Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Este protocolo descreve o desenho de um modelo de DNA mínimo e os passos para a amplificação enzimática, permitindo a prototipagem rápida de proteínas assayable em menos de 24 h usando a expressão livre de células. Depois de receber DNA de um fornecedor, o fragmento genético é amplificado, cortado, circularizado e crio-bancário. Uma pequena quantidade do DNA bancado é então diluída e amplificada significativamente (até 10⁶x) usando amplificação do círculo de rolamento isotemal (RCA). A RCA pode produzir quantidades de microgramas do modelo de expressão mínima dos níveis de picograma do material inicial (níveis de mg se todos os fragmentos sintéticos iniciais forem usados). Neste trabalho, uma quantidade inicial de 20 pg resultou em 4 μg do produto final. O produto RCA resultante (concatemer do modelo mínimo) pode ser adicionado diretamente a uma reação livre de células sem etapas de purificação. Devido a este método ser inteiramente baseado em PCR, ele pode permitir futuros esforços de triagem de alto rendimento quando juntamente com sistemas automatizados de manuseio de líquidos.

A expressão genética livre de células (CFE) emergiu como uma ferramenta poderosa com muitas aplicações. Tais aplicações incluem detecção de doenças^1,2,3,4,5,6, micronutrientes e detecção de moléculas pequenas^{7,8,9,10,11,12}, biomanufacturing^{13,14,15,16,17 ,18}, educação^19,20,21, fabricação de proteínas difíceis de fabricação^{17,22,23,24,25,26,27}, e triagem variante^{23,28,29,30,31,32 ,33}. Isso se deve à natureza aberta dos sistemas livres de células e à flexibilidade que eles conferem. Muitos artigos de grande revisão oferecem educação histórica e perspectivas futuras sobre a tecnologia^{34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}.

Uma reação típica sem células consiste em três componentes principais: extrato celular, mistura de energia e modelo genético. O extrato de célula ativa contém todas as máquinas necessárias para transcrição e tradução (TXTL) e pode ser processado de várias maneiras³⁶. Intermediários glicólticos, eletrólitos, aminoácidos e cofatores na mistura de energia suportam o processo TXTL. É uma grande fonte de variabilidade em experimentos sem células⁴⁵ e pode ser preparado de muitas maneiras^34,46. A preparação do modelo genético tem visto menos melhorias desde que os métodos tradicionais de clonagem resultam em plasmídeos com excelentes características de expressão. A desvantagem desses métodos tradicionais é o tempo de reviravolta e a quantidade de conhecimento biológico necessários para construí-los e propagar- los. Os esforços recentes de otimização resultaram em fluxos de trabalho simples de 24 horas para a preparação do extrato^{celular 47,48} que podem ser realizados em paralelo com a preparação do mix de energia^49,50. No entanto, a clonagem tradicional adiciona vários dias à linha do tempo de prototipagem do CFE(Tabela 1)²³. Produtos PCR rapidamente amplificados do fragmento genético comercial podem ser usados^{diretamente 51}, mas isso limita o número de experimentos de prototipagem à medida que apenas 1 μg de DNA é produzido, o que corresponde a aproximadamente cinco reações (volumes tradicionais de 15 μL). Com essas etapas adicionais de circularização e amplificação isotérmica, quantidades maiores do que miligramas do DNA são possíveis (~5.000 reações por 1 mg). Isso aumenta drasticamente o número de testes que podem ser feitos em triagem de alta produtividade de proteínas ou redes enzimáticas combinatórias (engenharia metabólica livre de células); também permite a preservação efetiva da biblioteca de modelos lineares como DNA de alta concentração. Além disso, uma quantidade aumentada de modelo seria necessária para protótipo de quantidades maiores de proteína necessárias para aplicações científicas materiais (fibras à base de proteínas e hidrogéis). Algumas limitações de modelos lineares podem ser superadas usando um extrato de BL21 DE3 Star ou usando métodos recentemente descobertos para proteger modelos lineares da degradação^52,53,54. No entanto, isso não aborda ter estoques limitados de DNA produzido pelo fornecedor para amplificação de PCR ou a questão da perícia biológica e equipamentos necessários para a clonagem.

Este trabalho apresenta um protocolo explicitamente projetado para aumentar a quantidade de modelo de expressão que pode ser obtido a partir de pequenas quantidades de fragmentos genéticos produzidos por fornecedores (tipicamente 500-1000 ng de pó liofilizado). O método descrito não requer as habilidades necessárias para realizar clonagem tradicional em plasmídeos ou transformação e propagação em células vivas. Ao receber um fragmento genético no e-mail, o usuário pode produzir modelos suficientes para muitas reações livres de células, empregando amplificação do círculo de rolamento isoterânmico (RCA) (Figura 1)²³. Embora a quantidade de DNA recebida do fornecedor possa ser suficiente para esforços limitados de triagem, ele é rapidamente esgotado, e a recodência de fragmentos genéticos é demorada e cara. O método também é especialmente adequado para genes tóxicos e difíceis de clonar em E. coli.

1. Projetando o fragmento genético

NOTA: O fragmento genético deve ter todos os elementos genéticos necessários para transcrição/tradução, incluindo promotor, site de ligação ribossosome (RBS), codon inicial, gene de interesse e exterminador. Embora o exterminador não seja necessário para um modelo de expressão linear (LET), será importante se o usuário decidir inserir a sequência em um plasmídeo. Estas sequências foram levantadas do pJL1-sfGFP plasmid⁵⁵ (presente do laboratório de Michael Jewett), que usa um promotor T7. Além desses elementos genéticos necessários, um local de corte de enzima de restrição é adicionado seis pares de base antes do promotor (local de corte de 5') e outros seis pares de base após o exterminador (local de corte de 3'), neste caso usando hindiii (outras enzimas de restrição podem ser usadas, mas é útil padronizar as sequências com uma enzima de restrição de alta fidelidade para reduzir o número necessário para manter na biblioteca). Os sites primer são adicionados dez pares de base a montante do site de corte de 5' e dez pares de base a jusante do local de corte de 3', neste caso usando sequências padronizadas de primer M13 (primers são itens de estoque baratos). O site de enzimas de restrição e os primers utilizados ficam a critério do usuário. No entanto, o usuário deve garantir que as sequências não estejam presentes em nenhum outro lugar do modelo (não quero criar cortes indesejados ou sites de iniciação de amplificação). As sequências dos modelos utilizados neste trabalho são detalhadas no material suplementar. Essas etapas são usadas para modificar a partir deste modelo base.

1. Determine o gene desejado a ser expresso e obtenha a sequência de aminoácidos ou a sequência genética se tiver sido expresso em E. coli.
2. Se for uma sequência de aminoácidos, realize a otimização de codon para E. coli usando uma das muitas ferramentas padrão de fornecedor⁵⁶. Se usar o modelo fornecido no suplemento, certifique-se de que a sequência otimizada não tenha nenhum site de restrição hindiII (AAGCTT). No caso disso, continue a otimizar a sequência até que não haja mais um site hindiii.
3. Copie a sequência e cole-a no modelo fornecido para a sequência suplementar #1, onde o gene de interesse é indicado. Se expressar sfGFP, use a sequência suplementar #1 como está. Se expressar subtilisina, use a sequência suplementar #2 como está.
4. Peça o modelo mínimo e os primers necessários do serviço de síntese de DNA preferido.

2. Reutilizar o fragmento genético e os primers

NOTA: Após o recebimento do fragmento genético, siga os protocolos do fabricante para a ressuspensão ou use este guia simples para criar um estoque de DNA.

1. Centrifugar o tubo (300 x g por 5 s) para coletar a pelota de DNA na parte inferior.
2. Adicione água destilada dupla (ddH₂O) para fazer uma concentração final de 10 ng/μL de modelo de DNA.
3. Vortex a solução em uma configuração média para 5-10 s.
4. Dissolva a pelota inteira incubando a 50 °C por 20 min.
5. Brevemente vórtice novamente
6. Centrifugar a 300 x g por 5 s para coletar a solução na parte inferior do tubo.
7. Armazene a -20 °C ou use em PCR.
8. Prepare um estoque de primer de 100 μM reutilizando os primers em água sem nuclease. Para determinar a quantidade de água a adicionar, multiplique o número de nanomoles de primer liophilizado por 10. Por exemplo, se o tubo contiver 45 nM de primer liofilizado, adicione 450 μL de ddH₂O e o vórtice da solução.
9. Armazene as soluções de estoque de primer a -20 °C ou continue a realizar a amplificação.

3. Amplificando o fragmento genético via PCR

NOTA: Decida qual kit PCR é adequado para o gene de interesse. Genes menores (<1.000 kb) podem ser mais favoráveis a uma polimerase Taq mais barata, enquanto genes maiores (≥1.000 kb) podem se beneficiar de polimerase de alta fidelidade para reduzir erros. É importante notar que essa amplificação inicial do PCR não é necessária se o usuário não estiver preocupado em preservar o fragmento genético inicial (fornece múltiplas tentativas de circularização e permite estudos comparativos do produto LET vs. RCA). Também é importante notar que este LET amplificado pcr pode ser usado diretamente em reações; no entanto, como mencionado na introdução, só permitiria um número limitado de reações se as etapas de amplificação adicionais fossem desconsideradas. A digestão e a ligadura podem ser realizadas no fragmento genético ressuspended^{diretamente 57} (se for certo, eles não precisarão de mais LET para realizar estoques adicionais de circularização). Se este for o caso, pule a seção 3 e continue até a seção 4. Para realizar PCR, siga estas etapas.

1. Use os estoques de 100 μM da etapa 2.8 para criar soluções de trabalho de 10 μM. Muitos protocolos de kit PCR exigem soluções de 10 μM de primers.
2. Programe o cicloviário térmico para conduzir a reação de acordo com os protocolos do fabricante do kit. Diferentes kits exigem parâmetros de ciclismo ligeiramente variados. Para o kit listado na Tabela de Materiais,as condições são de 94 °C para 30 s de desnaturação inicial; 30 ciclos de 94 °C para 30 s de desnaturação, 45 °C para 30 s de ressarem e 68 °C para 60 s de extensão; com extensão final a 68 °C por 5 min; e, finalmente, uma espera indefinida de 10 °C.
   1. Certifique-se de selecionar o tempo correto de alongamento (variável dependendo do comprimento do gene a ser amplificado). Tenha um tempo de alongamento de 1 min para cada 1.000 bp.
   2. Certifique-se de inserir a temperatura correta de ressarcial para os primers. Use uma calculadora Tm on-line que usa ambos os primers como entradas para determinar a melhor temperatura de ressarcial⁵⁸. Uma temperatura de 45 °C é suficiente ao usar primers M13.
   3. Ao determinar o número de ciclos, consulte o protocolo do fabricante, mas 30 ciclos muitas vezes resultarão em amplificação suficiente.
3. Se estiver executando PCR, descongele e vórtice os dNTPs. Use o buffer PCR fornecido no kit.
4. Em um único tubo PCR, combine todos os componentes do kit conforme indicado no protocolo do fabricante. Para garantir a amplificação bem sucedida, adicione 1 μL de estoque de DNA resuspendido (etapa 2.6).
5. Homogeneize suavemente a mistura por vórtice no ajuste médio para 5-10 s. Alternativamente, pipeta metade do volume para cima e para baixo 10-20 vezes para vórtice.
6. Execute a reação do PCR.
7. Se o protocolo PCR não incluir uma etapa final de resfriamento, permita que a reação esfrie por 5 min a 10 °C antes de remover para conduzir a condensação para a parte inferior do tubo.
8. Purifique a reação usando um kit de limpeza pcr seguindo as instruções do fornecedor.
   1. Em um tubo de 1,5 mL, adicione tampão de ligação de DNA e amostra pcr a uma proporção de 5:1, respectivamente.
   2. Transfira esta mistura para a coluna de giro e centrífuga a 16.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
   3. Adicione 200 μL de tampão de lavagem de DNA à coluna e incubar à temperatura ambiente por 1 min.
   4. Centrifugar por 1 min a 16.000 x g e descartar o fluxo.através.
   5. Repetir as etapas 2.8.3 e 2.8.4 sem a etapa de incubação de 1 min.
   6. Centrifugar por um adicional de 1-2 min a 16.000 x g para remover qualquer buffer restante.
   7. Elute o DNA em 46 μL de ddH₂O.
9. Quantifique o DNA purificado usando um espectotômetro.
10. Armazene o DNA purificado a -20 °C ou prossiga para o próximo passo.

4. Digestão e circularização

NOTA: Uma ampliação adicional pode ser alcançada através da circularização do DNA seguido pela RCA. Digerir o DNA para preparar o modelo para circularização. Isso removerá as sequências de primer e criará extremidades pegajosas nas extremidades de 5' e 3' do modelo. Reanexe estes fins através da reação de ligadura.

1. Em um tubo PCR, combine 5 μL do buffer necessário, 20 U de HindIII e 45 μL do DNA purificado da etapa 3.8.
2. Homogeneize suavemente esta mistura com uma pipeta.
3. Incubar a mistura em um cicloviário térmico por 15 min a 37 °C.
4. Inativar o calor em hindiii incubando por 20 min a 80 °C.
5. Deixe a reação esfriar até 10 °C antes de remover para conduzir a condensação para a parte inferior do tubo.
6. Adicione 5 μL de tampão de ligase T4 e 800 U de liga ligase T4 ao DNA recém-digerido.
   1. Use ligadura T7, se desejar.
7. Homogeneize suavemente esta mistura com uma pipeta.
8. Incubar a mistura por 1h a 25 °C para realizar a reação de circularização.
9. Purifique a reação usando um kit de limpeza pcr seguindo as instruções do fornecedor. Use o mesmo protocolo detalhado na etapa 3.8.
10. Quantifique o DNA usando um espectrômetro. Os valores esperados são ~20 ng/μL.
11. Armazene a -20 °C ou prossiga para a próxima etapa.

5. Amplificação do círculo de rolamento isotérmico

NOTA: A amplificação do círculo de rolamento (RCA) pode ser realizada usando um kit comercial ou com componentes adquiridos individualmente. Seguir o protocolo do fabricante garantirá uma amplificação bem sucedida. Os kits geralmente contêm um buffer de amostra, tampão de reação e polimerase de deslocamento de fios, como φ29 polimerase. Múltiplos tubos de reação podem ser combinados para produzir uma grande quantidade de DNA para a expressão livre de células (4 μg a partir de 20 pg de material inicial). O protocolo a seguir funciona de forma eficiente.

1. Em um único tubo, misture 20 μL do buffer amostral, 20 μL do tampão de reação, 0,8 μL da enzima e 1 μL do modelo de expressão circular (CET) da etapa 4.9.
   NOTA: Este terá uma massa total de DNA de ~20 ng, mas a RCA pode trabalhar com quantidades de picograma, permitindo assim a diluição da CET e amplificação enzimática extrema se houver uma necessidade significativa de material na triagem de alto rendimento.
2. Homogeneize a mistura com uma pipeta e alíquota de 10 μL da mistura em quatro tubos separados.
3. Incubar a 30 °C para 4-18 h.
4. O calor inativa a enzima incubando a 65 °C por 10 minutos. Reduza a temperatura para 12 °C por 5 minutos para incentivar a condensação na parte inferior do tubo.
   NOTA: É mais fácil combinar todas as etapas de temperatura em um protocolo automatizado em um cicloviário térmico.
5. Diluir a solução resultante adicionando 15 μL de ddH₂O a cada tubo.
6. Combine todos os tubos e adicione diretamente a uma reação livre de células.
7. Se desejar, use um kit de limpeza PCR para purificar o produto e elute-lo em 36 μL de ddH₂O para quantificar. Certifique-se de que a concentração do modelo é ~100 ng/μL.

6. Reação sem células

NOTA: Realize a expressão livre de células combinando buffer de energia, extrato e modelo RCA. Uma reação típica sem células usando o buffer de energia PANOx-SP consiste em 1,2 mM ATP, 0,85 mM cada um de GMP, UMP e CMP, 30 mM phosphoenolpyruvate, 130 mM glutamato de potássio, 10 mM glutamato de amônio, 12 mM glutamato de magnésio, 1,5 mM de espertemidina, 1 mM putrescina, 34 μg/mL de ácido foliônico, 171 μg/mL de mistura de E. coli tRNA, 34 μg/mL de ácido foliônico, 171 μg/mL de mistura de E. coli tRNA, 1 mM 2 mM cada um dos 20 aminoácidos não rotulados, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Coenzyme A (CoA), 4 mM de oxalato de potássio, 57 mM tampão HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% do extrato de E. coli e quantidades variáveis de DNA^23,49. O volume de reação pode variar, mas as reações de 15 μL podem economizar no uso de reagentes e são pequenas o suficiente para uso em uma microplacão de parede preta 384^49,50.

1. Se expressar uma proteína fluorescente como o sfGFP, prepare um leitor de placas para ler na excitação/emissão desejada, temperatura e agitação.
2. Se usar uma placa de 384 poços, aliquot 60 μL de H₂O nos poços que beiram uma amostra vazia bem para manter a umidade e reduzir o efeito de borda.
3. Adicione os vários componentes necessários em um tubo para cada amostra. Adicione o suficiente para realizar triplicados. As réplicas dentro da placa podem ajudar a identificar as causas da variabilidade.
   1. Adicione o extrato, o tampão de energia e, em seguida, o DNA.
   2. Diluir ao volume final desejado com ddH₂O.
4. Misture bem esta solução ao pipetar metade do volume da solução para cima e para baixo 10-20 vezes.
5. Transfira a mistura de reação em alíquotas de 15 μL para os poços desejados na placa de microtítiter.
6. Sele a placa com uma máquina de selar incolor para manter a umidade e evitar a evaporação.
7. Coloque a placa selada no leitor de placas e deixe a reação completa.
   1. Se expressar uma proteína que não tenha a capacidade de ser monitorada ao vivo, use outro aparelho controlado pela temperatura, como um termobloco para incubar a placa.

7. Ensaio de subtilisina

NOTA: Se expressar o gene de subtilisina BPN' (SBT(n)) na Sequência Suplementar n2,siga este protocolo para avaliar a atividade.

1. Prepare uma solução de estoque de 10 μM de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide em dimetilformamida (DMF).
2. Defina um leitor de placas para medir a absorvância a 410 nm a cada 20 s por 10 minutos, mantendo uma temperatura de 25 °C.
3. Em uma placa de fundo plano, incolor de 96 poços, alíquota de 94 μL de ddH₂O e 1 μL de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide a partir do passo 7.1.
4. Adicione 5 μL da reação sem células terminada da etapa 6.7 e leia usando um leitor de placa definido para o protocolo descrito na etapa 7.2.

A expressão de sfGFP dos modelos RCA foi comparável à do plasmídeo pJL1 ao usar apenas 0,30 μL de DNA RCA não purificado em uma reação de 15 μL(Figura 2A). Na verdade, duplicar e triplicar a quantidade de modelo parece não oferecer nenhum benefício no extrato BL21 DE3 Star, sugerindo níveis já saturados do modelo a 0,30 μL por reação. Por outro lado, parece haver um benefício para aumentar a quantidade de modelo RCA quando adicionado ao extrato celular originado da cepa SHuffle(Figura 2B)²⁸. Para algumas proteínas, os resultados podem ser observados muito rapidamente, o que comprime todo o fluxo de trabalho (amplificação e ensaio) a menos de 24 h. No entanto, algumas proteínas requerem temperatura mais baixa ou têm tempos de dobra mais lentos, o que aumentará o tempo até que os resultados sejam obtidos, mas afetará o fluxo de trabalho aqui apresentado. Isso pode ser observado ao expressar subtilisina (SBT(n)) onde o ensaio após 4h de expressão não foi longo o suficiente para o vencimento do SBT(Figura 3A,exemplo de resultado fracassado). Permitir que a reação continue até 16h pode levar a níveis detectáveis do SBT(n) (Figura 3B). Essa melhora pode ser dependente da temperatura, como observado na literatura onde foram exploradas condições de temperatura otimizadas^59,60.

Figura 1: Um esquema representativo do modelo genético mínimo e do processo que ele sofre após a etapa inicial de amplificação do PCR. Os modelos são digeridos com hindiII, circularizados com liga ligase T4, e ainda amplificados com polimerase φ29 para criar grandes concatemeras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados das reações livres de células com 5 nM não purificados de plasmídeo (pJL1), 5 nM de modelo linear (LET) e concentrações variadas de RCA não purificada. RCA #1, #2 e #3 continham 0,3 μL, 0,6 μL e 0,9 μL (respectivamente) de produto RCA não purificado em uma reação de 15 μL incubada a 30 °C (n = 3). As barras de erro representam ± 1 SD da média. O eixo y é a fluorescência, e o eixo x é o tempo que passou durante a reação. As cinéticas da expressão sfGFP estão representadas em (A) BL21 DE3 Star e (B) T7 SHuffle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Reações sem células com 5 nM de SBT(n) LET e concentrações variadas de produto RCA não purificado. RCA ng e pg correspondem à concentração do DNA utilizado para realizar a amplificação do círculo de rolamento. O produto RCA não purificado foi utilizado em uma reação de 15 μL incubada a 30 °C (n = 3). As barras de erro representam ± 1 SD da média. O eixo y é a absorvância a 410 nm, e o eixo x é a quantidade de tempo que passou no ensaio. As reações foram realizadas para (A)4 h e (B) 16 h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Uma comparação da linha do tempo entre um protocolo de clonagem tradicional simplificado e o protocolo RCA aqui abordado.

Arquivo suplementar: O arquivo suplementar lista as sequências. A sequência #1 é sfGFP (999 pares de base) e a sequência #2 é subtilisina BPN' (1344 bp). Clique aqui para baixar este Arquivo.

O gene de interesse pode ser qualquer proteína desejada, mas é melhor começar com uma proteína fluorescente como repórter conveniente para leitura em tempo real ou ponto final em um leitor de placas de poço para novos adotantes deste método. Para novas sequências proteicas, copie a sequência de aminoácidos da proteína desejada e cole-a na ferramenta de otimização de codon desejada^61,62. Geralmente existem muitos organismos disponíveis e cepas de E. coli na ferramenta de otimização do codon, mas escolher a opção geral Escherichia coli será adequado. Após a otimização, verifique novamente o gene para garantir que o local de corte previamente escolhido e as sequências de primer não estejam presentes. Se assim for, a sequência pode ser otimizada até que as sequências não estejam mais presentes. Em algumas situações, pode ser necessário substituir os locais de corte hindiII por um site de restrição diferente se a otimização repetida resultar consistentemente em um local interno de corte hindiII. É melhor usar o mesmo site de corte o mais frequentemente possível para manter o processo padronizado e reduzir o custo de manter múltiplas enzimas de restrição em mãos.

Antes de iniciar a amplificação, escolha o kit PCR que melhor se adapte ao LET. Um LET com <1.000 pares base pode ser amplificado com uma polimerase Taq simples, enquanto um LET com ≥ 1.000 pares de base pode exigir uma polimerase de maior fidelidade⁶³. Configure o protocolo de amplificação de acordo com o fabricante do kit e a temperatura de ressarcial dos primers desejados. A temperatura de ressarcial é fundamental para uma amplificação bem sucedida. Uma regra geral é selecionar uma temperatura de ressaramento que seja 5 °C menor que a Tm dos primers. Existem ferramentas online gratuitas que fornecerão uma temperatura de ressarcial otimizada com base na sequência dos primers⁵⁸. O uso da temperatura correta de ressaramento é fundamental para produzir um modelo de DNA de alta qualidade.

A expressão genética livre de células tem visto um renascimento nos últimos anos devido à sua velocidade, simplicidade e utilidade para a prototipagem da biologia sintética. Este trabalho esboçou um método para aumentar a velocidade e a facilidade ao testar uma grande biblioteca de novas proteínas funcionais. Embora os métodos tradicionais de clonagem possam levar dias ou semanas, este protocolo pode ser feito em menos de 24 horas. A tabela 1 descreve faixas de tempo típicas tanto para a clonagem tradicional quanto para o protocolo RCA. Observe que o protocolo de clonagem foi simplificado, e algumas etapas opcionais foram deixadas de fora, como o isolamento do gel. A Tabela 1 também refere-se apenas aos protocolos comuns de digestão de restrição; existem muitos outros métodos de clonagem, mas estes requerem uma quantidade de tempo semelhante. A faixa superior deste protocolo de amplificação enzimática requer menos tempo do que a faixa inferior do método de clonagem, especialmente quando se considera uma jornada de trabalho de 8 horas. Isso se deve, em grande parte, à remoção de incubações noturnas e à falta de confirmação de sequenciamento. O protocolo RCA é baseado inteiramente em PCR e RCA, que exigem habilidades menos especializadas do que as técnicas tradicionais de clonagem, transformação e cultura celular. Esse método torna a livre expressão celular acessível para laboratórios que não têm experiência prévia em clonagem ou acesso ao capital necessário para transformar e cultivar células. Este método também é adequado para projetos focados em proteínas citotóxica, onde a clonagem e propagação dos genes com clonagem tradicional é difícil devido à toxicidade na célula viva. Este protocolo RCA também é capaz de amplificar quantidades muito pequenas de DNA circular (picogramas de DNA) aos níveis necessários para CFE. Na Figura 3B,o modelo circularizado do SBT(n) foi diluído para 20 ng/μL e 20 pg/uL antes da RCA. Embora as taxas observadas de degradação tenham sido diferentes, ambas as reações resultaram na mesma quantidade de degradação do substrato dentro de 10 minutos. O método proposto não se destina a substituir a clonagem; a propagação plasmida pode produzir quantidades de DNA para genes não tóxicos que não podem ser correspondidos. Em vez disso, esta é uma ferramenta de prototipagem conveniente em uma fase maciça de triagem de biblioteca (etapas enzimáticas são favoráveis à automação com manipulador de fluidos padrão) que ajudariam a identificar quais sequências devem ser clonadas para arquivamento e propagação posterior.

Ao projetar uma reação livre de células, há muita flexibilidade, mas há alguns fatores que devem ser levados em consideração para garantir o sucesso. Reações menores têm uma maior relação superfície/volume, o que é ótimo para a troca de gás, mas a reação precisa cobrir completamente a parte inferior do poço para medições precisas de fluorescência. A temperatura da reação também pode variar dependendo do gene de interesse⁵⁹. Existem várias opções para os usuários quando se trata da seleção de um buffer de energia^34,46. Algumas receitas são mais caras que outras, mas a decisão é deixada para o usuário. Há também muitas fontes potenciais para o extrato de E. coli ³⁶. Os usuários devem se familiarizar com protocolos de produção de extrato e decidir qual é o melhor para seus propósitos^{28,48,50,64,65,66,67}.

Ao usar o RCA para amplificar modelos para a expressão livre de células, a escolha da cepa bacteriana é muito importante. O perfil de expressão tende a ser melhor do que o dos LETs. A popular cepa BL21 DE3 Star lida bem com isso, com RCA executando ~1,4x melhor que o LET e o plasmid pJL1 com desempenho ~1,2x melhor que a melhor concentração de RCA(Figura 2A). Por outro lado, algumas cepas apresentam degradação do modelo e têm um desempenho ruim devido à presença de núcleos nativos^23,28. Neste caso, parece que a cepa SHuffle se beneficia de um modelo RCA aumentado. A literatura anterior mostrou que o extrato de SHuffle não tem bom desempenho com produtos pcr, mas a maior concentração de produto RCA não purificado utilizado neste estudo superou o plasmídeo pJL1 (Figura 2B). A expressão funcional sbt(n) (Figura 3) é um exemplo de uma proteína citotóxica que é convenientemente feita por células livres de células, mas difícil de protótipo em células vivas devido à toxicidade (incapaz de clonar este modelo de expressão em plasmídeo e propagar em E. coli). Ao contrário do SFFP, a atividade do SBT(n) não pode ser observada após apenas 4h de expressão(Figura 3A). O sinal é detectável após 16h de expressão e maturação(Figura 3B). O DNA não purificado usado nestes exemplos veio de 100 μL, que foi quatro reações RCA de 10 μL diluídas e combinadas. Este estoque pode suportar 333 reações livres de células se usar apenas 0,30 μL por reação.

A compatibilidade dos modelos de RCA com CFE precisa ser mais explorada com vários extratos. Complicações potenciais com produtos lineares podem ser aliviadas adicionando oligos curtos contendo a sequência E. coli chi ou a proteína GamS^52,53. A literatura sugere que a adição de oligos chi pode fornecer maior proteção aos modelos lineares do que a proteína GamS⁵³. Se usar um extrato conhecido por fornecer baixos rendimentos de modelos lineares, o usuário deve analisar o custo de cada agente protetor e usar aquele que melhor se adequa aos seus propósitos. Outra limitação é a incapacidade de converter concentrações de modelo RCA em molaridade devido à natureza do concatemer resultante. Isso significa que pode-se adicionar o mesmo número de modelos mínimos com base na massa, mas eles terão comprimentos de concatemer variados, o que pode afetar os níveis de expressão. Os autores não descobriram que isso é um problema na triagem/prototipagem, pois os níveis médios de expressão de cada poço são os mesmos (baixa variância), mas podem ser um problema se expressarem em volumes menores (por exemplo, microdroplets).

A expressão genética livre de células tem o potencial de ser usada como uma ferramenta significativa em prototipagem de proteínas e fluxos de trabalho de teste de construção de design. No entanto, a maioria dos fluxos de trabalho de liberdade celular ainda dependem dos plasmídeos tradicionais como modelo genético. Isso retarda o processo e impede que a expressão livre de células seja utilizada em sua extensão máxima para fins de triagem/prototipagem. Amplificar modelos e realizar posteriormente RCA pode produzir rapidamente modelos genéticos suficientes para muitas reações, produzindo proteína suficiente para caracterização a jusante e testes funcionais.

Nigel Reuel atua no conselho científico da BigHat Biosciences Inc., uma empresa que usa sistemas livres de células para o design de anticorpos.

Os autores reconhecem que o NIH 1R35GM138265-01 e o NSF 2029532 para apoio parcial deste projeto.