekstrakt kullanarak veya doğrusal şablonları bozulma^{52 , 53,54'ten}korumak için yakın zamanda keşfedilen yöntemler kullanılarak aşılabilir. Bununla birlikte, bu, PCR amplifikasyonu için sınırlı miktarda satıcı tarafından üretilen DNA stokuna veya klonlama için gerekli biyolojik uzmanlık ve ekipman konusuna sahip olmayı ele almaz.

Bu çalışma, satıcı tarafından üretilen küçük miktarlardaki gen parçalarından (tipik olarak 500-1000 ng liyofilize toz) elde edilebilen ifade şablonu miktarını artırmak için açıkça tasarlanmış bir protokol sunar. Açıklanan yöntem, plazmidlerde geleneksel klonlama yapmak veya canlı hücrelerde dönüştürmek ve yaymak için gerekli becerileri gerektirmez. Postada bir gen parçası aldıktan sonra, bir kullanıcı izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu (RCA) (Şekil 1)²³kullanarak birçok hücresiz reaksiyon için yeterli şablon üretebilir. Satıcıdan alınan DNA miktarı sınırlı tarama çabaları için yeterli olsa da, hızla tükeniyor ve gen parçalarının yeniden satın alınması zaman alıcı ve maliyetli. Yöntem ayrıca özellikle E. coli'detoksik ve klonlamaları zor genler için çok uygundur.

1. Gen parçasının tasarlanması

NOT: Gen parçası, promotör, ribozom bağlama bölgesi (RBS), start codon, ilgi geni ve sonlandırıcı dahil olmak üzere transkripsiyon / çeviri için gerekli tüm genetik unsurlara sahip olmalıdır. Sonlandırıcı doğrusal ifade şablonu (LET) için gerekli olmasa da, kullanıcının sırayı bir plazmid içine eklemeye karar vermesi önemli olacaktır. Bu diziler, T7 organizatörü kullanan pJL1-sfGFP plasmid^55'ten (Michael Jewett'in laboratuvarından hediye) kaldırıldı. Bu gerekli genetik elementlere ek olarak, bir kısıtlama enzimi kesme bölgesi, promotörden önce altı baz çifti (5' kesim bölgesi) ve terminatörden (3' kesim bölgesi) sonra altı baz çifti daha eklenir, bu durumda HindIII (diğer kısıtlama enzimleri kullanılabilir, ancak kütüphanede tutmak için gereken sayıyı azaltmak için dizileri bir yüksek doğruluk kısıtlama enzimi ile standartlaştırmak yararlıdır). Astar sahaları, 5' kesim bölgesinin yukarısına on baz çifti ve 3' kesim bölgesinin aşağı doğru on baz çifti eklenir, bu durumda standart M13 astar dizileri (astarlar ucuz stok öğeleridir). Kullanılan kısıtlama enzim bölgesi ve astarlar kullanıcının takdirine bağlıdır. Ancak, kullanıcı sıraların şablonda başka bir yerde bulunmadığından emin olmalıdır (istenmeyen kesimler veya amplifikasyon başlatma siteleri oluşturmak istemiyorsunuz). Bu çalışmada kullanılan şablonların sıraları ek malzemede ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu adımlar, bu temel şablondan değiştirmek için kullanılır.

1. İfade edilecek istenen geni belirleyin ve E. coliile ifade edilmişse amino asit dizisini veya genetik diziyi elde edin.
2. Bir amino asit dizisi ise, birçok standart satıcı araçlarından birini kullanarak E. coli için kodon optimizasyonu gerçekleştirin⁵⁶. Ekte sağlanan şablonu kullanıyorsanız, en iyi duruma getirilmiş sıranın HindIII kısıtlama sitelerinin (AAGCTT) olmadığından emin olun. Olması durumunda, artık bir HindIII sitesi olmayana kadar sırayı optimize etmeye devam edin.
3. Sırayı kopyalayın ve ilgi geninin belirtildiği Ek Sıra No 1 için sağlanan şablona yapıştırın. sfGFP'yi ifade ediyorsanız, olduğu gibi Tamamlayıcı Sıra No 1'i kullanın. Altyazıyı ifade ediyorsanız, olduğu gibi Tamamlayıcı Sıra No 2 kullanın.
4. Tercih edilen DNA sentez hizmetinden minimum şablonu ve gerekli astarları sipariş edin.

2. Gen parçasını ve astarları yeniden canlandırma

NOT: Gen parçası alındıktan sonra, üreticinin yeniden canlandırma protokollerini izleyin veya dna stoğu oluşturmak için bu basit kılavuzu kullanın.

1. Alttaki DNA peletini toplamak için tüpü (5 s için 300 x g) santrifüjlayın.
2. 10 ng/μL DNA şablonunun son konsantrasyonu için çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin.
3. Çözümü 5-10 sn için orta bir ayarda vorteks edin.
4. 20 dakika boyunca 50 °C'de inkübe ederek tüm peletin çözün.
5. Kısaca tekrar girdap
6. Çözeltiyi tüpün dibinde toplamak için 5 s için 300 x g'da santrifüj.
7. -20 °C'de saklayın veya PCR'de kullanın.
8. Astarları çekirdeksiz suda yeniden depolayarak 100 μM astar stoğu hazırlayın. Eklenecek su miktarını belirlemek için, lyophilized astarın nanomol sayısını 10 ile çarpın. Örneğin, tüp 45 nM lyophilized astar içeriyorsa, çözeltiyi 450 μL ddH₂O ve girdap ekleyin.
9. Astar stok çözümlerini -20 °C'de saklayın veya amplifikasyonu gerçekleştirmeye devam edin.

3. Gen parçasının PCR ile amplifikasyon

NOT: İlgi çekici gen için hangi PCR kitinin doğru olduğuna karar verin. Daha küçük genler (<1.000 kb) daha ucuz bir Taq polimeraz için daha uygun olabilirken, daha büyük genler (≥1.000 kb) hataları azaltmak için yüksek doğrulukta polimerazdan yararlanabilir. Kullanıcı ilk gen parçasını korumakla ilgilenmiyorsa bu ilk PCR amplifikasyonunun gerekli olmadığını belirtmek önemlidir (Döngüselleştirme için birden fazla deneme sağlar ve LET ve RCA ürününün karşılaştırmalı çalışmalarına izin verir). Bu PCR güçlendirilmiş LET'in doğrudan reaksiyonlarda kullanılabileceğini de belirtmek önemlidir; ancak, girişte belirtildiği gibi, yalnızca daha fazla amplifikasyon adımı göz ardı edilirse sınırlı sayıda reaksiyona izin verecektir. Sindirim ve ligasyon doğrudan⁵⁷ resüspended gen parçası üzerinde yapılabilir (eğer biri kesin ise, ek döngüselleştirme stokları gerçekleştirmek için daha fazla LET gerekmez). Bu durumda, bölüm 3'ü atlayın ve bölüm 4'e devam edin. PCR gerçekleştirmek için şu adımları izleyin.

1. 10 μM çalışma çözümleri oluşturmak için adım 2.8'den 100 μM stokları kullanın. Birçok PCR kit protokolü, astarların 10 μM çözümlerini gerektirir.
2. Termal çevrimciyi, reaksiyonun kit üreticisinin protokollerine göre yürütülmesi için programla. Farklı kitler biraz çeşitli bisiklet parametreleri için çağrıda bulunur. Malzeme Tablosundalistelenen kit için, koşullar 30 sn ilk denatürasyon için 94 ° C'dir; 30 sn denatüre için 94 °C 30 döngü, 30 s astar tavlama için 45 °C ve 60 s uzatma için 68 °C; 5 dakika boyunca 68 °C'de son bir uzatma ile; ve son olarak, 10 °C süresiz tutma.
   1. Doğru uzama süresini seçtiğinizden emin olun (yükseltilecek genin uzunluğuna bağlı olarak değişken). Her 1.000 bp için 1 dakikalık bir uzama süresine sahip olmak.
   2. Astarlar için doğru tavlama sıcaklığını girdiğinizden emin olun. En iyi tavlama sıcaklığını belirlemek için giriş olarak her iki astarı kullanan çevrimiçi bir Tm hesap makinesi kullanın⁵⁸. M13 astarları kullanırken 45 °C'lik bir tavlama sıcaklığı yeterlidir.
   3. Döngü sayısını belirlerken, üreticinin protokolüne bakın, ancak 30 döngü çoğu zaman yeterli amplifikasyona neden olur.
3. PCR yapıyorsanız, dNTP'leri çözün ve girdap edin. Kitte bulunan PCR arabelleği kullanın.
4. Tek bir PCR tüpünde, üreticinin protokolünde belirtildiği gibi tüm kit bileşenlerini birleştirin. Başarılı amplifikasyon sağlamak için 1 μL yeniden tanımlanmış DNA stoğu ekleyin (adım 2.6).
5. Karışımı 5-10 sn orta ayarda girdaplayarak hafifçe homojenize edin. Alternatif olarak, pipet hacmin yarısını girdaba 10-20 kez yukarı ve aşağı.
6. PCR reaksiyonlarını gerçekleştirin.
7. PCR protokolü son bir soğutma adımı içermİyorsa, borunun altına yoğuşma sağlamak için çıkarmadan önce reaksiyonun 10 °C'de 5 dakika soğumasını bekleyin.
8. Satıcının talimatlarını izleyerek bir PCR temizleme kiti kullanarak reaksiyondan arındırın.
   1. 1,5 mL'lik bir tüpte sırasıyla 5:1 oranında DNA bağlama tamponu ve PCR örneği ekleyin.
   2. Bu karışımı 1 dakika boyunca 16.000 x g'da spin sütununa ve santrifüje aktarın. Akışa geç.
   3. Kolona 200 μL DNA yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. 16.000 x g'da 1 dakika santrifüj ve akışa atın.
   5. 1 dakikalık kuluçka adımı olmadan 2.8.3 ve 2.8.4 adımlarını yineleyin.
   6. Kalan tamponu çıkarmak için 16.000 x g'da 1-2 dakika daha santrifüj.
   7. DNA'nın 46 μL'si ddH₂O'da elute.
9. Spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA'nın ölçülmesini.
10. Saflaştırılmış DNA'yı -20 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.

4. Sindirim ve döngüselleştirme

NOT: DNA'nın ardından RCA'nın daireselleştirilmesiyle daha fazla amplifikasyon elde edilebilir. Şablonu döngüselleştirmeye hazırlamak için DNA'yı sindirin. Bu, astar dizilerini kaldırır ve şablonun hem 5' hem de 3' uçlarında yapışkan uçlar oluşturur. Bu uçları ligasyon reaksiyoni ile yeniden takin.

1. Bir PCR tüpünde, gerekli tamponun 5 μL'si, 20 U HindIII ve 45 μL saflaştırılmış DNA'yı adım 3.8'den birleştirin.
2. Bu karışımı bir pipetle hafifçe homojenize edin.
3. Karışımı 37 °C'de 15 dakika boyunca bir termal çevrimde kuluçkaya yatırın.
4. Isı, 80 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırarak HindIII'yi inaktive edin.
5. Borunun altına yoğuşma sağlamak için çıkarmadan önce reaksiyonun 10 °C'ye soğumasını bekleyin.
6. Yeni sindirilen DNA'ya 5 μL T4 ligaz tamponu ve 800 U T4 ligaz ekleyin.
   1. İsterseniz T7 ligase kullanın.
7. Bu karışımı bir pipetle hafifçe homojenize edin.
8. Daireselleştirme reaksiyonunu gerçekleştirmek için karışımı 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
9. Satıcının talimatlarını izleyerek bir PCR temizleme kiti kullanarak reaksiyondan arındırın. 3.8. adımda ayrıntılı olarak açıklanan protokolü kullanın.
10. Spektrofotometre kullanarak DNA'yı ölçün. Beklenen değerler ~20 ng/μL'dir.
11. -20 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.

5. İzotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu

NOT: Yuvarlanan daire amplifikasyonu (RCA) ticari bir kit kullanılarak veya ayrı olarak satın alınan bileşenlerle gerçekleştirilebilir. Üreticinin protokolüne uymak başarılı bir amplifikasyon sağlayacaktır. Kitler genellikle bir örnek tampon, reaksiyon tamponu ve φ29 polimeraz gibi iplikçik displacing polimeraz içerir. Birden fazla reaksiyon tüpü, hücresiz ekspresyon için çok miktarda DNA üretmek için birleştirilebilir (20 pg başlangıç malzemesinden 4 μg). Aşağıdaki protokol verimli bir şekilde çalışır.

1. Tek bir tüpte, 4.9 adımından 20 μL numune tamponu, 20 μL reaksiyon tamponu, 0.8 μL enzim ve 1 μL dairesel ifade şablonunun (CET) birleştirin.
   NOT: Bu toplam DNA kütlesi ~20 ng olacaktır, ancak RCA pikogram miktarları ile çalışabilir, böylece yüksek verim taramasında malzemeye önemli bir ihtiyaç varsa ÇET'nin seyreltilmesine ve aşırı enzymatic amplifikasyona izin verir.
2. Karışımı bir pipet ve aliquot 10 μL karışımı dört ayrı tüp halinde homojenize edin.
3. 4-18 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. Isı, 10 dakika boyunca 65 °C'de inkübasyon yaparak enzimi inaktive edin. Tüpün dibinde yoğuşma teşvik etmek için sıcaklığı 5 dakika boyunca 12 °C'ye düşürün.
   NOT: Tüm sıcaklık adımlarını bir termal çevrimde otomatik bir protokolde birleştirmek en kolayıdır.
5. Her tüpe 15 μL ddH₂O ekleyerek elde edilen çözeltiyi seyreltin.
6. Tüm tüpleri birleştirin ve doğrudan hücresiz bir reaksiyona ekleyin.
7. İsterseniz, ürünü arındırmak ve ölçmek için 36 μL ddH₂O'da elüte etmek için bir PCR temizleme kiti kullanın. Şablon konsantrasyonu ~100 ng/μL olduğundan emin olun.

6. Hücresiz reaksiyon

NOT: Enerji arabelleği, ayıklama ve RCA şablonunu birleştirerek hücresiz ifade gerçekleştirin. PANOx-SP enerji tamponunu kullanan tipik bir hücresiz reaksiyon 1,2 mM ATP, GMP, UMP ve CMP'nin her biri 0,85 mM, 30 mM fosphoenolpyruvat, 130 mM potasyum glutamat, 10 mM amonyum glutamat, 12 mM magnezyum glutamat, 1.5 mM spermidin, 1 mM putrescine, 34 μg/mL folik asit, 171 μg/mL E. coli tRNA karışımı, 20 etiketsiz amino asidin her biri 2 mM, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Koenzim A (CoA), 4 mM potasyum oksalat, 57 mM HEPES-KOH tamponu (pH 7,5), E. coli ekstresinin% 0,24 hacmi ve değişken miktarda DNA^23,49. Reaksiyon hacmi değişebilir, ancak 15 μL reaksiyonlar reaktif kullanımından tasarruf edebilir ve 384 siyah duvarlı mikro plaka^49,50'de kullanım için yeterince küçüktür.

1. SfGFP gibi floresan bir proteini ifade ediyorsanız, istenen uyarımı / emisyonu, sıcaklığı ve ajitasyonda okumak için bir plaka okuyucu hazırlayın.
2. 384 kuyu plakası kullanıyorsanız, nemi korumak ve kenar etkisini azaltmak için boş bir numuneyi sınırlayan kuyulara 60 μL H₂O aliquot.
3. Her örnek için gerekli çeşitli bileşenleri bir tüpe ekleyin. Üç taraflılık yapmak için yeterli ekleyin. Plaka içindeki çoğaltmalar değişkenliğin nedenlerini belirlemeye yardımcı olabilir.
   1. Özü, enerji tamponunu ve sonra DNA'yı ekleyin.
   2. DDH₂O ile istenen son hacme seyreltin.
4. Çözelti hacminin yarısını 10-20 kez yukarı ve aşağı borulayarak bu çözeltiyi iyice karıştırın.
5. Reaksiyon karışımını 15 μL aliquots içinde mikrotiter plakada istenen kuyulara aktarın.
6. Nemi korumak ve buharlaşmayı önlemek için plakayı renksiz bir sızdırmazlık filmi ile kapatın.
7. Mühürlü plakayı plaka okuyucusunda yerleştirin ve reaksiyonun tamamlanmasını izin verin.
   1. Canlı olarak izlenme yeteneğine sahip olmayan bir proteini ifade ediyorsanız, plakayı kuluçkaya yatırmak için termok gibi sıcaklık kontrollü başka bir aparat kullanın.

7. Subtilisin tahlil

NOT: Subtilisin BPN' (SBT(n)) genini Ek Sıra no 2'deifade ediyorsanız, aktiviteyi test etmek için bu protokolü izleyin.

1. Dimetilformamid (DMF) içinde 10 μM stok N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid çözeltisi hazırlayın.
2. 25 °C'lik bir sıcaklığı korurken 10 dakika boyunca her 20 dakikada bir 410 nm emiciliği ölçmek için bir plaka okuyucu ayarlayın.
3. Düz bir tabanda, renksiz 96 kuyu plakası, 7.1 adımından aliquot 94 μL ddH₂O ve 1 μL N-succinyl-Ala-Pro-Phe p-nitroanilid.
4. 6.7. adımdan bitmiş hücresiz reaksiyonun 5 μL'sini ekleyin ve 7.2 adımında açıklanan protokole ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okuyun.

SfGFP'nin RCA şablonlarından ekspresyöneti, 15 μL reaksiyonda sadece 0,30 μL'lik unpurified RCA DNA'sı kullanırken pJL1 plazmidi ile karşılaştırılabilirdi (Şekil 2A). Aslında, şablon miktarını iki katına çıkarmak ve üçe katlamak BL21 DE3 Star özünde hiçbir fayda sağlamaz, bu da şablonun reaksiyon başına 0,30 μL'de zaten doymuş seviyelerini önerir. Tersine, SHuffle suşundan elde edilen hücre özüne eklendiğinde RCA şablonu miktarını artırmanın bir yararı olduğu görülmektedir (Şekil 2B)²⁸. Bazı proteinler için sonuçlar çok hızlı bir şekilde gözlemlenebilir, bu da tüm iş akışını (amplifikasyon ve tahlil) 24 saatin altına sıkıştırır. Bununla birlikte, bazı proteinler daha düşük sıcaklık gerektirir veya daha yavaş katlama sürelerine sahiptir, bu da sonuçlar elde edilene kadar süreyi artıracaktır, ancak burada sunulan iş akışını etkileyecektir. Bu, 4 saat ifadeden sonra tahlillemenin SBT(n) olgunlaşması için yeterince uzun olmadığı subtilisin (SBT(n)) ifade edilirken gözlemlenebilir(Şekil 3A, başarısız bir sonuç örneği). Reaksiyonun 16 h'ye kadar devam etmesine izin vermek, tespit edilebilir SBT(n) seviyelerine yol açabilir (Şekil 3B). Bu iyileşme, optimize edilmiş sıcaklık koşullarının araştırıldığı literatürde gözlendiği gibi sıcaklığa bağlı olabilir^59,60.

Şekil 1: Minimal genetik şablonun ve ilk PCR amplifikasyon adımından sonra geçirdiği sürecin temsili şeması. Şablonlar HindIII ile sindirilir, T4 ligase ile daireselleştirilir ve büyük özlüler oluşturmak için φ29 polimeraz ile daha da yükseltilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Teşvik edilmemiş 5 nM plazmid (pJL1), 5 nM doğrusal şablon (LET) ve çeşitli pürlütsüz RCA konsantrasyonları ile hücresiz reaksiyonların sonuçları. RCA #1, #2 ve #3, 30 °C'de (n = 3) inkübe edilmiş 15 μL reaksiyonda 0,3 μL, 0,6 μL ve 0,9 μL (sırasıyla) unpurified RCA ürünü içeriyordu. Hata çubukları ortalamadan ± 1 SD'yi temsil eder. y ekseni floresandır ve x ekseni reaksiyon sırasında geçen zamandır. sfGFP ekspresyonunun kinetiği (A) BL21 DE3 Star ve (B) T7 SHuffle'da temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 5 nM SBT(n) LET ve çeşitli konsantrasyonlarda unpurified RCA ürünü ile hücresiz reaksiyonlar. RCA ng ve pg, yuvarlanan daire amplifikasyonu yapmak için kullanılan DNA'nın konsantrasyonuna karşılık gelir. 30 °C'de (n = 3) inkübe edilmiş 15 μL reaksiyonda teşvik edilmemiş RCA ürünü kullanılmıştır. Hata çubukları ortalamadan ± 1 SD'yi temsil eder. y ekseni 410 nm'deki emiciliğidir ve x ekseni testte geçen süredir. Reaksiyonlar (A) 4 saat ve (B) 16 saat boyunca gerçekleştirildi.

Tablo 1: Basitleştirilmiş geleneksel klonlama protokolü ile burada kapsanan RCA protokolü arasındaki zaman çizelgesinin karşılaştırılması.

Ek Dosya: Ek dosya dizileri listeler. Sıra #1 sfGFP (999 baz çift) ve sıra #2 subtilisin BPN' (1344 bp). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

İlgi gen herhangi bir istenen protein olabilir, ancak bu yöntemi yeni benimseyenler için iyi bir plaka okuyucuda gerçek zamanlı veya son nokta okuma için uygun bir muhabir olarak floresan bir proteinle başlamak en iyisidir. Yeni protein dizileri için, istenen proteinin amino asit dizisini kopyalayın ve istenen kodon optimizasyon aracı^61,62'ye yapıştırın. Kodon optimizasyon aracında genellikle birçok mevcut organizma ve E. coli suşu vardır, ancak genel Escherichia coli seçeneğini seçmek uygun olacaktır. Optimizasyondan sonra, daha önce seçilen kesim bölgesinin ve astar dizilerinin bulunmadığından emin olmak için geni iki kez kontrol edin. Öyleyse, sıralar artık mevcut olmayana kadar sıra en iyi duruma getirilebilir. Bazı durumlarda, tekrarlanan optimizasyon sürekli olarak dahili bir HindIII kesim sitesiyle sonuçlanırsa, HindIII kesim sitelerini farklı bir kısıtlama sitesiyle değiştirmek gerekebilir. İşlemi standart tutmak ve birden fazla kısıtlama enzimini elde tutma maliyetini azaltmak için aynı kesim bölgesini mümkün olduğunca sık kullanmak en iyisidir.

Amplifikasyona başlamadan önce LET'e en uygun PCR kitini seçin. < 1.000 baz çifti olan bir LET basit bir Taq polimeraz ile yükseltilebilirken, ≥ 1.000 baz çifti olan bir LET daha yüksek kaliteli bir polimeraz^{gerektirebilir 63}. Kit üreticisine ve istenen astarların tavlama sıcaklığına göre amplifikasyon protokolünü ayarlayın. Tavlama sıcaklığı başarılı bir amplifikasyon için kritik öneme sahiptir. Genel bir kural, astarların Tm'sinden 5 °C daha düşük bir tavlama sıcaklığı seçmektir. Astarların sırasına göre optimize edilmiş bir tavlama sıcaklığı sağlayacak ücretsiz çevrimiçi araçlar^{vardır 58}. Doğru tavlama sıcaklığını kullanmak, yüksek kaliteli DNA şablonu üretmek için kritik öneme sahiptir.

Hücresiz gen ekspresyasyonu, hızı, basitliği ve sentetik biyoloji prototipleme yararı nedeniyle son yıllarda bir rönesans görmüştür. Bu çalışma, yeni, fonksiyonel proteinlerden oluşan büyük bir kütüphaneyi test ederken hızı ve kolaylığı artırmak için bir yöntem özetledi. Geleneksel klonlama yöntemleri günler veya haftalar sürebilirken, bu protokol 24 saatten daha kısa bir sürede yapılabilir. Klonlama iletişim kuralının basitleştirilmiş olduğunu ve jel yalıtımı gibi bazı isteğe bağlı adımların dışarıda bırakıldığını unutmayın. Tablo 1 ayrıca yalnızca ortak kısıtlama sindirim protokollerini ifade eder; başka birçok klonlama yöntemi vardır, ancak bunlar benzer miktarda zaman gerektirir. Bu enzymatic amplifikasyon protokolünün üst aralığı, özellikle 8 saatlik bir iş günü düşünüldüğünde, klonlama yönteminin alt aralığından daha az zaman gerektirir. Bu büyük ölçüde gece kuluçkalarının kaldırılmasından ve sıralama onayının olmamasından kaynaklanmaktadır. RCA protokolü tamamen geleneksel klonlama, dönüşüm ve hücre kültürü tekniklerinden daha az özel beceriler gerektiren PCR ve RCA'ya dayanmaktadır. Bu yöntem, hücreleri dönüştürmek ve büyütmek için gerekli klonlama veya sermayeye erişim konusunda önceden deneyimi olmayan laboratuvarlar için hücresiz ifadeyi erişilebilir hale getirir. Bu yöntem, canlı hücredeki toksisite nedeniyle genlerin geleneksel klonlama ile klonlanması ve yayılmasının zor olduğu sitotoksik proteinlere odaklanan projeler için de uygundur. Bu RCA protokolü ayrıca çok az miktarda dairesel DNA'yı (DNA pikogramları) CFE için gerekli seviyelere yükseltebilir. Şekil 3B'de,daireselleştirilmiş SBT(n) şablonu RCA'dan önce 20 ng/μL ve 20 pg/uL'ye seyreltilmiştir. Gözlenen bozulma oranları farklı olsa da, her iki reaksiyon da 10 dakika içinde aynı miktarda substrat bozulmasına neden oldu. Önerilen yöntem klonlamanın yerini almak için tasarlanmaz; plazmid yayılımı, eşleştirilemeyen toksik olmayan genler için dna miktarları üretebilir. Bunun yerine, bu, arşivleme ve daha fazla yayılma için hangi dizilerin klonlanması gerektiğini belirlemeye yardımcı olacak büyük bir kütüphane tarama aşamasında (standart akışkan işleyici ile otomasyona enzymatic adımlar uygundur) uygun bir prototipleme aracıdır.

Hücresiz reaksiyon tasarlarken, çok fazla esneklik vardır, ancak başarıyı sağlamak için dikkate alınması gereken bazı faktörler vardır. Daha küçük reaksiyonlar, gaz değişimi için harika olan daha büyük bir yüzey alanına ve hacim oranına sahiptir, ancak reaksiyonun doğru floresan ölçümleri için kuyunun altını tamamen kaplaması gerekir. Reaksiyonun sıcaklığı da ilgi genine bağlı olarak değişebilir⁵⁹. Bir enerji tamponu seçimi söz konusu olduğunda kullanıcılar için birden fazla seçenek vardır^34,46. Bazı tarifler diğerlerinden daha pahalıdır, ancak karar kullanıcıya bırakılır. E. coli özü³⁶için birçok potansiyel kaynak da vardır. Kullanıcılar öz üretim protokolleri hakkında bilgi sahibi olmalı ve amaçları için hangisinin en iyi olduğuna karar vermelidir^{28,48,50,64,65,66,67}.

Hücresiz ifade şablonlarını yükseltmek için RCA kullanırken, bakteriyel suş seçimi çok önemlidir. İfade profili, LED'lerden daha iyi olma eğilimindedir. Popüler BL21 DE3 Yıldız gerinimi, RCA'nın LET'den ~ 1.4x daha iyi performans göstermesi ve pJL1 plazmidinin en iyi RCA konsantrasyonundan ~ 1.2x daha iyi performans göstermesiyle bu kuyuyu iyi idare eder (Şekil 2A). Öte yandan, bazı suşlar şablon bozulması gösterir ve yerel çekirdeklerin varlığı nedeniyle kötü performans gösterir^23,28. Bu durumda, SHuffle suşu artan bir RCA şablonundan yararlanır gibi görünüyor. Önceki literatür, SHuffle ekstresinin PCR ürünleriyle iyi performans göstermediğini göstermiştir, ancak bu çalışmada kullanılan en yüksek teşviksiz RCA ürünü konsantrasyonu pJL1 plazmidini geride bıraktı (Şekil 2B). Fonksiyonel SBT(n) ifadesi (Şekil 3) toksisite nedeniyle canlı hücrelerde hücresiz ancak prototipi zor tarafından uygun bir şekilde yapılan sitotoksik bir protein örneğidir (bu ifade şablonunu plazmidde klonlayamaz ve E. coli'de yayılamaz). sfGFP'den farklı olarak, SBT(n) etkinliği sadece 4 h ifadeden sonra gözlemlenemez (Şekil 3A). Sinyal 16 saat ifade ve olgunlaşmadan sonra algılanabilir (Şekil 3B). Bu örneklerde kullanılan unpurified DNA, seyreltilmiş ve birleştirilmiş dört adet 10 μL RCA reaksiyonundan 100 μL'den geldi. Bu stok, reaksiyon başına sadece 0,30 μL kullanıyorsa 333 hücresiz reaksiyonu destekleyebilir.

RCA şablonlarının CFE ile uyumluluğunun çeşitli özlerle daha fazla araştırılması gerekir. Doğrusal ürünlerle ilgili potansiyel komplikasyonlar, E. coli chi dizisini veya GamS proteini^52,53'üiçeren kısa oligolar eklenerek hafifletilebilir. Literatür, chi oligos eklenmesinin doğrusal şablonlara GamS^{proteini 53'ten}daha fazla koruma sağlayabileceğini göstermektedir. Doğrusal şablonlardan düşük verim sağladığı bilinen bir ekstrakt kullanıyorsanız, kullanıcı her koruyucu ajanın maliyetini analiz etmeli ve amaçlarına en uygun olanı kullanmalıdır. Başka bir sınırlama, ortaya çıkan özlülüğün doğası nedeniyle RCA şablon konsantrasyonlarının azı dişine dönüştürülememesidir. Bu, kütleye göre aynı sayıda minimum şablon ekleyebileceğini, ancak ifade düzeylerini etkileyebilecek değişen özlük uzunluklarına sahip olacağı anlamına gelir. Yazarlar, her kuyudan ortalama ifade düzeyleri aynı (düşük varyans) olduğu için tarama/ prototiplemede bir sorun olarak bulamamıştır, ancak daha küçük hacimlerde (örneğin mikro damlacıklar) ifade ediyorsanız bir sorun olabilir.

Hücresiz gen ekspresyözü, protein prototipleme ve tasarım-yap-test iş akışlarında önemli bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, çoğu hücresiz ifade iş akışı hala genetik şablon olarak geleneksel plazmidlere dayanır. Bu, işlemi yavaşlatır ve hücresiz ifadenin tarama/prototip oluşturma amaçları için tam olarak kullanılmasını önler. Şablonları yükseltmek ve daha sonra RCA gerçekleştirmek, birçok reaksiyon için hızlı bir şekilde yeterli genetik şablon üretebilir, aşağı akış karakterizasyonu ve fonksiyonel test için yeterli protein üretebilir.

Nigel Reuel, antikorların tasarımı için hücresiz sistemler kullanan BigHat Biosciences Inc. şirketinin bilimsel danışma kurulunda görev yapmaktadır.

Yazarlar NIH 1R35GM138265-01 ve NSF'nin bu projenin kısmi desteği için 2029532 kabul ediyor.