Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalisierung ist während der Entwicklung und Homöostase des Gefäßsystems streng reguliert und ausgeglichen Daher führt eine Deregulation in diesem Signalweg zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie und Atherosklerose. Endothelzellen (ECs), als innerste Schicht der Blutgefäße, sind ständig Flüssigkeitsscherstress (SS) ausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass abnormale Muster von Fluid-SS die TGFβ / BMP-Signalgebung verbessern, die zusammen mit anderen Reizen eine Atherogenese induzieren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass atheroprones, niedriges laminares SS die TGFβ / BMP-Signalisierung verbessert, während atheroprotektives, hochlaminares SS diese Signalisierung verringert. Um die Aktivierung dieser Signalwege effizient zu analysieren, haben wir einen Workflow entwickelt, um die Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter niedrigen laminaren SS- und hohen laminaren SS-Bedingungen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen pneumatischen Pumpensystems und eines Proximity Ligation Assay (PLA) zu untersuchen.

Aktive TGFβ/BMP-Signalisierung erfordert die Bildung von trimeren SMAD-Komplexen, die aus zwei regulatorischen SMADs (R-SMAD) bestehen; SMAD2/3 bzw. SMAD1/5/8 für TGFβ bzw. BMP Signalisierung) mit einem gemeinsamen Mediator SMAD (Co-SMAD; SMAD4). Mit Hilfe von PLA, das auf verschiedene Untereinheiten des trimeren SMAD-Komplexes abzielt, d.h. entweder R-SMAD/co-SMAD oder R-SMAD/R-SMAD, kann die Bildung aktiver SMAD-Transkriptionsfaktorkomplexe quantitativ und räumlich mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.

Die Verwendung von Strömungsschienen mit 6 kleinen parallelen Kanälen, die in Reihe geschaltet werden können, ermöglicht die Untersuchung der Komplexbildung des Transkriptionsfaktors und die Einbeziehung notwendiger Kontrollen.

Der hier erläuterte Workflow kann leicht für Studien angepasst werden, die auf die Nähe von SMADs zu anderen Transkriptionsfaktoren oder zu Transkriptionsfaktorkomplexen außer SMADs unter verschiedenen flüssigen SS-Bedingungen abzielen. Der hier vorgestellte Workflow zeigt eine schnelle und effektive Möglichkeit, die fluid-SS-induzierte TGFβ/BMP-Signalisierung in ECs sowohl quantitativ als auch räumlich zu untersuchen.

Proteine der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGFβ) sind pleiotrope Zytokine mit einer Vielzahl von Mitgliedern, darunter TGFβs, knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und ^Activine1,2. Die Ligandenbindung induziert die Bildung von Rezeptoroligomeren, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der zytosolischen regulatorischen SMAD (R-SMAD) führen. Je nach Unterfamilie der Liganden werden unterschiedliche R-SMADs ^aktiviert1,2. Während TGFβs und Activine hauptsächlich die Phosphorylierung von SMAD2/3 induzieren, induzieren BMPs die SMAD1/5/8-Phosphorylierung. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass BMPs und TGFβs/Activine auch R-SMADs der jeweiligen anderen Unterfamilie in einem als "laterale Signalisierung" bezeichneten Prozess aktivieren3,4,5,6,7,8 und dass es gemischte SMAD-Komplexe gibt, die sowohl aus SMAD1/5 als auch AUS SMAD2/3 bestehen, ^{Mitglieder3,9} . Zwei aktivierte R-SMADs bilden anschließend trimerische Komplexe mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Diese Transkriptionsfaktorkomplexe sind dann in der Lage, in den Zellkern zu translozieren und die Transkription von Zielgenen zu regulieren. SMADs können mit einer Vielzahl verschiedener transkriptioneller Koaktivatoren und Co-Repressoren interagieren, was zur Diversifizierung der Möglichkeiten zur Regulierung von Zielgenen ^führt10. Die Deregulierung der SMAD-Signalgebung hat schwerwiegende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten. Dementsprechend kann eine unausgewogene TGFβ/BMP-Signalgebung zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie oder Atherosklerose führen3,11,12,13,14.

Endothelzellen (ECs) bilden die innerste Schicht der Blutgefäße und sind daher Scherstress (SS) ausgesetzt, einer Reibungskraft, die durch den viskosen Blutfluss ausgeübt wird. Interessanterweise werden ECs, die sich in den Teilen des Gefäßsystems befinden, die einem hohen Maß an einheitlichem, laminarem SS ausgesetzt sind, in einem homöostatischen und ruhenden Zustand gehalten. Im Gegensatz dazu sind ECs, die eine niedrige, ungleichmäßige SS erfahren, z. B. bei Verzweigungen oder der geringeren Krümmung des Aortenbogens, proliferativ und aktivieren ^{Entzündungswege15}. Im Gegenzug neigen Stellen von dysfunktionalen ECs dazu, Atherosklerose zu entwickeln. Interessanterweise zeigen ECs in diesen atheropronen Bereichen ungewöhnlich hohe Konzentrationen von aktiviertem SMAD2/3 und SMAD1/516,17,18. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass eine verbesserte TGFβ/BMP-Signalisierung ein frühes Ereignis in der Entwicklung atherosklerotischer ^Läsionen19 ist und eine Interferenz mit der BMP-Signalgebung die vaskuläre Entzündung, die Atherombildung und die damit verbundene Verkalkung deutlich ^reduziert20.

Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine biochemische Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in ^situ21,22. Es beruht auf der Spezifität von Antikörpern verschiedener Spezies, die Zielproteine von Interesse binden können, was den hochspezifischen Nachweis endogener Proteininteraktionen auf Einzelzellebene ermöglicht. Dabei müssen primäre Antikörper in einem Abstand von weniger als 40 nm an ihr Zielepitop binden, um den Nachweis zu ^{ermöglichen23}. Daher ist PLA gegenüber herkömmlichen Co-Immunpräzipitationsansätzen, bei denen mehrere Millionen Zellen benötigt werden, um endogene Proteininteraktionen nachzuweisen, von großem Vorteil. Bei PLA binden speziesspezifische sekundäre Antikörper, kovalent verknüpft mit DNA-Fragmenten (sogenannte Plus- und Minus-Sonden), die primären Antikörper und wenn die proteininteressierten Proteine interagieren, kommen Plus- und Minus-Sonden in unmittelbarer Nähe. Die DNA wird im folgenden Schritt ligiert und die Rolling Circle Amplification der zirkulären DNA wird ermöglicht. Während der Amplifikation binden fluoreszenzmarkierte komplementäre Oligonukleotide an die synthetisierte DNA, so dass diese Proteininteraktionen durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anzahl der aktiven SMAD-Transkriptionskomplexe unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen in vitro unter Verwendung von PLA quantitativ zu vergleichen. SS wird über ein programmierbares pneumatisches Pumpensystem erzeugt, das in der Lage ist, laminaren unidirektionalen Durchfluss definierter Füllstände zu erzeugen und schrittweise Erhöhungen der Durchflussraten zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen SMAD1/5 oder SMAD2/3 mit SMAD4 sowie von Mixed-R-SMAD-Komplexen. Es kann leicht erweitert werden, um Wechselwirkungen von SMADs mit transkriptionellen Co-Regulatoren oder auf andere Transkriptionsfaktorkomplexe als SMADs zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte des unten dargestellten Protokolls.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Protokolls. (A) Zellen, die in 6-Kanal-Objektträgern ausgesät sind, werden mit einem pneumatischen Pumpensystem einer Schubbeanspruchung ausgesetzt. (B) Feste Zellen werden für PLA-Experimente oder für Kontrollbedingungen verwendet. (C) Bilder von PLA-Experimenten werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der Analysesoftware ImageJ analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Exposition gegenüber Zellkultur- und Flüssigkeitsscherstress

HINWEIS: Menschliche Nabelschnurvenen-ECs (HUVECs) wurden als Beispiel verwendet, um die SS-induzierte Interaktion von SMADs zu untersuchen. Das unten beschriebene Protokoll kann auf jeden SS-responsiven Zelltyp angewendet werden.

1. 6-Kanal-Objektträger mit 0,1% Schweinehautgelatine in PBS für 30 min bei 37 °C bestreichen.
2. Seed HUVECs in vorbeschichteten 6-Kanal-Objektträgern mit einer Dichte von 2,5 x ¹⁰⁶ Zellen pro ml in 30 μL M199 Vollmedium.
   HINWEIS: Weitere Informationen zum Seeding von Zellen im Flow Slide finden Sie unter ^reference24.
3. Lassen Sie die Zellen 1 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator haften.
4. Jedem der Reservoirs werden 60 μL vorgewärmtes M199-Vollmedium zugegeben.
5. Kultur für 2 Tage, mit einem sanften Mittleren Austausch einmal täglich, bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator.
   1. Die Reservoirs vollständig absaugen, 120 μL vorgewärmtes M199-Vollmedium in eines der Reservoirs geben und von der anderen Seite absaugen.
   2. Geben Sie 60 μL vorgewärmtes M199-Vollmedium zu beiden Reservoirs hinzu.
6. Montieren und starten Sie die Strömungseinrichtung wie in der ^{Referenz25 beschrieben}.
   1. Montieren Sie Schläuche auf fluidischen Einheiten. Dabei werden Silikonschläuche mit einem Durchmesser von 0,8 mm und 1,6 mm zur Aufbringung von Scherspannungen von 1 dyn/^cm2 bzw. 30 dyn/^cm2 eingesetzt.
      HINWEIS: Das Material und die Schlauchlänge sollten konstant bleiben, da Änderungen die resultierende Schubspannung beeinflussen können. Im Allgemeinen können andere Kombinationen von Pumpensystemen und Schläuchen verwendet werden, solange die resultierende Scherspannung bekannt ist und die Pumpe eine stetige laminare Strömung erzeugt.
   2. Füllen Sie die Reservoirs mit einer angemessenen Menge vorgewärmtem M199-Vollmedium (mindestens 10 ml).
   3. Schließen Sie fluidische Einheiten mit dem Schlauch an das Pumpensystem an und führen Sie einen Vorlauf ohne Zellen durch, um das Medium auszugleichen und verbleibende Luft zu ^entfernen25.
   4. Verbinden Sie die einzelnen Kanäle auf dem 6-Kanal-Dia seriell über serielle Anschlussschläuche miteinander. Der erste und der letzte Kanal auf dem Schlitten werden mit dem in 1.6.1 montierten Schlauch verbunden (siehe Abbildung 1A für ein Schema). Achten Sie darauf, keine Luft in das System einzubringen, da dies die Zellen stark schädigen könnte. Weitere Informationen zur seriellen Verbindung finden Sie in ^reference26.
   5. Für die Exposition von Zellen gegenüber hoher Scherspannung (>20 dyn/^cm2) verwenden Sie eine Rampenphase, d.h. erhöhen Sie die Schubspannung schrittweise mit Anpassungsphasen. Schritte können in Schritten von 5 Dyn/^cm2 pro 30 min eingestellt werden.

2. Fixierung

1. Trennen Sie die Schlitten nach der SS-Exposition der Flüssigkeit von den Pumpen. Verwenden Sie beim Abnehmen Klemmen am Schlauch, um das Verschütten des Mediums im Inkubator zu vermeiden.
2. Übertragen Sie sofort Strömungsrutschen auf Eis, während der verbleibende Schlauch nacheinander gelöst wird. Wenn Sie den Schlauch aus den Behältern entfernen, sollte der Behälter auf der anderen Seite mit einem Finger verschlossen gehalten werden, um luftblasen im Kanal nicht einzufangen. Dies kann die Fixierungsschritte beeinträchtigen.
3. Halten Sie die Zellen auf Eis und saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Reservoirs ab, aber nicht aus dem Kanal, in dem sich die Zellen befinden. Anschließend werden die Proben mit kaltem sterilem PBS (4 °C) mit dem dreifachen Kanalvolumen (90 μL) gewaschen. Fügen Sie PBS in einem Reservoir hinzu und aspirieren Sie vorsichtig aus dem anderen Reservoir. Wiederholen Sie diesen Schritt in jedem der 6 Kanäle pro Folie.
   HINWEIS: Für alle Wasch- und Inkubationsschritte wird die jeweilige Lösung in einen der Behälter gegeben, was zu einem Austausch von Lösungen im Kanal führt. Um eine vollständige Substitution von Lösungen im Kanal zu ermöglichen, wird die überschüssige Lösung dann aus dem anderen Reservoir abgesaugt. Lösung auf der Oberseite der Zellen im Kanal wird nicht entfernt. Zellen sollten zu keiner Zeit trocknen. Daher ist es wichtig, sorgfältig zu waschen, ohne dass Luftblasen in die Objektträger eingeführt werden.
4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 90 μL gepufferte 4% PFA-Lösung in dasselbe Reservoir geben, in dem zuvor das PBS zugegeben wurde, und saugen Sie die Flüssigkeit in ähnlicher Weise aus dem anderen Reservoir ab. Wiederholen Sie diesen Schritt in jedem Kanal in jeder Folie. Nach Zugabe der PFA-Lösung die Proben von Eis auf Raumtemperatur (RT) übertragen und 20 min inkubieren.
   ACHTUNG: PFA ist giftig und sollte vorsichtig behandelt werden. Verwenden Sie Handschuhe und arbeiten Sie unter einem Abzug.
5. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS (RT), indem Sie sie in ein Reservoir geben und vorsichtig aus dem anderen Reservoir absaugen. Leeren Sie nur die Reservoirs, um sicherzustellen, dass der Kanal nicht austrocknet. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden der 6 Kanäle pro Folie.
6. Löschen Sie die PFA-Fixierung durch Zugabe von 90 μL 50 mM Ammoniumchlorid in PBS in einem der Reservoirs. Aspirieren Sie überschüssige Lösung aus dem anderen Reservoir. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal in der Folie. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT.
7. Waschen Sie wie in Schritt 2.5 beschrieben.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden, oder das Protokoll kann sofort mit Blockierung und primärer Antikörperinkubation fortgesetzt werden (siehe Schritt 3).

3. Blockierung und primäre Antikörperinkubation

1. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie 90 μL 0,3% Triton-X-100 in PBS in einem entleerten Reservoir hinzu und aspirieren Sie aus dem anderen Reservoir für jeden Kanal. Inkubieren Sie für 10 min bei RT.
2. Waschen Sie wie in Schritt 2.5 beschrieben.
3. 90 μL sterile PLA-Blockierlösung in ein Reservoir eines Kanals geben und von der anderen Seite absaugen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Kanal. Block für 1 h bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer.
   1. Um eine befeuchtete Kammer herzustellen, verwenden Sie eine 10 cm große Schale mit nassem Gewebe, das mit Wachsfilm versiegelt ist, und legen Sie die Schale in den Inkubator. Alternativ können auch andere Feuchtekammerformate verwendet werden, die für eine feuchte Atmosphäre sorgen.
      HINWEIS: Alternativ kann selbstgemachte Blockierlösung verwendet werden (z. B. 3% (w/v) BSA in PBS, steril gefiltert).
4. Primäre Antikörper (1:100) in PLA-Antikörperverdünner herstellen. 30 μL der Lösung pro Kanal zubereiten. Fügen Sie beide primären Antikörper gleichzeitig hinzu und wirbeln Sie.
   HINWEIS: Alternativ kann ein selbst hergestelltes Antikörperverdünnungsmittel verwendet werden (z. B. 1% (w/v) BSA in PBS). Die hier verwendeten Antikörper sind Kombinationen von SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 und Phospho-SMAD1/5-SMAD4. Detaillierte Informationen finden Sie in der Materialtabelle.
5. Vor der Anwendung von primären Antikörpern die blockierende Lösung aus den Reservoirs und auch vorsichtig aus dem Kanal absaugen. 30 μL der primären Antikörperlösung werden sofort in den leeren Kanal pipettiert, indem der Kanal unter Zugabe der Lösung gekippt wird.
   HINWEIS: Führen Sie die Entfernung der Blockierenden Lösung und die Zugabe der Antikörperlösung Kanal für Kanal durch, um sicherzustellen, dass die Zellen zwischendurch nicht austrocknen.
6. Inkubieren Sie Proben mit den primären Antikörpern über Nacht in befeuchteten Kammern bei 4 °C.
   HINWEIS: Die Inkubation kann auch für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn Sie die folgenden Schritte am selben Tag fortsetzen möchten.

4. Pla-Sonden-Inkubation

HINWEIS: Für alle Schritte in Abschnitt 4.1-7.3 werden die Waschpuffer A und B bei 4 °C gelagert und müssen vor der Verwendung auf RT erwärmt werden.

1. Verdünnung der PLA-Sonden (+)-Maus und (-)-Kaninchen auf 1:5 in PLA-Antikörperverdünnungslösung (oder 1% BSA). Bereiten Sie 30 μL pro Kanal vor.
2. Proben 2x für 5 min mit 90 μL des Waschpuffers A bei RT waschen, indem sie in einen der Behälter gegeben und vorsichtig aus dem anderen Reservoir abgesaugt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden der 6 Kanäle pro Folie.
3. Den Waschpuffer A vorsichtig absaugen und 30 μL PLA-Sondenlösung (hergestellt in Schritt 4.1) hinzufügen, ähnlich der Zugabe von primären Antikörpern in Schritt 3.5.
4. Proben 1 h bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.

5. Ligatur

1. Waschen Sie Proben 2x für 5 min unter Verwendung von 90 μL des Waschpuffers A bei RT, wie in 4.2 beschrieben.
2. Bereiten Sie eine 1:5-Verdünnung des Ligaturpuffers in entionisiertem Wasser vor. Verwenden Sie diesen Puffer, um das Ligaseenzym auf 1:40 (auf Eis) zu verdünnen. Verwenden Sie 30 μL pro Kanal.
3. Den Waschpuffer A vollständig absaugen und die Ligationslösung wie in 3.5 beschrieben hinzufügen.
4. Proben 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.

6. Verstärkung

1. Waschen Sie Proben 2x für 2 min unter Verwendung von 90 μL Waschpuffer A bei RT, wie in 4.2 beschrieben.
2. Bereiten Sie den Amplifikationspuffer vor, indem Sie ihn 1:5 in deionisiertem Wasser verdünnen und damit das Polymerase-Enzym auf 1:80 (auf Eis) verdünnen. Vor Licht schützen. Bereiten Sie 30 μL pro Kanal vor.
3. Den Waschpuffer A vollständig absaugen und die vorbereitete Amplifikationslösung sofort in den leeren Kanal geben, wie in 3.5 beschrieben. Proben 100 min bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.

7. Montage

1. Waschen Sie Proben 2x für 10 min unter Verwendung von 90 μL Wash Buffer B bei RT wie in 4.2 beschrieben. DAPI (1:500) aus 1 mg/ml Stammlösung (in entionisiertem Wasser) in der ersten Wäsche zugeben, um die Kerne zu färben. Trocknen Sie den Kanal nicht.
2. Der Waschpuffer B wird in entionisiertem Wasser (1:10) verdünnt und 1x mit 90 μL 0,1x Puffer B-Lösung wie in 4.2 beschrieben gewaschen.
3. Den Waschpuffer B vollständig absaugen und sofort 2-3 Tropfen des flüssigen Montagemediums in ein Reservoir geben. Verteilen Sie es im Kanal, indem Sie die Folie neigen. Lagern Sie die Proben bei 4 °C in einer befeuchteten Umgebung bis zur Bildgebung.

8. Bilderfassung

1. Erfassen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter für die fluoreszierenden PLA-Sonden verfügbar sind.
   HINWEIS: Es ist vorteilhaft, wenn möglich ein konfokales Mikroskop zu verwenden, da die erhaltenen PLA-Flecken definierter sind. Dies unterstützt auch die weitere Bildverarbeitung und Datenanalyse.

9. Bildanalyse und Quantifizierung mit ImageJ/FIJI

1. Verarbeiten Sie exportierte Bilder (.tiff) mit einem Bildverarbeitungsprogramm wie ^ImageJ27.
   HINWEIS: Alle Skripte, die in dieser Studie verwendet werden und für die automatische Zählung von zellulären, nuklearen und allen PLA-Ereignissen (pro Zelle) erforderlich sind, finden Sie in einem GitHub-Repository: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Führen Sie statistische Analysen mit einem geeigneten Programm oder Tool durch.

Wir haben pla zuvor verwendet, um Wechselwirkungen verschiedener SMAD-Proteine3 zu detektieren und scherspannungsinduzierte Veränderungen in der SMAD-Phosphorylierung ^{zu analysieren28}.

Hier wurden beide Methoden mit dem oben beschriebenen Protokoll kombiniert. HUVECs wurden einer Scherspannung von 1 Dyn/^cm2 und 30 Dyn/^cm2 ausgesetzt und auf Wechselwirkungen von SMAD-Transkriptionsfaktoren analysiert. Wir zeigen, dass im Vergleich zur hohen Scherspannung (30 dyn/^cm2) die geringe Scherspannung (1 dyn/^cm2) zu einem signifikanten Anstieg der SMAD1-SMAD2/3-Wechselwirkungen, der sogenannten gemischten SMAD-Komplexe sowohl im Zytosol als auch in den Kernen der analysierten Zellen führt (Abbildung 2A, unteres Feld). PLA-Ereignisse sind in beiden Proben als unterschiedliche Flecken sichtbar, und man kann in Bezug auf die DAPI-Färbung zwischen zytosolischen und nuklearen Ereignissen unterscheiden (Abbildung 2A, oberes Bild). Im Gegensatz dazu zeigten Antikörperkontrollen, bei denen nur einer der beiden primären Antikörper, aber dennoch beide PLA-Sonden inkubiert wurden, eine vernachlässigbare Anzahl von PLA-Signalen (Abbildung 2B). Daraus lässt sich schließen, dass das Experiment erfolgreich war.

Abbildung 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA im Vergleich verschiedener Antikörperkonzentrationen. (A) Konfokale Fluoreszenzbilder und Quantifizierung von SMAD2/3-SMAD1-PLA in HUVECs, die bei 24 h der angegebenen SS-Spiegel exponiert wurden. Antikörper-Verdünnungsverhältnis: 1:100. (B) Konfokale Bilder von Einzelantikörperkontrollen für PLA in A. (C) Konfokale Fluoreszenzbilder und Quantifizierung von SMAD2/3-SMAD1-PLA in HUVECs, die bei 24 h der angegebenen SS-Spiegel exponiert wurden. Antikörper-Verdünnungsverhältnis: 1:50. Maßstabsleisten für A-C: 20 μm und 10 μm beim Vergrößern. Dyne entspricht dyn/^cm2. Die verwendeten Antikörper waren Kaninchen-Anti-SMAD2/3 und Maus-Anti-SMAD1 (siehe Materialtabelle). Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu zeigen, wie unterschiedliche Konzentrationen von Antikörpern die PLA-Ergebnisse verändern, wurde das gleiche Experiment mit einer 1:50- statt einer 1:100-Verdünnung von Antikörpern durchgeführt. Unter diesen Bedingungen führt die doppelte Menge an Antikörpern zu mehr als vierfach höheren PLA-Signalen pro Zelle (vgl . Abbildung 2A und Abbildung 2C). Der Signalunterschied zwischen 1 dyn/^cm2 und 30 dyn/^cm2 nimmt ab, wenn eine höhere Antikörperkonzentration verwendet wird und die statistische Signifikanz für die gesamten und zytosolischen PLA-Ereignisse verloren geht (Abbildung 2A, unteres Panel; Abbildung 2C, unterer Bereich). Dies könnte auf die Signalkoaleszenz und Probleme bei der Unterscheidung von PLA-Ereignissen zurückzuführen sein. Wenn eine solche Akkumulation von Signalen auftritt, sollten die Antikörperkonzentrationen verringert werden.

Darüber hinaus zeigten wir, dass selbst hergestellte Puffer zur Blockierung und Antikörperverdünnung als Alternative für kommerzielle Puffer verwendet werden können, die in in in situ PLA-Kits enthalten sind. PLA-Ereignisse pro Zelle wurden für SMAD1-SMAD2/3 (Abbildung 3A versus Abbildung 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Abbildung 3B versus Abbildung 3E) und pSMAD1/5-SMAD4 (Abbildung 3C versus Abbildung 3F) unter 1 Dyn/^cm2 und 30 Dyn/^cm2 unter Verwendung kommerzieller Lösungen (Abbildung 3A-C) oder selbst hergestellter BSA/PBS-basierter Lösungen (Abbildung 3D-F) verglichen. ). Quantifizierungen sowohl für kommerzielle als auch für selbst hergestellte Verdünnungsmittel-/Blockierungslösungen zeigen den gleichen Trend von PLA-Signalen in zytosolischen und nuklearen Bereichen. Die Gesamtzahl der PLA-Ereignisse pro Zelle ist jedoch höher, wenn kommerzielle Lösungen verwendet werden (Abbildung 3A-C, untere Panels im Vergleich zu Abbildung 3D-F, untere Panels).

Abbildung 3: PLA-Experiment zum Vergleich von kommerziellen und selbst hergestellten Antikörperpuffern. Konfokale Bilder (oberer Teil jedes Panels) und Quantifizierung (unterer Teil jedes Panels) verschiedener SMAD-SMAD PLAs in HUVECs, die 24 Stunden lang den angegebenen Scherspannungsniveaus ausgesetzt waren. (A-C) Kommerzielle Puffer (siehe Materialtabelle). (D-F) Selbst hergestellte Puffer (3% BSA in PBS zur Blockierung, 1% BSA in PBS zur Antikörperverdünnung). Alle primären Antikörper wurden 1:100 verdünnt. Maßstabsleiste, 20 μM (10 μM für Zoom-In). Die statistische Signifikanz wurde mit einem beidseitigen t-Test berechnet. ns - nicht signifikant, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Die Werte werden als Mittelwert + REM dargestellt. Dyne entspricht dyn/^cm2. Verwendete Antikörper waren Kaninchen-Anti-SMAD2/3, Maus-Anti-SMAD1, Kaninchen-Antiphospho SMAD1/5 und Maus-Anti-SMAD4 (siehe Materialtabelle). Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wir haben auch ein Beispiel für ein gescheitertes PLA-Experiment aufgenommen. Hier wurde eine Kombination von SMAD2/3-SMAD4-Antikörpern verwendet, bei der der SMAD4-Antikörper nicht für die Durchführung von Immunfluoreszenzexperimenten geeignet war. Im Vergleich zu einzelnen Antikörperkontrollen wurde weder in den 1 dyn/^cm2- noch in den 30 dyn/^cm2-Proben ein Anstieg der Flecken beobachtet (Abbildung 4A versus Abbildung 4B). Da die Bildung von SMAD2/3-SMAD4-Komplexen durch Scherspannung induziert wird (siehe Abbildung 3B,E), kann gefolgert werden, dass dieses PLA-Experiment erfolglos war. Dies unterstreicht die Bedeutung der Auswahl der richtigen Antikörperkombinationen zum Nachweis von PLA-Ereignissen, da Die Orientierung und der Abstand der gebundenen Antikörper für ein erfolgreiches Abkühlen der Oligonukleotidsonden entscheidend sein können.

Abbildung 4: Beispiel für fehlgeschlagenes PLA-Experiment. Konfokale Bilder, Maßstabsleiste: 20 μm und 10 μm beim Vergrößern. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Einzelne Antikörperkontrollen. Die verwendeten Antikörper waren Maus-Anti-SMAD2/3 und Kaninchen-Anti-SMAD4 (siehe Materialtabelle). Dyne entspricht dyn/^cm2. Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das hier beschriebene PLA-basierte Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, die Nähe von zwei Proteinen (z. B. deren direkte Interaktion) in ECs, die Scherspannung ausgesetzt sind, mit quantitativer und räumlicher Auflösung zu bestimmen. Durch den Einsatz von Strömungsobjektträgern mit mehreren parallelen Kanälen können mehrere verschiedene Proteininteraktionen gleichzeitig in Zellen unter identischen mechanischen Bedingungen untersucht werden. Im Gegensatz dazu verwenden speziell angefertigte Durchflusskammersysteme oft einen einzigen Kanal, der um einen Glasdeckglas herum aufgebaut ist, was nur ein einziges PLA-Experiment ohne die erforderlichen Steuerungen pro Objektträger und Pumpe ermöglichen würde. Obwohl sich dieses Protokoll auf den Nachweis von SMAD-Interaktionen konzentriert, kann es angepasst werden, um andere Proteininteraktionen zu erkennen. Die Analyse der Ergebnisse muss jedoch sorgfältig durchgeführt werden, da sich auch zwei Proteine in unmittelbarer Nähe befinden können, ohne Komplexe zu bilden. Sind eindeutige Aussagen über Wechselwirkungen von Proteinen erwünscht, sollten PLA-Experimente durch zusätzliche Methoden wie Co-Immunpräzipitationen ergänzt werden. Darüber hinaus kann PLA nicht zum Nachweis der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Zellen verwendet werden, da Proben für nachfolgende Antikörperbindungs- und DNA-Amplifikationsschritte fixiert werden müssen.

Für den erfolgreichen Nachweis von Proteininteraktionen durch PLA besteht der kritischste Schritt darin, eine Kombination von primären Antikörpern zu wählen, die mehrere Kriterien erfüllen: (1) Die Antikörper, die die einzelnen Proteinpartner nachweisen, müssen in verschiedenen Spezies (z. B. Maus oder Kaninchen) erzeugt werden, da die sekundären Antikörper speziesspezifisch sind; Im Idealfall wurden Antikörper bereits erfolgreich mit der konventionellen Immunfluoreszenzmikroskopie getestet; (2) Der Abstand zwischen epitopgebundenen Antikörpern sollte <40 ^{nm23 betragen}; (3) Da die Affinitäten für die Antikörper-Epitop-Bindung unterschiedlich sein können, muss die Endkonzentration der verwendeten Antikörper für jede experimentelle Umgebung angepasst werden, wie hier gezeigt (Abbildung 2A, unteres Panel versus Abbildung 2C, unteres Panel). Wenn also nur sehr wenige, aber spezifische PLA-Ereignisse nachgewiesen werden, kann es sich lohnen, die Menge der verwendeten Antikörper zu erhöhen. Dies muss jedoch sorgfältig titriert werden, um Übersättigung und unspezifische Bindungsereignisse zu vermeiden. Außerdem muss die in Kontrollproben verwendete Antikörperkonzentration mit der in den PLA-Proben verwendeten Konzentration übereinstimmen.

Wie bei jedem anderen biochemischen Assay sind auch bei PLA geeignete Kontrollen unverzichtbar. Eine unspezifische Bindung der verwendeten Antikörper könnte beispielsweise dazu führen, dass PLA-Signale von nur einem primären Antikörper stammen. Daher sollten essentielle Antikörperkontrollen für PLA-Experimente nur die Zugabe eines der beiden primären Antikörper, aber beider PLA-Sonden (Plus und Minus) beinhalten. Darüber hinaus können Kontrollen ohne Zugabe von Antikörpern verwendet werden, um die unspezifische Bindung der PLA-Sonden an die Probe zu bestimmen. Im Allgemeinen sollten diese technischen Kontrollen nur sehr wenigen PLA-Signalen nein liefern. Wenn mehrere Signale beobachtet werden, sollte die Konzentration des verwendeten primären Antikörpers und seine Spezifität überdacht werden. Darüber hinaus ist es sinnvoll, wenn möglich eine positive biologische Kontrolle einzubeziehen. In dem oben beschriebenen Protokoll könnte dies eine Stimulation mit einem BMP-Liganden sein, von dem bekannt ist, dass er die Phosphorylierung von SMADs und damit die Bildung trimerischer Komplexe mit SMAD4 induziert.

Für PLA-Experimente wird normalerweise empfohlen, Zellen zu verwenden, die zu 50-70% konfluent sind, da dies das Eindringen von Reagenzien vereinfacht. Bei der Durchführung von Experimenten mit ECs würden wir jedoch strikt dagegen argumentieren, es sei denn, die Semi-Konfluenz ist Teil des experimentellen Aufbaus. Im lebenden Organismus ECs bilden Monoschichten mit engen Zell-zu-Zell-Verbindungen, die für die EC-Homöostase und Mechanotransduktion unerlässlich ^sind29. Daher könnten Experimente an nicht konfluenten ECs zu falschen Ergebnissen führen. Darüber hinaus neigen nicht konfluente Zellen eher dazu, sich von Strömungskanalobjektträgern zu lösen, wenn während des Experiments eine hohe Scherspannung verwendet wird. Wir empfehlen, Zellen (2-2,5 x ¹⁰⁶ Zellen/ ml, siehe Protokollschritt 1.2) zwei bis drei Tage vor dem experimentellen Start zu säen, da EC-Monoschichten Zeit benötigen, um reife Verbindungen zu bilden und zu entwickeln. Daher würden wir nicht empfehlen, eine höhere Anzahl von Zellen (>2,5 x ¹⁰⁶ Zellen / ml) in Strömungskanälen nur einen Tag vor dem Experiment zu säen, um eine konfluente Monoschicht zu erreichen.

Obwohl verschiedene flüssige Montagemedien, die DAPI enthalten, existieren, lohnt es sich, einen separaten DAPI-Färbeschritt einzuschließen und die Zellen mit flüssigem Montagemedium ohne DAPI zu montieren, zumindest wenn polymerbasierte Durchflussschieber verwendet werden. Dies verhindert starke Hintergrundsignale während der Bildaufnahme. Bilder sollten von Positionen in der Kanalmitte und nicht von den Kanten aufgenommen werden, da die Schubspannung an den Kanalwänden inhomogen ist. Wir empfehlen, mindestens 5-10 Bilder pro biologischer Replikation und Zustand zufälliger Bereiche entlang der Mittleren Region aufzunehmen. Normalerweise werden 3 oder mehr biologische Replikate verwendet, um statistische Relevanz zu erlangen. Für die Bildanalyse empfehlen wir die Verwendung der Makrofunktion ImageJ/FIJI. Im obigen Protokoll haben wir ein ImageJ-Makro erwähnt, das geeignet ist, zytosolische und nukleäre PLA-Ereignisse basierend auf der DAPI-Färbung zu zählen. Benutzer sollten sich darüber im Klaren sein, dass Parameter wie die Partikelgröße in Abhängigkeit von der Kerngröße oder größeren / kleineren PLA-Punkten angepasst werden müssen. Das Makro speichert die Pla-Schwellenbilder und -masken, die mit Rohbildern verglichen werden sollten, um die Spezifität der PLA-Signalerkennung zu bewerten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode eine schnelle und effiziente räumliche und quantitative Analyse der Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen ermöglicht. Es wird den Wissenschaftlern ermöglichen, die Auswirkungen der SMAD-Komplexbildung auf die Atherogenese und Gefäßerkrankungen im Allgemeinen weiter zu entschlüsseln. Es kann außerdem angepasst werden, um die Folgen der Nähe verschiedener Proteine in diesen vaskulären Pathologien zu untersuchen.

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Wir danken Dr. Maria Reichenbach und Dr. Christian Hiepen für ihre Unterstützung beim Flow-Setup-System und Eleanor Fox und Yunyun Xiao für die kritische Lektüre des Manuskripts. P-L.M. wurde von der internationalen Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) gefördert. PK wurde vom DFG-SFB1444 gefördert. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.