Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Büyüme Faktörü β (TGFβ)/Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyalinin dönüştürülmesi, vaskülür sisteminin gelişimi ve homeostazı sırasında sıkı bir şekilde düzenlenir ve dengelenir Bu nedenle, bu sinyal yolundaki deregülasyon pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi ve ateroskleroz gibi ciddi vasküler patolojilerle sonuçlanır. Kan damarlarının en iç tabakası olarak endotel hücreleri (VC' ler) sürekli olarak sıvı kesme stresine (SS) maruz kalır. Anormal sıvı SS paternlerinin, diğer uyaranlarla birlikte aterogenez indükleyen TGFβ/BMP sinyalini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla ilgili olarak, ateroprotektif, yüksek laminar SS bu sinyali azaltırken, ateroprotektif, düşük laminar SS'nin TGFβ/ BMP sinyalini artırdığı bulunmuştur. Bu yolların aktivasyonunu verimli bir şekilde analiz etmek için, piyasada bulunan bir pnömatik pompa sistemi ve yakınlık ligasyon tahlilini (PLA) kullanarak düşük laminar SS ve yüksek laminar SS koşulları altında transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumunu araştırmak için bir iş akışı tasarladık.

Aktif TGFβ/BMP-sinyalizasyon, iki düzenleyici SMAD'den (R-SMAD) oluşan trimerik SMAD komplekslerinin oluşumunu gerektirir; SMAD2/3 ve SMAD1/5/8 sırasıyla TGFβ ve BMP sinyalizasyon için) ortak bir arabulucu SMAD (ortak SMAD; SMAD4). Trimerik SMAD kompleksinin farklı alt birimlerini, yani R-SMAD/co-SMAD veya R-SMAD/R-SMAD'ı hedefleyen PLA kullanılarak, aktif SMAD transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumu floresan mikroskopisi kullanılarak nicel ve mekansal olarak ölçülebilir.

Seri olarak bağlanabilen 6 küçük paralel kanallı akış slaytlarının kullanımı, transkripsiyon faktörü karmaşık oluşumunun araştırılmasına ve gerekli kontrollerin dahil edilmesine olanak tanır.

Burada açıklanan iş akışı, farklı sıvı SS koşullarında SMAD'lerin diğer transkripsiyon faktörlerine veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine yakınlığını hedefleyen çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Burada sunulan iş akışı, VC'lerde sıvı SS kaynaklı TGFβ/BMP sinyalini hem nicel hem de mekansal olarak incelemenin hızlı ve etkili bir yolunu göstermektedir.

Dönüşen büyüme faktörleri beta (TGFβ) süper ailenin proteinleri, TGFβs, kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) ve Activins1,2 dahil olmak üzere çeşitli üyelere sahip pleiotropik sitokinlerdir. Ligand bağlama, fosforilasyona ve böylece sitosolik düzenleyici SMAD'nin (R-SMAD) aktivasyonuna yol açan reseptör oligomerlerinin oluşumuna neden olandır. Ligandların alt ailesine bağlı olarak, farklı R-SMAD'ler ^{etkinleştirilir1,2}. TGFβs ve Activins esas olarak SMAD2/3 fosforilasyonuna neden olurken, BMP'ler SMAD1/5/8 fosforilasyona neden olur. Bununla birlikte, BMP'lerin ve TGFβs/Activins'in ^de ilgili diğer alt ailenin R-SMAD'lerini etkinleştirdiğine dair kanıtlar vardır, 'yanal sinyal'3,4,5,6,7,8 olarak adlandırılan bir süreçte ve her iki SMAD1/⁵ ve SMAD2/3, ^üyeden oluşan karışık SMAD kompleksleri vardır. . İki aktif R-SMAD daha sonra ortak mediatör SMAD4 ile trimerik kompleksler oluşturur. Bu transkripsiyon faktörü kompleksleri daha sonra çekirdeğe yerle bir olabilir ve hedef genlerin transkripsiyonunu düzenleyebilir. SMAD'ler çeşitli transkripsiyonal ko-aktivatörler ve yardımcı baskılayıcılarla etkileşime girebilir ve bu da hedef genleri düzenleme olanaklarının çeşitlendirilmesine yol ^açabilir10. SMAD sinyalinin deregülasyonunun çeşitli hastalıklarda ciddi etkileri vardır. Buna paralel olarak dengesiz TGFβ/BMP sinyali pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi veya ateroskleroz3,11,12,13,14 gibi ciddi ^damar patolojilerine yol açabilir.

Endotel hücreleri (VC' ler) kan damarlarının en iç tabakasını oluşturur ve bu nedenle kanın viskoz akışı tarafından uygulanan sürtünme kuvveti olan kesme stresine (SS) maruz kalır. İlginçtir ki, vaskülatın yüksek düzeyde üniforma, laminar SS'ye maruz kalan kısımlarında bulunan VC'ler homeostatik ve sessiz bir durumda tutulur. Buna karşılık, düşük, homojen olmayan SS deneyimine sahip VC'ler, örneğin bifurkasyonlarda veya aort kemerinin daha az eğriliğinde, proliferatiftir ve enflamatuar yolları aktive ^eder15. Buna karşılık, işlevsiz EC siteleri ateroskleroz geliştirmeye eğilimlidir. İlginçtir ki, bu ateropron alanlarındaki VC'ler anormal derecede yüksek aktif SMAD2/3 ve SMAD1/^516,17,18 seviyeleri gösterir. Bu bağlamda, gelişmiş TGFβ/BMP sinyalinin aterosklerotik lezyonların gelişiminde erken bir olay olduğu ^{saptanmıştır19} ve BMP sinyaline müdahalenin damar iltihabını, aterom oluşumunu ve ilişkili kireçlenmeyi belirgin şekilde azalttığı ^{bulunmuştur20}.

Yakınlık Ligasyon Tahlil (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde incelemek için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir21,22. Hedef proteinleri birbirine bağlayabilen farklı türlerdeki antikorların özgüllüğüne dayanır ve endojen protein etkileşimlerinin tek hücre düzeyinde son derece spesifik olarak tespit edilmesine izin verir. Burada, primer antikorların tespite izin vermek için 40 nm'den daha az bir mesafede hedef epitoplarına bağlanmaları ^gerekir23. Bu nedenle PLA, endojen protein etkileşimlerini tespit etmek için birkaç milyon hücreye ihtiyaç duyulan geleneksel eş-immüno-immün premünipitasyon yaklaşımları üzerinde büyük ölçüde faydalıdır. PLA'da, DNA parçalarına (Artı ve Eksi problar olarak added) yaygın olarak bağlanan türe özgü ikincil antikorlar, birincil antikorları bağlar ve ilgi proteinleri etkileşime girerse, Artı ve Eksi probları yakın mesafededir. DNA aşağıdaki adımda liglenir ve dairesel DNA'nın yuvarlanan daire amplifikasyonu mümkün olur. Amplifikasyon sırasında, floresan olarak etiketlenmiş tamamlayıcı oligonükleotidler sentezlenmiş DNA'ya bağlanır ve bu protein etkileşimlerinin geleneksel floresan mikroskopi ile görselleştirilmesini sağlar.

Burada açıklanan protokol, bilim adamlarının PLA kullanarak ateroprotektif ve ateropron SS koşullarındaki aktif SMAD transkripsiyon komplekslerinin sayısını nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. SS, tanımlanmış seviyelerde laminar tek yönlü akış üretebilen ve akış hızlarının adım adım artmasına izin veren programlanabilir bir pnömatik pompa sistemi ile üretilir. Bu yöntem, SMAD4 ile SMAD1/5 veya SMAD2/3 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra karışık R-SMAD komplekslerinin algılanmasını sağlar. SMAD'lerin transkripsiyonal yardımcı düzenleyicilerle etkileşimlerini analiz etmek veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine kolayca genişletilebilir. Şekil 1 aşağıda sunulan protokolün ana adımlarını göstermektedir.

Şekil 1: Açıklanan protokolün şematik gösterimi. (A) 6 kanallı kaydıraklarda tohumlanan hücreler pnömatik pompa sistemi ile kesme stresine maruz kalır. (B) Sabit hücreler PLA deneyi veya kontrol koşulları için kullanılır. (C) PLA deneylerinin görüntüleri floresan mikroskop ile elde edilir ve ImageJ analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hücre kültürü ve sıvı kesme stresine maruz kalma

NOT: SMAD'lerin SS kaynaklı etkileşimini incelemek için örnek olarak insan göbek damarı EBC'leri (HUVEC) kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan iletişim kuralı her SS duyarlı hücre türüne uygulanabilir.

1. 37 °C'de 30 dakika boyunca PBS'de % 0,1 porcine cilt jelatin ile 6 kanallı kaydırağı kapleyin.
2. 30 μL M199 tam ortamda mL başına 2,5 x ¹⁰⁶ hücre yoğunluğunda önceden kaplanmış 6 kanallı slaytlarda tohum HUVEC'leri.
   NOT: Akış slaydındaki hücrelerin nasıl tohumlanılacağı hakkında daha fazla bilgi ^{için bkz}.
3. Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca yapışmasına izin verin.
4. Rezervuarların her birine 60 μL önceden ısıtılmış M199 tam orta ekleyin.
5. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de günde bir kez hafif bir orta değişimle 2 gün boyunca kültür.
   1. Rezervuarları tamamen aspire edin, rezervuarlardan birine önceden ısıtılmış 120 μL tam orta ekleyin ve diğer taraftan epire edin.
   2. Her iki rezervuara da 60 μL önceden ısıtılmış M199 tam orta ekleyin.
6. Akış kurulumını ^{başvuru25'te} ayrıntılı olarak belirtildiği gibi birleştirin ve başlatın.
   1. Akışkan ünitelere boru monte edin. Burada sırasıyla 1 dyn/cm2 ve 30 dyn/^cm2 kesme stresi uygulamak için 0,8 mm ve 1,6 mm çapında silikon borular kullanılmaktadır.
      NOT: Değişiklikler ortaya çıkan kesme stresini etkileyebileceğinden, malzeme ve boru uzunluğu sabit kalmalıdır. Genel olarak, ortaya çıkan kesme stresi bilindiği ve pompa sabit bir laminar akış oluşturduğu sürece pompa sistemlerinin ve boruların diğer kombinasyonları kullanılabilir.
   2. Rezervuarları uygun miktarda önceden ısıtılmış M199 tam orta (minimum 10 mL) ile doldurun.
   3. Akışkan üniteleri boru ile pompa sistemine bağlayın ve ortamı aşındırmak ve kalan havayı çıkarmak için hücresiz bir ön çalıştırma ^{gerçekleştirin25}.
   4. Seri bağlantı borusunu kullanarak 6 kanallı slayttaki tek kanalları seri olarak birbirine bağlayın. Slayttaki ilk ve son kanal 1.6.1'de monte edilen boruya bağlanır (şema için Şekil 1A'ya bakın). Hücrelere ciddi şekilde zarar verebileceği için sisteme herhangi bir hava sokmamaya dikkat edin. Seri bağlantı hakkında daha fazla bilgiyi ^{reference26'da} bulabilirsiniz.
   5. Hücrelerin yüksek düzeyde kesme stresine (>20 dyn/^cm2) maruz kalması için bir rampa fazı kullanın, yani adaptasyon aşamaları ile kesme stresini adım adım artırın. Adımlar, 30 dakikada 5 dyn/^cm2'lik artışlarla ayarlanabilir.

2. Fiksasyon

1. Sıvı SS maruziyetinden sonra pompalardan kaydırakları ayırın. İnkübatördeki orta dökülmeyi önlemek için, ayırma yaparken boru üzerinde kelepçeler kullanın.
2. Kalan boru sırayla ayrılırken, akış slaytlarını hemen buz üzerinde aktarın. Boruyu rezervuarlardan çıkarırken, kanaldaki hava kabarcıklarını hapsetmeyi önlemek için diğer taraftaki rezervuar bir parmakla kapalı tutulmalıdır. Bu, sabitleme adımlarını engelleyebilir.
3. Hücreleri buzda tutarak, ortamı rezervuarlardan dikkatlice epire edin, ancak hücrelerin bulunduğu kanaldan değil. Daha sonra, numuneleri soğuk steril PBS (4 °C) ile kanal hacminin üç katı (90 μL) ile yıkayın. Bir rezervuara PBS ekleyin ve diğer rezervuardan dikkatlice aspire edin. Bu adımı slayt başına 6 kanalın her birinde yineleyin.
   NOT: Tüm yıkama ve kuluçka adımları için ilgili çözelti rezervuarlardan birine eklenir ve bu da kanalda çözüm değişimine yol açar. Çözeltilerin kanaldaki tam olarak değiştirilmesine izin vermek için, fazla çözelti daha sonra diğer rezervuardan emilir. Kanaldaki hücrelerin üstündeki çözelti çıkarılmaz. Hücreler herhangi bir zamanda kurumamalıdır. Bu nedenle, slaytlara herhangi bir hava kabarcığı takılmadan dikkatlice yıkamak önemlidir.
4. PBS'nin önceden eklendiği aynı rezervuara 90 μL tamponlanmış% 4 PFA çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitlayın ve benzer şekilde sıvıyı diğer rezervuardan epire edin. Bu adımı her slayttaki her kanalda yineleyin. PFA çözeltisinin eklenmesinden sonra, numuneleri buzdan oda sıcaklığına (RT) aktarın ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.
   DİkKAT: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Eldiven kullanın ve duman kaputunun altında çalışın.
5. Hücreleri bir rezervuara ekleyerek ve diğer rezervuardan dikkatlice soluyarak PBS (RT) ile 3x yıkayın. Kanalın kurumamasını sağlamak için sadece rezervuarları boşaltın. Slayt başına 6 kanalın her biri için bu adımı yineleyin.
6. Rezervuarlardan birine PBS'de 90 μL ortam 50 mM amonyum klorür ekleyerek PFA fiksasyonunu söndür. Diğer rezervuardan fazla çözeltiyi aspire edin. Slayttaki her kanal için yineleyin. Rt'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
7. 2.5. adımda açıklandığı gibi yıkayın.
   NOT: Bu noktada, numuneler bir gecede 4 °C'de saklanabilir veya protokole hemen blokaj ve primer antikor inkübasyonu ile devam edilebilir (bkz. adım 3).

3. Blokaj ve primer antikor inkübasyonu

1. Hücrelerin dengesini sağlamak için, boşaltılmış bir rezervuarda PBS'ye% 0.3 Triton-X-100'ün 90 μL'sini ekleyin ve her kanal için diğer rezervuardan aspire edin. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
2. 2.5. adımda açıklandığı gibi yıkayın.
3. Bir kanalın bir rezervuarında 90 μL steril PLA engelleme çözeltisi ekleyin ve diğer taraftan aspire edin. Her kanal için bu adımı yineleyin. Nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat boyunca blok.
   1. Nemlendirilmiş bir oda yapmak için, balmumu filmi ile kapatılmış ıslak dokulu 10 cm'lik bir tabak kullanın ve kabı inkübatöre yerleştirin. Alternatif olarak, nemli bir atmosfer sağlayan diğer nem odası formatları kullanılabilir.
      NOT: Alternatif olarak, kendi kendine yapılan engelleme çözeltisi kullanılabilir (örneğin, PBS'de% 3 (w / v) BSA, steril filtreli).
4. PLA antikor seyrelticisinde primer antikorları (1:100) hazırlayın. Kanal başına 30 μL çözelti hazırlayın. Hem primer antikorları aynı anda hem de girdabı ekleyin.
   NOT: Alternatif olarak, kendi kendine yapılan antikor seyreltici kullanılabilir (örneğin, PBS'de% 1 (w/ v) BSA). Burada kullanılan antikorlar SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 ve fosfo-SMAD1/5-SMAD4 kombinasyonlarıdır. Detaylı bilgiye Malzeme Tablosundan ulaşabilirsiniz.
5. Birincil antikorların uygulanmasından önce, blokaj çözeltisini rezervuarlardan ve ayrıca kanaldan dikkatlice epire edin. Birincil antikor çözeltisinin pipet 30 μL'si, çözeltiyi eklerken kanalı yatırarak hemen boş kanala girer.
   NOT: Blokaj çözeltisinin çıkarılmasını ve hücrelerin arada kurumamasını sağlamak için kanal kanal antikor çözeltisinin eklenmesini gerçekleştirin.
6. Numuneleri birincil antikorlarla birlikte 4 °C'de nemlendirilmiş odalarda bir gecede kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kuluçka, aynı gün aşağıdaki adımlarla devam ederek devam ederse, oda sıcaklığında 1 saat boyunca da yapılabilir.

4. PLA prob inkübasyonu

NOT: Bölüm 4.1-7.3'teki tüm adımlar için, A ve B yıkama tamponları 4 °C'de saklanır ve kullanımdan önce RT'ye ısıtılması gerekir.

1. PLA problarını (+)-fare ve (-)-tavşanı PLA antikor seyreltici (veya% 1 BSA) çözeltisinde 1:5'e seyreltin. Kanal başına 30 μL hazırlayın.
2. Rt'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 5 dakika boyunca 2x yıkayın, rezervuarlardan birine ekleyerek ve diğer rezervuardan dikkatlice emiş yaparak. Slayt başına 6 kanalın her biri için bu adımı yineleyin.
3. Yıkama tamponu A'yı dikkatlice epire edin ve adım 3.5'teki birincil antikorların eklenmesine benzer şekilde 30 μL PLA prob çözeltisi ekleyin (adım 4.1'de hazırlanmıştır).
4. Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.

5. Ligasyon

1. 4,2'de açıklandığı gibi, RT'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 5 dakika boyunca 2x yıkayın.
2. Deiyonize suda ligasyon tamponunun 1:5 seyreltilmesini hazırlayın. Ligaz enzimini 1:40'a (buzda) seyreltmek için bu tamponu kullanın. Kanal başına 30 μL kullanın.
3. Yıkama tamponu A'yı tamamen epire edin ve ligasyon çözeltisini 3,5'te açıklandığı gibi ekleyin.
4. Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.

6. Amplifikasyon

1. 4,2'de açıklandığı gibi RT'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 2 dakika boyunca 2x yıkayın.
2. Amplifikasyon tamponunu deiyonize suda 1:5 seyrelterek hazırlayın ve polimeraz enzimini 1:80'e (buz üzerinde) seyreltmek için kullanın. Işıktan kork. Kanal başına 30 μL hazırlayın.
3. Yıkama tamponu A'yı tamamen epire edin ve hazırlanan amplifikasyon çözeltisini 3,5'te açıklandığı gibi hemen boş kanala ekleyin. Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 100 dakika kuluçkaya yatır.

7. Montaj

1. RT'de 4,2'de açıklandığı gibi 90 μL Yıkama TamponU B kullanarak numuneleri 10 dakika boyunca 2x yıkayın. Çekirdekleri lekeleyecek ilk yıkamaya 1 mg/mL stok çözeltisinden (deiyonize suda) DAPI (1:500) ekleyin. Kanalı kurutmayın.
2. Yıkama tamponu B'yi deiyonize suda seyreltin (1:10) ve 4.2'de açıklandığı gibi 90 μL 0.1x tampon B çözeltisi ile 1x yıkayın.
3. Yıkama tamponu B'yi tamamen epire edin ve hemen bir rezervuara 2-3 damla sıvı montaj ortamı ekleyin. Slaydı yatırarak kanalda dağıtın. Numuneleri görüntülemeye kadar nemli bir ortamda 4 °C'de saklayın.

8. Görüntü alımı

1. Floresan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin. Floresan PLA problarına uyan ilgili filtrelerin mevcut olduğundan emin olun.
   NOT: Elde edilen PLA lekeleri daha tanımlandığı için mümkünse konfokal mikroskop kullanmak faydalıdır. Bu aynı zamanda daha fazla görüntü işleme ve veri analizini de destekler.

9. ImageJ/FIJI kullanarak görüntü analizi ve niceleme

1. Dışa aktarılan görüntüleri (.tiff) ^ImageJ27 gibi bir görüntü işleme programıyla işleyin.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan ve hücresel, nükleer ve tüm PLA olaylarının (hücre başına) otomatik sayımı için gerekli olan tüm komut dosyaları gitHub deposunda bulunabilir: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Uygun herhangi bir program veya araç kullanarak istatistiksel analiz yapın.

Daha önce farklı SMAD proteinlerinin etkileşimlerini tespit etmek için PLA ^kullandık3 ve SMAD fosforilasyonundaki kesme stresi kaynaklı değişiklikleri analiz ^ettik28.

Burada her iki yöntem de yukarıda açıklanan protokol ile birleştirildi. HUVEC'ler 1 dyn/^cm2 ve 30 dyn/^cm2 kesme stresine maruz kaldı ve SMAD transkripsiyon faktörlerinin etkileşimleri için analiz edildi. Yüksek kesme stresi (30 dyn/^cm2) ile karşılaştırıldığında, düşük kesme stresinin (1 dyn/^cm2) her ikisinde de karışık SMAD kompleksleri olarak adlandırılan SMAD1-SMAD2/3 etkileşimlerinde önemli bir artışa yol açtığını gösteriyoruz, sitosol ve analiz edilen hücrelerin çekirdekleri (Şekil 2A, alt panel). PLA olayları her iki örnekte de ayrı noktalar olarak görülebilir ve DAPI boyamaya atıfta bulunarak sitozolitik ve nükleer olayları ayırt edebilirsiniz (Şekil 2A, üst panel). Buna karşılık, her iki primer antikordan sadece birinin ancak her iki PLA probunun da kuluçkaya yatırıldığı antikor kontrollerinde ihmal edilebilir sayıda PLA sinyali saptadı (Şekil 2B). Böylece deneyin başarılı olduğu sonucuna varılabilir.

Şekil 2: Farklı antikor konsantrasyonlarını karşılaştıran SMAD2/3-SMAD1 PLA. (A) Konfokal floresan görüntüler ve belirtilen SS seviyelerinin 24 h'sine maruz kalan HUVEC'lerde SMAD2/3-SMAD1-PLA'nın nicelemesi. Antikor seyreltme oranı: 1:100. (B) A. (C) Konfokal floresan görüntülerde PLA için tek antikor kontrollerinin konfokal görüntüleri ve belirtilen SS seviyelerinin 24 saatine maruz kalan HUVEC'lerde SMAD2/3-SMAD1-PLA'nın nicelemesi. Antikor seyreltme oranı: 1:50. A-C için ölçek çubukları: 20 μm ve 10 μm yakınlaştırma. Dyne eşittir dyn/^cm2. Kullanılan antikorlar tavşan anti-SMAD2/3 ve fare anti-SMAD1 'dir (bkz. Malzeme Tablosu). Her koşul için görüntü alımı için akış kanalının merkezi boyunca 5 rastgele alan kullanıldı. N=1 biyolojik kopya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farklı antikor konsantrasyonlarının PLA sonuçlarını nasıl değiştirdiğini göstermek için, aynı deney antikorların 1:100 seyreltilmesi yerine 1:50 ile gerçekleştirildi. Bu koşullar altında, antikor miktarının iki katı hücre başına dört kat daha yüksek PLA sinyallerine neden olur ( Şekil 2A ve Şekil 2C'yi karşılaştırın). Daha yüksek bir antikor konsantrasyonu ^{kullanıldığında ve total} ve sitozolitik PLA olayları için istatistiksel önemi kaybolduğunda 1 dyn/^cm2 ile 30 dyn/cm2 arasındaki sinyal farkı azalır (Şekil 2A, alt panel; Şekil 2C, alt panel). Bunun nedeni sinyal birleştirme ve PLA olaylarını ayırt etme sorunları olabilir. Bu tür sinyal birikimi meydana gelirse, antikor konsantrasyonları azaltılmalıdır.

Ayrıca, in situ PLA kitlerinde yer alan ticari tamponlar için alternatif olarak blokaj ve antikor seyreltme için kendi kendine yapılan tamponların kullanılabileceğini gösterdik. Hücre başına PLA olayları SMAD1-SMAD2/3 (Şekil 3A ve Şekil 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Şekil 3B'ye karşı Şekil 3E) ve pSMAD1/5-SMA ile karşılaştırıldı Ticari çözümler (Şekil 3A-C) veya kendi kendine üretilen BSA/PBS tabanlı çözümler (Şekil 3D-F) kullanılarak 1 dyn/^cm2 ve 30 dyn/cm2 altındaki kompleksler 3C'ye karşı Şekil 34 (Şekil 3C ve Şekil 3F) kompleksleri ). Hem ticari hem de kendi kendine yapılan seyreltici/ bloke edici çözümler için nicelemeler, sitosolik ve nükleer alanlarda pla sinyallerinin aynı eğilimini göstermektedir. Bununla birlikte, ticari çözümler (Şekil 3A-C, alt paneller ve Şekil 3D-F, alt paneller) kullanırken hücre başına toplam PLA olayı sayısı daha yüksektir.

Şekil 3: Ticari ve kendi kendine yapılan antikor tamponlarını karşılaştıran PLA deneyi. HuveC'lerde 24 saatlik belirtilen kesme gerilim seviyelerine maruz kalan farklı SMAD-SMAD PLA'ların konfokal görüntüleri (her panelin üst kısmı) ve nicelleştirmesi (her panelin alt kısmı). (A-C) Ticari tamponlar (bkz. Malzeme Tablosu). (D-F) Kendi kendine yapılan tamponlar (blokaj için PBS'de %3 BSA, antikor seyreltme için PBS'de %1 BSA). Tüm primer antikorlar 1:100'de seyreltildi. Ölçek çubuğu, 20 μM (yakınlaştırma için 10 μM). İstatistiksel anlamlılık iki taraflı t-Test ile hesaplandı. ns - önemli olmayan, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Değerler ortalama + SEM olarak tasvir ^edilir. Kullanılan antikorlar tavşan anti-SMAD2/3, fare anti-SMAD1, tavşan anti-fosfoz SMAD1/5 ve fare anti-SMAD4 (bkz. Malzeme Tablosu). Her koşul için görüntü alımı için akış kanalının merkezi boyunca 5 rastgele alan kullanıldı. N=1 biyolojik kopya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Başarısız bir PLA deneyi için de bir örnek verdik. Burada, SMAD4 antikorunun immünofluoresans deneyleri yapmak için uygun olmadığı SMAD2/3-SMAD4 antikorlarının bir kombinasyonu kullanıldı. Tek antikor kontrolleri ile karşılaştırıldığında, 1 dyn/^cm2 veya 30 dyn/^cm2 örneklerinde lekelerde artış gözlenmedi (Şekil 4A ile Şekil 4B karşılaştırıldığında). SMAD2/3-SMAD4 komplekslerinin oluşumu kesme stresi ile indüklendikçe (bkz. Şekil 3B,E), bu PLA deneyinin başarısız olduğu sonucuna varılabilir. Bu, PLA olaylarını tespit etmek için doğru antikor kombinasyonlarının seçilmesinin önemini vurgulamaktadır, çünkü bağlı antikorların yönelimi ve uzaklığı oligonükleotid probların başarılı tavlanması için çok önemli olabilir.

Şekil 4: Başarısız PLA deneyi örneği. Konfokal görüntüler, ölçek çubuğu: 20 μm ve 10 μm yakınlaştırma. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Tek antikor kontrolleri. Kullanılan antikorlar fare anti-SMAD2/3 ve tavşan anti-SMAD4 'tür (bkz. Malzeme Tablosu). Dyne eşittir dyn/^cm2. Her koşul için görüntü alımı için akış kanalının merkezi boyunca 5 rastgele alan kullanıldı. N=1 biyolojik kopya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada açıklanan PLA tabanlı protokol, nicel ve mekansal çözünürlükle kesme stresine maruz kalan VC'lerde iki proteinin (örneğin doğrudan etkileşimlerinin) yakınlığını belirlemenin etkili bir yolunu sunar. Birden fazla paralel kanallı akış slaytları kullanılarak, aynı mekanik koşullar altında hücrelerde aynı anda birkaç farklı protein etkileşimi incelenebilir. Buna karşılık, özel yapım akış odası sistemleri genellikle bir cam kapak parçası etrafında inşa edilen tek bir kanaldan yararlanarak slayt ve pompa başına gerekli kontroller olmadan yalnızca tek bir PLA deneyine izin verir. Bu protokol SMAD etkileşimlerinin tespitine odaklansa da, diğer protein etkileşimlerini tespit etmek için uyarlanabilir. Bununla birlikte, iki protein de kompleksler oluşturmadan yakın mesafede ikamet edebileceğinden, sonuçların analizi dikkatlice yapılmalıdır. Proteinlerin etkileşimleri hakkında kesin ifadeler isteniyorsa, PLA deneyleri eş-immün önkupeksiyasyonlar gibi ek yöntemlerle tamamlanmalıdır. Ek olarak, PLA canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimini tespit etmek için kullanılamaz, çünkü numunelerin sonraki antikor bağlama ve DNA amplifikasyon adımları için sabitlenmesi gerekir.

Protein etkileşimlerinin PLA tarafından başarılı bir şekilde tespiti için en kritik adım, çeşitli kriterleri yerine getiren birincil antikorların bir kombinasyonunu seçmektir: (1) bireysel protein ortaklarını tespit eden antikorlar, ikincil antikorlar türlere özgü olduğu için farklı türlerde (örneğin, fare veya tavşan) üretilmelidir; ideal olarak, antikorlar konvansiyonel immünofluoresans mikroskopisi ile zaten başarıyla test edilmiştir; (2) epitopa bağlı antikorlar arasındaki mesafe <40 ^nm23 olmalıdır; (3) antikor-epitop bağlama yakınlıkları farklı olabileceğinden, kullanılan antikorların son konsantrasyonu burada gösterildiği gibi her deneysel ayar için ayarlanmalıdır (Şekil 2A, alt panele karşı Şekil 2C, alt panel). Bu nedenle, çok az ama spesifik PLA olayı tespit edilirse, kullanılan antikor miktarını artırmaya değer olabilir. Ancak, aşırı doyma ve belirsiz bağlama olaylarını önlemek için bu dikkatlice titratlanmalıdır. Ayrıca, kontrol örneklerinde kullanılan antikor konsantrasyonu PLA örneklerinde kullanılan konsantrasyonla eşleşmelidir.

Diğer biyokimyasal testlere gelince, PLA'da uygun kontroller vazgeçilmezdir. Kullanılan antikorların spesifik olmayan bağlanması, örneğin, sadece bir birincil antikordan kaynaklanan PLA sinyallerine yol açabilir. Bu nedenle, PLA deneyleri için esansiyel antikor kontrolleri, iki birincil antikordan sadece birinin eklenmesini içermelidir, ancak her iki PLA Probu (Artı ve Eksi). Ayrıca, PLA problarının numuneye spesifik olmayan bağlanmasını belirlemek için antikor eklenmemiş kontroller kullanılabilir. Genel olarak, bu teknik kontroller çok az PLA sinyaline hayır vermelidir. Birkaç sinyal gözlenirse, kullanılan birincil antikorun konsantrasyonu ve özgüllüğü yeniden gözden geçirilmelidir. Ek olarak, mümkünse olumlu bir biyolojik kontrol eklemek yararlıdır. Yukarıda açıklanan protokolde, bu, SMAD'lerin fosforilasyonunu ve dolayısıyla SMAD4 ile trimerik kompleks oluşumunu teşvik ettiği bilinen bir BMP ligand ile stimülasyon olabilir.

PLA deneyleri için, normalde% 50-70 birleştirilmiş hücrelerin kullanılması önerilir, çünkü bu reaktiflerin penetrasyonunu kolaylaştırır. Bununla birlikte, VC'lerle deneyler yaparken, yarı izdiah deneysel kurulumun bir parçası olması dışında, buna kesinlikle karşı çıkıyoruz. In vivo VC'ler, EC homeostaz ve mekano-transdüksiyon29 için gerekli olan sıkı hücreden hücreye kavşaklara sahip monolayerler oluşturur. Bu nedenle, bir arada olmayan IC'ler üzerinde yapılan deneyler yanlış sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, deney sırasında yüksek düzeyde kesme stresi kullanılırsa, bir arada olmayan hücreler akış kanalı slaytlarından ayırmaya daha yatkındır. EC monolayerlerinin olgun kavşaklar oluşturmak ve geliştirmek için zamana ihtiyacı olduğu için deneysel başlangıçtan iki ila üç gün önce hücreleri tohumla (2-2,5 x ¹⁰⁶ hücre / mL, protokol adımı 1,2'ye bakın) tavsiye ediyoruz. Bu nedenle, bir eşkeneviş monolayer elde etmek için deneyden sadece bir gün önce akış kanallarında daha yüksek sayıda hücrenin (>2,5 x ¹⁰⁶ hücre/mL) tohumlamasını önermiyoruz.

DAPI içeren çeşitli sıvı montaj ortamı mevcut olsa da, ayrı bir DAPI boyama adımı eklemek ve hücreleri DAPI olmadan sıvı montaj ortamına monte etmek, en azından polimer bazlı akış slaytları kullanılıyorsa. Bu, görüntü alma sırasında ağır arka plan sinyallerini önler. Kesme stresi kanal duvarlarında homojen olmadığından, görüntüler kenarlardan ziyade kanal merkezindeki konumlardan elde edilmelidir. Orta bölge boyunca rastgele alanların biyolojik çoğaltma ve durumu başına en az 5-10 görüntü almanızı öneririz. Normalde istatistiksel alaka düzeyi kazanmak için 3 veya daha fazla biyolojik kopya kullanılır. Görüntü analizi için ImageJ/FIJI makro işlevini kullanmanızı tavsiye ederiz. Yukarıdaki protokolde, DAPI boyamaya dayalı sitozolik ve nükleer PLA olaylarını saymaya uygun bir ImageJ makrosundan bahsetmiştik. Kullanıcılar, parçacık boyutu gibi parametrelerin nükleer boyuta veya daha büyük/daha küçük PLA noktalarına bağlı olarak ayarlanması gerektiğinin farkında olmalıdır. Makro, PLA sinyal algılamasının özgüllüğünü değerlendirmek için ham görüntülerle karşılaştırılması gereken eşik PLA görüntülerini ve maskelerini kaydeder.

Sonuç olarak, burada sunulan yöntem ateroprotektif ve ateropron SS koşullarında transkripsiyon faktörü kompleks oluşumunun hızlı ve verimli mekansal ve nicel analizine olanak sağlar. Bilim adamlarının SMAD kompleks oluşumunun aterogenez ve genel olarak vasküler hastalıktaki etkisini daha da deşifre etmelerini sağlayacaktır. Ayrıca, bu vasküler patolojilerde farklı proteinlerin yakınlığının sonuçlarını araştırmak için uyarlanabilir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Dr. Maria Reichenbach ve Dr. Christian Hiepen'e akış sistemine verdikleri destek için, Eleanor Fox ve Yunyun Xiao'ya ise makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz. P-L.M. uluslararası Max Planck Araştırma Okulu IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) tarafından finanse edildi. PK, DFG-SFB1444 tarafından fon aldı. Şekil 1 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.