שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של תבנית DNA מינימלית ואת השלבים להגברה אנזימטית, המאפשרת טיפוס מהיר של חלבונים הניתנים לבדיקה בפחות מ-24 שעות באמצעות חופש הביטוי של התא. לאחר קבלת DNA מספק, שבר הגן הוא PCR מוגבר, לחתוך, מעגלי, ו cryo-בנקאות. כמות קטנה של ה- DNA הבנקאי מדוללת ומוגברת באופן משמעותי (עד 10⁶x) באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל (RCA). RCA יכול להניב כמויות מיקרוגרם של תבנית הביטוי המינימלית מרמות פיקוגרמה של חומר התחלתי (רמות מ"ג אם נעשה שימוש בכל הקטע הסינתטי ההתחלתי). בעבודה זו, כמות התחלתית של 20 pg הביא 4 מיקרוגרם של המוצר הסופי. ניתן להוסיף את מוצר RCA המתקבל (ויתור על התבנית המינימלית) ישירות לתגובה נטולת תאים ללא שלבי טיהור. בשל שיטה זו להיות מבוסס PCR לחלוטין, זה עשוי לאפשר מאמצי סינון תפוקה גבוהה בעתיד בשילוב עם מערכות טיפול נוזלי אוטומטי.

ביטוי גנים ללא תאים (CFE) הופיע ככלי רב עוצמה עם יישומים רבים. יישומים כאלה כוללים גילוי מחלות^1,2,3,4,5,6, מיקרונוטריאנט וזיהוי מולקולות קטנות^{7,8,9,10,11,12}, biomanufacturing^{13,14,15,16,17 ,18}, חינוך^19,20,21, ייצור חלבונים קשים^{17,22,23,24,25,26,27}, והקרנה^{משתנה 23,28,29,30,31,32 ,33}. זאת בשל האופי הפתוח של מערכות ללא תאים והגמישות שהן מעניקות. מאמרי סקירה גדולים רבים מציעים חינוך היסטורי ונקודות מבט עתידיות על הטכנולוגיה^{34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}.

תגובה טיפוסית ללא תאים מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: תמצית תאים, תערובת אנרגיה ותבנית גנטית. תמצית תא פעיל מכיל את כל המכונות הדרושות עבור שעתוק ותרגום (TXTL) וניתן לעבד במגוון^{דרכים 36}. מתווכים גליקוליטיים, אלקטרוליטים, חומצות אמינו וקופות פחמן מתמהיל האנרגיה תומכים בתהליך TXTL. זהו מקור עיקרי של שונות בניסויים ללא תאים⁴⁵ והוא יכול להיות מוכן במובנים רבים^34,46. הכנת התבנית הגנטית ראתה פחות שיפורים מאז שיטות שיבוט מסורתיות לגרום plasmids עם מאפייני ביטוי מעולה. החיסרון בשיטות מסורתיות אלה הוא זמן התפנית וכמות המומחיות הביולוגית הדרושה כדי לבנות ולהפיץ אותם. מאמצי אופטימיזציה אחרונים הביאו זרימות עבודה פשוטות של 24 שעות להכנת תמצית תאים^47,48 שניתן לבצע במקביל להכנת תערובת^{אנרגיה 49,50}. עם זאת, שיבוט מסורתי מוסיף ימים מרובים לציר הזמן של עיצוב-טיפוס של CFE(טבלה 1)²³. ניתן להשתמש במוצרי PCR מוגברים במהירות מרסיס הגן המסחרי ישירות⁵¹, אך זה מגביל את מספר ניסויי האב-טיפוס שכן מיוצר רק מיקרוגרם אחד של DNA, אשר מתאים לכחמש תגובות (כרכים μL מסורתיים). עם שלבים נוספים אלה של סיבובי הגברה איזותרמית, גדול יותר מכמויות מיליגרם של ה- DNA אפשרי (~ 5,000 תגובות עבור 1 מ"ג). זה מגדיל באופן דרמטי את מספר הבדיקות שניתן לבצע בהקרנה בתפוקה גבוהה של חלבונים או רשתות אנזימים קומבינטוריות (הנדסה מטבולית ללא תאים); זה גם מאפשר שימור יעיל של ספריית התבניות הליניארית כדנ"א בריכוז גבוה. יתר על כן, כמות מוגברת של תבנית יהיה צורך אב טיפוס כמויות גדולות יותר של חלבון הדרוש עבור יישומי מדעי החומר (סיבים מבוססי חלבון הידרוג'ל). ניתן להתגבר על מגבלות מסוימות של תבניות ליניאריות באמצעות תמצית מ- BL21 DE3 Star או באמצעות שיטות שהתגלו לאחרונה כדי להגן על תבניות ליניאריות מפני השפלה^52,53,54. עם זאת, אין זה מתייחס למלאי מוגבל של DNA המיוצר על ידי ספק להגברת PCR או לנושא המומחיות הביולוגית והציוד הדרוש לשיבוט.

עבודה זו מציגה פרוטוקול שתוכנן במפורש כדי להגדיל את כמות תבנית הביטוי שניתן להשיג מכמויות קטנות של שברי גנים המיוצרים על ידי ספק (בדרך כלל 500-1000 ננוגרם של אבקת ליופילים). השיטה המתוארת אינה דורשת את הכישורים הדרושים לביצוע שיבוט מסורתי ב plasmids או שינוי והתפשטות בתאים חיים. עם קבלת שבר גנים בדואר, משתמש יכול לייצר מספיק תבניות עבור תגובות רבות ללא תאים על ידי שימוש בהגברת מעגל מתגלגל איזותרמי (RCA) (איור 1)²³. בעוד שכמות הדנ"א המתקבלת מהספק עשויה להספיק למאמצי סינון מוגבלים, היא מתרוקנת במהירות, ורכישת שברי גנים מחדש גוזלת זמן ויקר. השיטה גם מתאימה במיוחד לגנים רעילים וקשה לשכפול ב- E. coli.

1. עיצוב שבר הגן

הערה: שבר הגן צריך להיות כל האלמנטים הגנטיים הדרושים עבור שעתוק / תרגום, כולל מקדם, אתר כריכה ריבוזום (RBS), להתחיל קודון, גן העניין, ומחסל. בעוד המחסל אינו הכרחי עבור תבנית ביטוי ליניארי (LET), זה יהיה חשוב אם המשתמש מחליט להוסיף את הרצף לתוך plasmid. רצפים אלה הוסרו מן pJL1-sfGFP plasmid⁵⁵ (מתנה מהמעבדה של מייקל ג'ואט), המשתמשת ביחצ"ן T7. בנוסף לאלמנטים גנטיים הכרחיים אלה, הוסיף אתר אנזים מוגבלת שישה זוגות בסיס לפני המקדם (5 'אתר לחתוך) ועוד שישה זוגות בסיס לאחר המחסל (3 'אתר לחתוך), במקרה זה באמצעות HindIII (אנזימי הגבלה אחרים ניתן להשתמש, אבל זה מועיל לתקנן את הרצפים עם אנזים אחד הגבלת נאמנות גבוהה כדי להפחית את המספר הדרוש כדי לשמור בספרייה). אתרי פריימר מתווספים עשרה זוגות בסיס במעלה הזרם של האתר 5 'לחתוך עשרה זוגות בסיס במורד הזרם של האתר 3 'לחתוך, במקרה זה באמצעות רצפי פריימר M13 סטנדרטי (פריימרים הם פריטי מלאי זולים). אתר האנזים ההגבלה והפריימרים המשמשים נמצאים על פי שיקול דעתו של המשתמש. עם זאת, על המשתמש לוודא שהרצפים אינם קיימים בשום מקום אחר בתבנית (לא רוצה ליצור חתכים לא רצויים או אתרים של אתחול הגברה). הרצפים עבור התבניות המשמשות בעבודה זו מפורטים בחומר המשלים. שלבים אלה משמשים לשינוי מתבנית בסיס זו.

1. לקבוע את הגן הרצוי לבוא לידי ביטוי ולקבל את רצף חומצת האמינו או את הרצף הגנטי אם זה בא לידי ביטוי E. coli.
2. אם זה רצף חומצת אמינו, לבצע אופטימיזציה קודון עבור E. coli באמצעות אחד מכלים ספק סטנדרטיים רבים⁵⁶. אם אתה משתמש בתבנית המסופקת בתוספת, ודא שלרצף הממוטב אין אתרי הגבלה HindIII (AAGCTT). במקרה שהוא עושה, להמשיך לייעל את הרצף עד שאין יותר אתר HindIII.
3. העתק את הרצף והדבק אותו בתבנית שסופקה עבור רצף משלים #1 שבו מצוין גן העניין. אם אתם מביעים את sfGFP, השתמשו ברצף משלים מס' 1 כפי שהוא. אם מבטאים subtilisin, להשתמש רצף משלים #2 כפי שהוא.
4. הזמינו את התבנית המינימלית ואת הפריימרים הדרושים משירות סינתזת הדנ"א המועדף.

2. הכנסה חוזרת של שבר הגן ואת הפריימרים

הערה: עם קבלת שבר הגן, בצע את פרוטוקולי היצרן לחידוש או השתמש במדריך פשוט זה כדי ליצור מלאי DNA.

1. צנטריפוגה הצינור (300 x גרם עבור 5 s) כדי לאסוף את כדורי ה- DNA בתחתית.
2. הוסף מים מזוקקים כפולים (ddH₂O) כדי להפוך את הריכוז הסופי של 10 ננוגרם / μL של תבנית DNA.
3. מערבולת הפתרון על הגדרה בינונית עבור 5-10 s.
4. ממיסים את כל הכדור על ידי דגירה ב 50 °C (50 °F) במשך 20 דקות.
5. מערבולת בקצרה שוב
6. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 s כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור.
7. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) או להשתמש ב- PCR.
8. הכן מלאי פריימר 100 מיקרומטר על ידי שימוש חוזר בפריימרים במים ללא גרעין. כדי לקבוע את כמות המים להוסיף, להכפיל את מספר nanomoles של פריימר ליופילי על ידי 10. לדוגמה, אם הצינור מכיל 45 ננומטר של פריימר ליופילי, להוסיף 450 μL של ddH₂O ומערבולת הפתרון.
9. לאחסן את פתרונות מלאי פריימר ב -20 °C (20 °F) או להמשיך לבצע את ההגברה.

3. להגביר את שבר הגן באמצעות PCR

הערה: החלט איזו ערכת PCR מתאימה לגן העניין. גנים קטנים יותר (<1,000 kb) עשויים להיות נוחים יותר לפולימראז טאק זול יותר, בעוד גנים גדולים יותר (≥1,000 kb) עשויים להפיק תועלת מפולימראז אמינות גבוהה כדי להפחית שגיאות. חשוב לציין כי הגברה ראשונית זו של PCR אינה הכרחית אם המשתמש אינו מודאג משימור שבר הגן הראשוני (הוא מספק ניסיונות מרובים להסתמכות ומאפשר מחקרים השוואתיים של מוצר LET לעומת RCA). חשוב גם לציין כי זה PCR מוגבר LET ניתן להשתמש ישירות בתגובות; עם זאת, כפי שהוזכר בהקדמה, זה יאפשר רק מספר מוגבל של תגובות אם צעדי ההגברה הנוספים היו מתעלמים. עיכול וקשירה יכולים להתבצע על שבר הגן resuspended ישירות⁵⁷ (אם אחד בטוח, הם לא יצטרכו יותר LET לבצע מלאי מעגלי נוסף). במקרה זה, דלג על סעיף 3 והמשיך לסעיף 4. לביצוע PCR, בצע את השלבים הבאים.

1. השתמש במניות 100 μM החל בשלב 2.8 כדי ליצור פתרונות עבודה של 10 מיקרומטר. פרוטוקולי ערכת PCR רבים דורשים פתרונות 10 מיקרומטר של פריימרים.
2. תכנת את רוכב האופניים התרמי כדי לנהל את התגובה בהתאם לפרוטוקולים של יצרן הערכה. ערכות שונות דורשות פרמטרים מעט מגוונים של רכיבה על אופניים. עבור הערכה המפורטת בטבלת החומרים, התנאים הם 94 °C (75 °F) עבור 30 s של denaturation הראשונית; 30 מחזורים של 94 °C (70 °F) עבור 30 מעלות צלזיוס של denaturing, 45 °C (55 °F) עבור 30 °C (30 ים) של חישול פריימר, ו 68 °C (60 °F) של הרחבה; עם הארכה סופית ב 68 °C (5 דקות; ולבסוף, אחיזה של 10 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
   1. הקפד לבחור את זמן ההארכה הנכון (משתנה בהתאם לאורך הגן להיות מוגבר). יש זמן התארכות של 1 דקות עבור כל 1,000 bp.
   2. יש להקפיד על הזנת טמפרטורת הכישול הנכונה עבור הפריימרים. השתמש במחשבון Tm מקוון המשתמש בשני פריימרים כתשומות כדי לקבוע את טמפרטורת חישול הטובה ביותר⁵⁸. טמפרטורת חישול של 45 °C (70 °F) מספיקה בעת שימוש בפריימרים M13.
   3. בעת קביעת מספר המחזורים, עיין בפרוטוקול היצרן, אך 30 מחזורים לרוב יביאו להגברה מספקת.
3. אם מבצעים PCR, להפשיר ולמערבולת את dNTPs. השתמש במאגר ה- PCR המסופק בערכה.
4. בצינור PCR יחיד, שלב את כל רכיבי הערכה לפי ההוראות בפרוטוקול היצרן. כדי להבטיח הגברה מוצלחת, הוסף 1 μL של מלאי DNA resuspended (שלב 2.6).
5. בעדינות הומוגניזציה התערובת על ידי מערבולת על הגדרה בינונית עבור 5-10 s. לחלופין, pipette מחצית הנפח למעלה ולמטה 10-20 פעמים למערבולת.
6. בצע את תגובת ה- PCR.
7. אם פרוטוקול PCR לא כלל שלב קירור סופי, אפשר לתגובה להתקרר במשך 5 דקות ב 10 °C (70 °F) לפני הסרת כדי להניע עיבוי לתחתית הצינור.
8. נקה את התגובה באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם להוראות הספק.
   1. בצינור 1.5 מ"ל, הוסף חיץ כריכת DNA ודגימת PCR ביחס של 5:1, בהתאמה.
   2. מעבירים את התערובת לעמודת הספין וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת. זרוק את הזרימה דרך.
   3. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף DNA לעמוד ודגור בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
   4. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-16,000 x גרם ומחקה את הזרימה.
   5. חזור על שלבים 2.8.3 ו- 2.8.4 ללא שלב הדגירה של דקה אחת.
   6. צנטריפוגה למשך 1-2 דקות נוספות ב-16,000 x ז', כדי להסיר כל מאגר שנותר.
   7. לחמוק DNA ב 46 μL של ddH₂O.
9. לכמת את הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
10. לאחסן את ה- DNA המטוהר ב - -20 °C (50 °F) או להמשיך לשלב הבא.

4. עיכול ומעגליות

הערה: הגברה נוספת ניתן להשיג על ידי סיבוב ה- DNA ואחריו RCA. עכל את הדנ"א כדי להכין את התבנית למעגליות. פעולה זו תסיר את רצפי הפריימר ותיצור קצוות דביקים הן בקצוות של 5' ו- 3' של התבנית. לחבר מחדש את הקצוות האלה באמצעות תגובת קשירה.

1. בצינור PCR, לשלב 5 μL של המאגר הדרוש, 20 U של HindIII, ו 45 μL של ה- DNA המטוהר משלב 3.8.
2. בעדינות הומוגני תערובת זו עם פיפטה.
3. לדגור על התערובת ברכב אופניים תרמי במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).
4. החום לאפעיל את הינדי על ידי דגירה במשך 20 דקות ב 80 °C (50 °F).
5. אפשר לתגובה להתקרר ל 10 °C (50 °F) לפני הסרת כדי לנהוג עיבוי לתחתית הצינור.
6. הוסף 5 μL של חיץ ligase T4 ו 800 U של T4 ligase ל- DNA שעוכל לאחרונה.
   1. השתמש T7 ligase, אם תרצה.
7. בעדינות הומוגני תערובת זו עם פיפטה.
8. לדגור על התערובת במשך 1 שעות ב 25 °C (5 °F) כדי לבצע את תגובת המעגליזציה.
9. נקה את התגובה באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם להוראות הספק. השתמש באותו פרוטוקול המפורט בשלב 3.8.
10. לכמת את הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. הערכים הצפויים הם ~ 20 ng / μL.
11. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.

5. הגברה איזותרמית של מעגל מתגלגל

הערה: הגברה מעגל מתגלגל (RCA) ניתן לבצע באמצעות ערכה מסחרית או עם רכיבים שנרכשו בנפרד. ביצוע פרוטוקול היצרן יבטיח הגברה מוצלחת. ערכות מכילות בדרך כלל חיץ מדגם, מאגר תגובה, גדיל עקירת פולימראז, כגון φ29 פולימראז. צינורות תגובה מרובים ניתן לשלב כדי לייצר כמות גדולה של DNA עבור ביטוי חופש התא (4 מיקרוגרם מ 20 pg של חומר התחלתי). הפרוטוקול הבא פועל ביעילות.

1. בצינור יחיד, שלב 20 μL של מאגר המדגם, 20 μL של מאגר התגובה, 0.8 μL של האנזים, ו 1 μL של תבנית הביטוי המעגלי (CET) משלב 4.9.
   הערה: זה יהיה מסת DNA הכוללת של ~ 20 ננוגרם, אבל RCA יכול לעבוד עם כמויות פיקוגרמה, ובכך לאפשר דילול של CET הגברה אנזימטית קיצונית אם יש צורך משמעותי בחומר בהקרנת תפוקה גבוהה.
2. הומוגניזציה התערובת עם פיפטה aliquot 10 μL של התערובת לארבעה צינורות נפרדים.
3. דגירה ב 30 °C (50 °F) עבור 4-18 שעות.
4. חום לנטרל את האנזים על ידי דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 10 דקות. להפחית את הטמפרטורה ל 12 °C (5 דקות) כדי לעודד עיבוי בתחתית הצינור.
   הערה: הכי קל לשלב את כל שלבי הטמפרטורה בפרוטוקול אוטומטי על רוכב אופניים תרמי.
5. לדלל את הפתרון המתקבל על ידי הוספת 15 μL של ddH₂O לכל צינור.
6. שלב את כל הצינורות והוסף ישירות לתגובה ללא תאים.
7. אם תרצה, השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את המוצר ולהתחמק ממנו ב 36 μL של ddH₂O כדי לכמת. ודא שריכוז התבנית הוא ~100 ננוגרם/μL.

6. תגובה ללא תאים

הערה: בצע ביטוי חופש תא על-ידי שילוב של מאגר אנרגיה, תמצית ותבנית RCA. תגובה אופיינית ללא תאים באמצעות מאגר האנרגיה PANOx-SP מורכבת מ- ATP של 1.2 מ"מ, 0.85 מ"מ כל אחד מה-GMP, UMP ו-CMP, 30 מ"מ זרחן, 130 מ"מ אשלגן גלוטמט, 10 מ"מ אמוניום גלוטמט, 12 מ"מ מגנזיום גלוטמט, 1.5 מ"מ זרע, 1 mM putrescine, 34 מיקרוגרם/מ"ל של חומצה פולינית, 171 מיקרוגרם/מ"ל של תערובת E. coli tRNA, 2 מ"מ כל אחת מ-20 חומצות אמינו ללא תווית, 0.33 מ"מ NAD, 0.27 מ"מ קואנזים A (CoA), 4 מ"מ אשלגן אוקסלט, 57 מ"מ חיץ HEPES-KOH (pH 7.5), 0.24% נפח תמצית E. coli, וכמויות משתנות של DNA^23,49. נפח התגובה יכול להשתנות אבל 15 תגובות μL יכול לחסוך על שימוש ריאגנט והם קטנים מספיק לשימוש 384 מיקרו-לוח שחור^49,50.

1. אם מבטאים חלבון פלואורסצנטי כגון sfGFP, הכינו קורא לוחות לקריאה בהתרגשות/פליטה הרצויה, בטמפרטורה ובתסיסה.
2. אם משתמשים בצלחת 384-well, aliquot 60 μL של H₂O לתוך בארות הגובלות בדוגמה ריקה היטב כדי לשמור על לחות ולהפחית את אפקט הקצה.
3. הוסף את הרכיבים הנדרשים השונים לתוך צינור עבור כל מדגם. הוסף מספיק כדי לבצע טריפליקאטים. שכפול בתוך הלוח יכול לסייע בזיהוי גורמים לשונות.
   1. מוסיפים את התמצית, את מאגר האנרגיה ואז את הדנ"א.
   2. לדלל את הנפח הרצוי הסופי עם ddH₂O.
4. ערבבו פתרון זה ביסודיות על ידי צנרת מחצית מנפח הפתרון למעלה ולמטה 10-20 פעמים.
5. מעבירים את תערובת התגובה ב-15 μL aliquots לבארות הרצויות בצלחת המיקרו-תות.
6. אוטמים את הצלחת בסרט איטום חסר צבע לשמירה על לחות ומניעת אידוי.
7. מניחים את הצלחת האטומה בקורא הלוחות ומאפשרים לתגובה להסתיים.
   1. אם מבטאים חלבון שאין לו את היכולת להיות במעקב חי, השתמש במנגנון אחר מבוקר טמפרטורה כגון תרמובלוק כדי לדגור על הצלחת.

7. בדיקה תת-סטיליסין

הערה: אם מבטאים את הגן BPN' (SBT(n)) ברצף משלים מס ' 2, פעל לפי פרוטוקול זה כדי לאבחן את הפעילות.

1. הכן פתרון מלאי 10 מיקרומטר של N-סוקציניל-עלא-אלה-פרו-Phe p-nitroanilide בדימתילפורמיד (DMF).
2. הגדר קורא צלחת כדי למדוד ספיגה ב 410 ננומטר כל 20 s במשך 10 דקות תוך שמירה על טמפרטורה של 25 °C (70 °F).
3. בתחתית שטוחה, צלחת 96-well חסר צבע, aliquot 94 μL של ddH₂O ו 1 μL של N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide מהשלב 7.1.
4. הוסף 5 μL של התגובה המוגמרת ללא תאים מהשלב 6.7 וקרא באמצעות קורא לוחות המוגדר לפרוטוקול המתואר בשלב 7.2.

ביטוי של sfGFP מתבניות RCA היה דומה לזה של pJL1 plasmid בעת שימוש רק 0.30 μL של DNA RCA לא מתואם בתגובת 15 μL (איור 2A). למעשה, הכפלה ושלשה של כמות התבנית נראה להציע שום תועלת תמצית BL21 DE3 כוכב, מציע רמות רוויות כבר של התבנית ב 0.30 μL לכל תגובה. לעומת זאת, נראה שיש יתרון בהגדלת כמות תבנית RCA כאשר מוסיפים לתמצית תאים שמקורה בזן SHuffle (איור 2B)²⁸. עבור חלבונים מסוימים, ניתן לראות תוצאות מהר מאוד, אשר דוחס את זרימת העבודה כולה (הגברה ובוחן) אל מתחת 24 שעות. עם זאת, חלבונים מסוימים דורשים טמפרטורה נמוכה יותר או שיש להם זמני קיפול איטיים יותר, אשר יגדיל את הזמן עד לתוצאות מתקבלות אבל ישפיע על זרימת העבודה המוצגת כאן. ניתן לצפות באפשרות זו בעת הבעת סטיבליסין משנה (SBT(n)) כאשר בדיקה לאחר 4 שעות של ביטוי לא הייתה ארוכה מספיק עבור התבגרות SBT(n) (איור 3A, דוגמה לתוצאה כושלת). מתן אפשרות לתגובה להמשיך ל- 16 שעות יכול להוביל לרמות הניתנות לזיהוי של SBT(n) (איור 3B). שיפור זה עשוי להיות תלוי טמפרטורה, כפי שנצפה בספרות שבה תנאי טמפרטורה אופטימליים נחקרו^59,60.

איור 1: סכמטי מייצג של התבנית הגנטית המינימלית והתהליך שהיא עוברת לאחר שלב ההגברה הראשוני של PCR. התבניות מתעכלות עם HindIII, עגולות עם ligase T4, ומוגברות עוד יותר עם φ29 פולימראז כדי ליצור concatemers גדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות התגובות נטולות התאים עם 5 ננומטר של פלסמיד (pJL1), 5 ננומטר של תבנית ליניארית (LET) וריכוזים משתנים של RCA לא מנוצל. RCA #1, #2 ו- #3 הכילו 0.3 μL, 0.6 μL ו- 0.9 μL (בהתאמה) של מוצר RCA לא שידן בתגובת 15 μL דגירה ב- 30 °C (n = 3). קווי שגיאה מייצגים ± 1 SD מהממוצע. ציר ה-y הוא פלואורסצנטיות, וציר ה-x הוא הזמן שחלף במהלך התגובה. הקינטיקה של ביטוי sfGFP מיוצגת ב -A) BL21 DE3 Star ו - (B) T7 SHuffle. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תגובות ללא תאים עם 5 ננומטר של SBT(n) LET וריכוזים משתנים של מוצר RCA לא מpurified. RCA ng ו pg תואמים את הריכוז של ה- DNA המשמש לביצוע הגברה מעגלית מתגלגלת. מוצר RCA לא שאושר שימש בתגובת 15 μL דגירה ב 30 °C (n = 3). קווי שגיאה מייצגים ± 1 SD מהממוצע. ציר ה-y הוא הספיגה ב-410 ננומטר, וציר ה-x הוא משך הזמן שחלף בבחיקה. התגובות בוצעו עבור (A) 4 שעות ו (B) 16 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: השוואה של ציר הזמן בין פרוטוקול שיבוט מסורתי פשוט לפרוטוקול RCA המכוסה כאן.

קובץ משלים: הקובץ המשלים מפרט את הרצפים. רצף #1 הוא sfGFP (999 זוגות בסיס) ורצף #2 הוא subtilisin BPN' (1344 bp). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

גן העניין יכול להיות כל חלבון רצוי, אבל עדיף להתחיל עם חלבון פלואורסצנטי ככתב נוח לקריאה בזמן אמת או נקודת קצה על קורא צלחת היטב עבור מאמצים חדשים של שיטה זו. עבור רצפי חלבון חדשים, להעתיק את רצף חומצת האמינו של החלבון הרצוי ולהדביק אותו לתוך כלי אופטימיזציה קודון הרצוי^61,62. בדרך כלל יש אורגניזמים זמינים רבים זנים של E. coli בכלי אופטימיזציה קודון, אבל בחירת האפשרות הכללית Escherichia coli יהיה מתאים. לאחר אופטימיזציה, בדוק שוב את הגן כדי להבטיח את אתר החיתוך שנבחר בעבר ורצפי פריימר אינם קיימים. אם כן, ניתן למטב את הרצף עד שהרצפים לא יהיו קיימים עוד. במצבים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להחליף את האתרים ההינדיים לחתוך עם אתר הגבלה שונה אם אופטימיזציה חוזרת באופן עקבי תוצאות באתר פנימי HindIII לחתוך. עדיף להשתמש באותו אתר לחתוך לעתים קרובות ככל האפשר כדי לשמור על התהליך סטנדרטי ולהפחית את העלות של שמירה על אנזימי הגבלה מרובים בהישג יד.

לפני תחילת ההגברה, בחר את ערכת ה- PCR המתאימה ביותר ל- LET. ניתן להגביר את ה-LET עם <1,000 זוגות בסיסים עם פולימראז טאק פשוט, בעוד ש-LET עם ≥ 1,000 זוגות בסיסים עשוי לדרוש פולימראז בעל אמינות גבוהה יותר⁶³. הגדר את הפרוטוקול להגברה על פי יצרן הערכה וטמפרטורת חישול של הפריימרים הרצויים. טמפרטורת חישול היא קריטית להגברה מוצלחת. כלל אצבע כללי הוא לבחור טמפרטורת חישול נמוכה ב -5 מעלות צלזיוס מהתמולית של הפריימרים. ישנם כלים מקוונים חינם שיספקו טמפרטורת חישול אופטימלית המבוססת על רצף הפריימרים⁵⁸. שימוש בטמפרטורת חישול נכונה הוא קריטי לייצור תבנית DNA באיכות גבוהה.

ביטוי גנים ללא תאים ראה רנסנס בשנים האחרונות בשל המהירות, הפשטות והתועלת שלו עבור אבי טיפוס ביולוגי סינתטי. עבודה זו התוותה שיטה להגברת המהירות והקלות בעת בדיקת ספרייה גדולה של חלבונים חדשים ופונקציונליים. בעוד ששיטות שיבוט מסורתיות יכולות להימשך ימים או שבועות, פרוטוקול זה יכול להיעשות בפחות מ- 24 שעות. טבלה 1 מתארת טווחי זמן אופייניים הן עבור השיבוט המסורתי והן עבור פרוטוקול RCA. שים לב שפרוטוקול השיבוט היה פשוט יותר, וכמה שלבים אופציונליים נותרו בחוץ, כגון בידוד ג'ל. טבלה 1 מתייחסת גם לפרוטוקולי העיכול הנפוצים של ההגבלה; ישנן שיטות שיבוט רבות אחרות, אך אלה דורשות פרק זמן דומה. הטווח העליון של פרוטוקול הגברה אנזימטי זה דורש פחות זמן מאשר הטווח התחתון של שיטת השיבוט, במיוחד כאשר שוקלים יום עבודה של 8 שעות. זאת בעיקר בשל הסרת דגירות לילה וחוסר אישור רצף. פרוטוקול RCA מבוסס כולו על PCR ו- RCA, הדורשים מיומנויות פחות מיוחדות מאשר טכניקות שיבוט, טרנספורמציה ותרבות תאים מסורתיות. שיטה זו הופכת את חופש הביטוי לתאים לנגיש למעבדות שאין להן ניסיון קודם בשיבוט או גישה להון הדרוש לשינוי צורה ולגידול תאים. שיטה זו מתאימה גם לפרויקטים המתמקדים בחלבונים ציטוטוקסיים, שבהם שיבוט והפצה של הגנים עם שיבוט מסורתי קשה בשל רעילות בתא החי. פרוטוקול RCA זה מסוגל גם להגביר כמויות קטנות מאוד של DNA מעגלי (פיקוגרמות של DNA) לרמות הדרושות עבור CFE. באיור 3B, תבנית ה-SBT(n) המעגלית מדוללת ל- 20 ננוגה/μL ו- 20 pg/uL לפני RCA. בעוד ששיעורי ההשפלה שנצפו היו שונים, שתי התגובות גרמו לאותה כמות של השפלת מצע תוך 10 דקות. השיטה המוצעת אינה מיועדת להחליף שיבוט; התפשטות plasmid יכול לייצר כמויות של DNA עבור גנים שאינם רעילים שלא ניתן להתאים. במקום זאת, זהו כלי אב טיפוס נוח בשלב סינון מסיבי של הספרייה (שלבים אנזימטיים מקובלים לאוטומציה עם מטפל נוזלים סטנדרטי) שיסייעו לזהות אילו רצפים יש לשכפל עבור אחסון בארכיון והתפשטות נוספת.

בעת עיצוב תגובה ללא תאים, יש גמישות רבה, אך ישנם כמה גורמים שיש לקחת בחשבון כדי להבטיח הצלחה. לתגובות קטנות יותר יש יחס שטח-פנים גדול יותר לנפח, וזה נהדר להחלפת גז, אבל התגובה צריכה לכסות לחלוטין את תחתית הבאר למדידות פלואורסצנטיות מדויקות. טמפרטורת התגובה יכולה גם להשתנות בהתאם לגן של עניין⁵⁹. ישנן אפשרויות מרובות עבור משתמשים כשמדובר בבחירה של מאגר^{אנרגיה 34,46}. מתכונים מסוימים יקרים יותר מאחרים, אך ההחלטה נותרת למשתמש. ישנם גם מקורות פוטנציאליים רבים עבור E. coli לחלץ³⁶. משתמשים צריכים להכיר את פרוטוקולי ייצור לחלץ ולהחליט מה הכי טוב למטרותיהם^{28,48,50,64,65,66,67}.

בעת שימוש RCA כדי להגביר תבניות עבור ביטוי חופש התא, הבחירה של זן חיידקי חשוב מאוד. פרופיל הביטוי נוטה להיות טוב יותר מזה של LETs. זן BL21 DE3 Star הפופולרי מטפל היטב זו, עם ביצוע RCA ~ 1.4x טוב יותר מאשר LET ואת pJL1 plasmid ביצועים ~ 1.2 פעמים טוב יותר מאשר ריכוז RCA הטוב ביותר(איור 2A). מצד שני, זנים מסוימים מציגים השפלה תבנית ולבצע גרוע בשל נוכחות של גרעינים מקומיים^23,28. במקרה זה, נראה כי זן SHuffle נהנה מתבנית RCA מוגברת. ספרות קודמת הראתה כי תמצית SHuffle אינה מבצעת היטב עם מוצרי PCR, אבל הריכוז הגבוה ביותר של מוצר RCA לא מנוצל המשמש במחקר זה עולה על pJL1 plasmid (איור 2B). הביטוי של SBT פונקציונלי(n) (איור 3) הוא דוגמה לחלבון ציטוטוקסי המיוצר בנוחות על ידי ללא תאים אך קשה לאב טיפוס בתאים חיים בשל רעילות (לא מסוגל לשכפל תבנית ביטוי זו ב plasmid ולהפיץ ב- E. coli). שלא כמו sfGFP, לא ניתן לצפות בפעילות SBT(n) לאחר 4 שעות בלבד של ביטוי (איור 3A). האות ניתן לזיהוי לאחר 16 שעות של ביטוי והתבגרות (איור 3B). ה- DNA הלא שאושר המשמש בדוגמאות אלה הגיע מ 100 μL, אשר היה ארבע 10 תגובות RCA μL מדולל בשילוב. מניה אחת זו יכולה לתמוך ב-333 תגובות ללא תאים אם רק באמצעות 0.30 μL לכל תגובה.

יש לחקור עוד יותר את התאימות של תבניות RCA עם CFE עם תמציות שונות. סיבוכים פוטנציאליים עם מוצרים ליניאריים עשויים להיות הקלה על ידי הוספת אוליגוס קצר המכיל את רצף E. coli chi או חלבון GamS^52,53. הספרות מציעה כי התוספת של צ'י אוליגוס יכול לספק הגנה גדולה יותר לתבניות ליניאריות מאשר חלבון GamS⁵³. אם משתמשים בתמצית הידועה כמספקת תשואות נמוכות מתבניות ליניאריות, על המשתמש לנתח את העלות של כל סוכן מגן ולהשתמש בתמצית המתאימה ביותר למטרותיהם. מגבלה נוספת היא חוסר היכולת להמיר ריכוזי תבנית RCA לאונח בשל אופיו של המתנשא המתקבל. משמעות הדבר היא שניתן להוסיף את אותו מספר של תבניות מינימליות בהתבסס על מסה, אך יהיו להן אורכי תמצית משתנים, דבר שעשוי להשפיע על רמות הביטוי. המחברים לא מצאו כי מדובר בבעיה בהקרנה/אב טיפוס שכן רמות הביטוי הממוצעות מכל באר זהות (שונות נמוכה), אך יכולות להוות בעיה אם היא באה לידי ביטוי בנפחים קטנים יותר (למשל, מיקרו-טיפות).

ביטוי גנים ללא תאים יש פוטנציאל לשמש ככלי משמעותי בתהליך עבודה של אב טיפוס של חלבון ותכנון-בונים-בדיקה. עם זאת, רוב זרימות העבודה של חופש התאים עדיין מסתמכות על פלסמידים מסורתיים כתבנית הגנטית. זה מאט את התהליך ומונע מחופש הביטוי התאי להיות מנוצל במלואו למטרות סינון / טיפוס. תבניות להגברה ולאחר מכן ביצוע RCA יכול לייצר במהירות מספיק תבניות גנטיות עבור תגובות רבות, לייצר מספיק חלבון עבור אפיון במורד הזרם ובדיקות פונקציונליות.

נייג'ל ראול מכהן בוועדה המדעית המייעצת של BigHat Biosciences Inc., חברה המשתמשת במערכות ללא תאים לתכנון נוגדנים.

המחברים מכירים NIH 1R35GM138265-01 ו- NSF 2029532 לתמיכה חלקית בפרויקט זה.