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Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.
Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalisierung ist während der Entwicklung und Homöostase des Gefäßsystems streng reguliert und ausgeglichen Daher führt eine Deregulation in diesem Signalweg zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie und Atherosklerose. Endothelzellen (ECs), als innerste Schicht der Blutgefäße, sind ständig Flüssigkeitsscherstress (SS) ausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass abnormale Muster von Fluid-SS die TGFβ / BMP-Signalgebung verbessern, die zusammen mit anderen Reizen eine Atherogenese induzieren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass atheroprones, niedriges laminares SS die TGFβ / BMP-Signalisierung verbessert, während atheroprotektives, hochlaminares SS diese Signalisierung verringert. Um die Aktivierung dieser Signalwege effizient zu analysieren, haben wir einen Workflow entwickelt, um die Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter niedrigen laminaren SS- und hohen laminaren SS-Bedingungen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen pneumatischen Pumpensystems und eines Proximity Ligation Assay (PLA) zu untersuchen.
Aktive TGFβ/BMP-Signalisierung erfordert die Bildung von trimeren SMAD-Komplexen, die aus zwei regulatorischen SMADs (R-SMAD) bestehen; SMAD2/3 bzw. SMAD1/5/8 für TGFβ bzw. BMP Signalisierung) mit einem gemeinsamen Mediator SMAD (Co-SMAD; SMAD4). Mit Hilfe von PLA, das auf verschiedene Untereinheiten des trimeren SMAD-Komplexes abzielt, d.h. entweder R-SMAD/co-SMAD oder R-SMAD/R-SMAD, kann die Bildung aktiver SMAD-Transkriptionsfaktorkomplexe quantitativ und räumlich mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.
Die Verwendung von Strömungsschienen mit 6 kleinen parallelen Kanälen, die in Reihe geschaltet werden können, ermöglicht die Untersuchung der Komplexbildung des Transkriptionsfaktors und die Einbeziehung notwendiger Kontrollen.
Der hier erläuterte Workflow kann leicht für Studien angepasst werden, die auf die Nähe von SMADs zu anderen Transkriptionsfaktoren oder zu Transkriptionsfaktorkomplexen außer SMADs unter verschiedenen flüssigen SS-Bedingungen abzielen. Der hier vorgestellte Workflow zeigt eine schnelle und effektive Möglichkeit, die fluid-SS-induzierte TGFβ/BMP-Signalisierung in ECs sowohl quantitativ als auch räumlich zu untersuchen.
Proteine der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGFβ) sind pleiotrope Zytokine mit einer Vielzahl von Mitgliedern, darunter TGFβs, knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und Activine1,2. Die Ligandenbindung induziert die Bildung von Rezeptoroligomeren, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der zytosolischen regulatorischen SMAD (R-SMAD) führen. Je nach Unterfamilie der Liganden werden unterschiedliche R-SMADs aktiviert1,2. Während TGFβs und Activine hauptsächlich die Phosphorylierung von SMAD2/3 induzieren, induzieren BMPs die SMAD1/5/8-Phosphorylierung. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass BMPs und TGFβs/Activine auch R-SMADs der jeweiligen anderen Unterfamilie in einem als "laterale Signalisierung" bezeichneten Prozess aktivieren3,4,5,6,7,8 und dass es gemischte SMAD-Komplexe gibt, die sowohl aus SMAD1/5 als auch AUS SMAD2/3 bestehen, Mitglieder3,9 . Zwei aktivierte R-SMADs bilden anschließend trimerische Komplexe mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Diese Transkriptionsfaktorkomplexe sind dann in der Lage, in den Zellkern zu translozieren und die Transkription von Zielgenen zu regulieren. SMADs können mit einer Vielzahl verschiedener transkriptioneller Koaktivatoren und Co-Repressoren interagieren, was zur Diversifizierung der Möglichkeiten zur Regulierung von Zielgenen führt10. Die Deregulierung der SMAD-Signalgebung hat schwerwiegende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten. Dementsprechend kann eine unausgewogene TGFβ/BMP-Signalgebung zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie oder Atherosklerose führen3,11,12,13,14.
Endothelzellen (ECs) bilden die innerste Schicht der Blutgefäße und sind daher Scherstress (SS) ausgesetzt, einer Reibungskraft, die durch den viskosen Blutfluss ausgeübt wird. Interessanterweise werden ECs, die sich in den Teilen des Gefäßsystems befinden, die einem hohen Maß an einheitlichem, laminarem SS ausgesetzt sind, in einem homöostatischen und ruhenden Zustand gehalten. Im Gegensatz dazu sind ECs, die eine niedrige, ungleichmäßige SS erfahren, z. B. bei Verzweigungen oder der geringeren Krümmung des Aortenbogens, proliferativ und aktivieren Entzündungswege15. Im Gegenzug neigen Stellen von dysfunktionalen ECs dazu, Atherosklerose zu entwickeln. Interessanterweise zeigen ECs in diesen atheropronen Bereichen ungewöhnlich hohe Konzentrationen von aktiviertem SMAD2/3 und SMAD1/516,17,18. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass eine verbesserte TGFβ/BMP-Signalisierung ein frühes Ereignis in der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen19 ist und eine Interferenz mit der BMP-Signalgebung die vaskuläre Entzündung, die Atherombildung und die damit verbundene Verkalkung deutlich reduziert20.
Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine biochemische Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in situ21,22. Es beruht auf der Spezifität von Antikörpern verschiedener Spezies, die Zielproteine von Interesse binden können, was den hochspezifischen Nachweis endogener Proteininteraktionen auf Einzelzellebene ermöglicht. Dabei müssen primäre Antikörper in einem Abstand von weniger als 40 nm an ihr Zielepitop binden, um den Nachweis zu ermöglichen23. Daher ist PLA gegenüber herkömmlichen Co-Immunpräzipitationsansätzen, bei denen mehrere Millionen Zellen benötigt werden, um endogene Proteininteraktionen nachzuweisen, von großem Vorteil. Bei PLA binden speziesspezifische sekundäre Antikörper, kovalent verknüpft mit DNA-Fragmenten (sogenannte Plus- und Minus-Sonden), die primären Antikörper und wenn die proteininteressierten Proteine interagieren, kommen Plus- und Minus-Sonden in unmittelbarer Nähe. Die DNA wird im folgenden Schritt ligiert und die Rolling Circle Amplification der zirkulären DNA wird ermöglicht. Während der Amplifikation binden fluoreszenzmarkierte komplementäre Oligonukleotide an die synthetisierte DNA, so dass diese Proteininteraktionen durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anzahl der aktiven SMAD-Transkriptionskomplexe unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen in vitro unter Verwendung von PLA quantitativ zu vergleichen. SS wird über ein programmierbares pneumatisches Pumpensystem erzeugt, das in der Lage ist, laminaren unidirektionalen Durchfluss definierter Füllstände zu erzeugen und schrittweise Erhöhungen der Durchflussraten zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen SMAD1/5 oder SMAD2/3 mit SMAD4 sowie von Mixed-R-SMAD-Komplexen. Es kann leicht erweitert werden, um Wechselwirkungen von SMADs mit transkriptionellen Co-Regulatoren oder auf andere Transkriptionsfaktorkomplexe als SMADs zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte des unten dargestellten Protokolls.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Protokolls. (A) Zellen, die in 6-Kanal-Objektträgern ausgesät sind, werden mit einem pneumatischen Pumpensystem einer Schubbeanspruchung ausgesetzt. (B) Feste Zellen werden für PLA-Experimente oder für Kontrollbedingungen verwendet. (C) Bilder von PLA-Experimenten werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der Analysesoftware ImageJ analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Exposition gegenüber Zellkultur- und Flüssigkeitsscherstress
HINWEIS: Menschliche Nabelschnurvenen-ECs (HUVECs) wurden als Beispiel verwendet, um die SS-induzierte Interaktion von SMADs zu untersuchen. Das unten beschriebene Protokoll kann auf jeden SS-responsiven Zelltyp angewendet werden.
2. Fixierung
3. Blockierung und primäre Antikörperinkubation
4. Pla-Sonden-Inkubation
HINWEIS: Für alle Schritte in Abschnitt 4.1-7.3 werden die Waschpuffer A und B bei 4 °C gelagert und müssen vor der Verwendung auf RT erwärmt werden.
5. Ligatur
6. Verstärkung
7. Montage
8. Bilderfassung
9. Bildanalyse und Quantifizierung mit ImageJ/FIJI
Wir haben pla zuvor verwendet, um Wechselwirkungen verschiedener SMAD-Proteine3 zu detektieren und scherspannungsinduzierte Veränderungen in der SMAD-Phosphorylierung zu analysieren28.
Hier wurden beide Methoden mit dem oben beschriebenen Protokoll kombiniert. HUVECs wurden einer Scherspannung von 1 Dyn/cm2 und 30 Dyn/cm2 ausgesetzt und auf Wechselwirkungen von SMAD-Transkriptionsfaktoren analysiert. Wir zeigen, dass im Vergleich zur hohen Scherspannung (30 dyn/cm2) die geringe Scherspannung (1 dyn/cm2) zu einem signifikanten Anstieg der SMAD1-SMAD2/3-Wechselwirkungen, der sogenannten gemischten SMAD-Komplexe sowohl im Zytosol als auch in den Kernen der analysierten Zellen führt (Abbildung 2A, unteres Feld). PLA-Ereignisse sind in beiden Proben als unterschiedliche Flecken sichtbar, und man kann in Bezug auf die DAPI-Färbung zwischen zytosolischen und nuklearen Ereignissen unterscheiden (Abbildung 2A, oberes Bild). Im Gegensatz dazu zeigten Antikörperkontrollen, bei denen nur einer der beiden primären Antikörper, aber dennoch beide PLA-Sonden inkubiert wurden, eine vernachlässigbare Anzahl von PLA-Signalen (Abbildung 2B). Daraus lässt sich schließen, dass das Experiment erfolgreich war.
Abbildung 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA im Vergleich verschiedener Antikörperkonzentrationen. (A) Konfokale Fluoreszenzbilder und Quantifizierung von SMAD2/3-SMAD1-PLA in HUVECs, die bei 24 h der angegebenen SS-Spiegel exponiert wurden. Antikörper-Verdünnungsverhältnis: 1:100. (B) Konfokale Bilder von Einzelantikörperkontrollen für PLA in A. (C) Konfokale Fluoreszenzbilder und Quantifizierung von SMAD2/3-SMAD1-PLA in HUVECs, die bei 24 h der angegebenen SS-Spiegel exponiert wurden. Antikörper-Verdünnungsverhältnis: 1:50. Maßstabsleisten für A-C: 20 μm und 10 μm beim Vergrößern. Dyne entspricht dyn/cm2. Die verwendeten Antikörper waren Kaninchen-Anti-SMAD2/3 und Maus-Anti-SMAD1 (siehe Materialtabelle). Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um zu zeigen, wie unterschiedliche Konzentrationen von Antikörpern die PLA-Ergebnisse verändern, wurde das gleiche Experiment mit einer 1:50- statt einer 1:100-Verdünnung von Antikörpern durchgeführt. Unter diesen Bedingungen führt die doppelte Menge an Antikörpern zu mehr als vierfach höheren PLA-Signalen pro Zelle (vgl . Abbildung 2A und Abbildung 2C). Der Signalunterschied zwischen 1 dyn/cm2 und 30 dyn/cm2 nimmt ab, wenn eine höhere Antikörperkonzentration verwendet wird und die statistische Signifikanz für die gesamten und zytosolischen PLA-Ereignisse verloren geht (Abbildung 2A, unteres Panel; Abbildung 2C, unterer Bereich). Dies könnte auf die Signalkoaleszenz und Probleme bei der Unterscheidung von PLA-Ereignissen zurückzuführen sein. Wenn eine solche Akkumulation von Signalen auftritt, sollten die Antikörperkonzentrationen verringert werden.
Darüber hinaus zeigten wir, dass selbst hergestellte Puffer zur Blockierung und Antikörperverdünnung als Alternative für kommerzielle Puffer verwendet werden können, die in in in situ PLA-Kits enthalten sind. PLA-Ereignisse pro Zelle wurden für SMAD1-SMAD2/3 (Abbildung 3A versus Abbildung 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Abbildung 3B versus Abbildung 3E) und pSMAD1/5-SMAD4 (Abbildung 3C versus Abbildung 3F) unter 1 Dyn/cm2 und 30 Dyn/cm2 unter Verwendung kommerzieller Lösungen (Abbildung 3A-C) oder selbst hergestellter BSA/PBS-basierter Lösungen (Abbildung 3D-F) verglichen. ). Quantifizierungen sowohl für kommerzielle als auch für selbst hergestellte Verdünnungsmittel-/Blockierungslösungen zeigen den gleichen Trend von PLA-Signalen in zytosolischen und nuklearen Bereichen. Die Gesamtzahl der PLA-Ereignisse pro Zelle ist jedoch höher, wenn kommerzielle Lösungen verwendet werden (Abbildung 3A-C, untere Panels im Vergleich zu Abbildung 3D-F, untere Panels).
Abbildung 3: PLA-Experiment zum Vergleich von kommerziellen und selbst hergestellten Antikörperpuffern. Konfokale Bilder (oberer Teil jedes Panels) und Quantifizierung (unterer Teil jedes Panels) verschiedener SMAD-SMAD PLAs in HUVECs, die 24 Stunden lang den angegebenen Scherspannungsniveaus ausgesetzt waren. (A-C) Kommerzielle Puffer (siehe Materialtabelle). (D-F) Selbst hergestellte Puffer (3% BSA in PBS zur Blockierung, 1% BSA in PBS zur Antikörperverdünnung). Alle primären Antikörper wurden 1:100 verdünnt. Maßstabsleiste, 20 μM (10 μM für Zoom-In). Die statistische Signifikanz wurde mit einem beidseitigen t-Test berechnet. ns - nicht signifikant, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Die Werte werden als Mittelwert + REM dargestellt. Dyne entspricht dyn/cm2. Verwendete Antikörper waren Kaninchen-Anti-SMAD2/3, Maus-Anti-SMAD1, Kaninchen-Antiphospho SMAD1/5 und Maus-Anti-SMAD4 (siehe Materialtabelle). Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wir haben auch ein Beispiel für ein gescheitertes PLA-Experiment aufgenommen. Hier wurde eine Kombination von SMAD2/3-SMAD4-Antikörpern verwendet, bei der der SMAD4-Antikörper nicht für die Durchführung von Immunfluoreszenzexperimenten geeignet war. Im Vergleich zu einzelnen Antikörperkontrollen wurde weder in den 1 dyn/cm2- noch in den 30 dyn/cm2-Proben ein Anstieg der Flecken beobachtet (Abbildung 4A versus Abbildung 4B). Da die Bildung von SMAD2/3-SMAD4-Komplexen durch Scherspannung induziert wird (siehe Abbildung 3B,E), kann gefolgert werden, dass dieses PLA-Experiment erfolglos war. Dies unterstreicht die Bedeutung der Auswahl der richtigen Antikörperkombinationen zum Nachweis von PLA-Ereignissen, da Die Orientierung und der Abstand der gebundenen Antikörper für ein erfolgreiches Abkühlen der Oligonukleotidsonden entscheidend sein können.
Abbildung 4: Beispiel für fehlgeschlagenes PLA-Experiment. Konfokale Bilder, Maßstabsleiste: 20 μm und 10 μm beim Vergrößern. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Einzelne Antikörperkontrollen. Die verwendeten Antikörper waren Maus-Anti-SMAD2/3 und Kaninchen-Anti-SMAD4 (siehe Materialtabelle). Dyne entspricht dyn/cm2. Für jede Bedingung wurden 5 zufällige Bereiche entlang der Mitte des Strömungskanals für die Bildaufnahme verwendet. N=1 biologisches Replikat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das hier beschriebene PLA-basierte Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, die Nähe von zwei Proteinen (z. B. deren direkte Interaktion) in ECs, die Scherspannung ausgesetzt sind, mit quantitativer und räumlicher Auflösung zu bestimmen. Durch den Einsatz von Strömungsobjektträgern mit mehreren parallelen Kanälen können mehrere verschiedene Proteininteraktionen gleichzeitig in Zellen unter identischen mechanischen Bedingungen untersucht werden. Im Gegensatz dazu verwenden speziell angefertigte Durchflusskammersysteme oft einen einzigen Kanal, der um einen Glasdeckglas herum aufgebaut ist, was nur ein einziges PLA-Experiment ohne die erforderlichen Steuerungen pro Objektträger und Pumpe ermöglichen würde. Obwohl sich dieses Protokoll auf den Nachweis von SMAD-Interaktionen konzentriert, kann es angepasst werden, um andere Proteininteraktionen zu erkennen. Die Analyse der Ergebnisse muss jedoch sorgfältig durchgeführt werden, da sich auch zwei Proteine in unmittelbarer Nähe befinden können, ohne Komplexe zu bilden. Sind eindeutige Aussagen über Wechselwirkungen von Proteinen erwünscht, sollten PLA-Experimente durch zusätzliche Methoden wie Co-Immunpräzipitationen ergänzt werden. Darüber hinaus kann PLA nicht zum Nachweis der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Zellen verwendet werden, da Proben für nachfolgende Antikörperbindungs- und DNA-Amplifikationsschritte fixiert werden müssen.
Für den erfolgreichen Nachweis von Proteininteraktionen durch PLA besteht der kritischste Schritt darin, eine Kombination von primären Antikörpern zu wählen, die mehrere Kriterien erfüllen: (1) Die Antikörper, die die einzelnen Proteinpartner nachweisen, müssen in verschiedenen Spezies (z. B. Maus oder Kaninchen) erzeugt werden, da die sekundären Antikörper speziesspezifisch sind; Im Idealfall wurden Antikörper bereits erfolgreich mit der konventionellen Immunfluoreszenzmikroskopie getestet; (2) Der Abstand zwischen epitopgebundenen Antikörpern sollte <40 nm23 betragen; (3) Da die Affinitäten für die Antikörper-Epitop-Bindung unterschiedlich sein können, muss die Endkonzentration der verwendeten Antikörper für jede experimentelle Umgebung angepasst werden, wie hier gezeigt (Abbildung 2A, unteres Panel versus Abbildung 2C, unteres Panel). Wenn also nur sehr wenige, aber spezifische PLA-Ereignisse nachgewiesen werden, kann es sich lohnen, die Menge der verwendeten Antikörper zu erhöhen. Dies muss jedoch sorgfältig titriert werden, um Übersättigung und unspezifische Bindungsereignisse zu vermeiden. Außerdem muss die in Kontrollproben verwendete Antikörperkonzentration mit der in den PLA-Proben verwendeten Konzentration übereinstimmen.
Wie bei jedem anderen biochemischen Assay sind auch bei PLA geeignete Kontrollen unverzichtbar. Eine unspezifische Bindung der verwendeten Antikörper könnte beispielsweise dazu führen, dass PLA-Signale von nur einem primären Antikörper stammen. Daher sollten essentielle Antikörperkontrollen für PLA-Experimente nur die Zugabe eines der beiden primären Antikörper, aber beider PLA-Sonden (Plus und Minus) beinhalten. Darüber hinaus können Kontrollen ohne Zugabe von Antikörpern verwendet werden, um die unspezifische Bindung der PLA-Sonden an die Probe zu bestimmen. Im Allgemeinen sollten diese technischen Kontrollen nur sehr wenigen PLA-Signalen nein liefern. Wenn mehrere Signale beobachtet werden, sollte die Konzentration des verwendeten primären Antikörpers und seine Spezifität überdacht werden. Darüber hinaus ist es sinnvoll, wenn möglich eine positive biologische Kontrolle einzubeziehen. In dem oben beschriebenen Protokoll könnte dies eine Stimulation mit einem BMP-Liganden sein, von dem bekannt ist, dass er die Phosphorylierung von SMADs und damit die Bildung trimerischer Komplexe mit SMAD4 induziert.
Für PLA-Experimente wird normalerweise empfohlen, Zellen zu verwenden, die zu 50-70% konfluent sind, da dies das Eindringen von Reagenzien vereinfacht. Bei der Durchführung von Experimenten mit ECs würden wir jedoch strikt dagegen argumentieren, es sei denn, die Semi-Konfluenz ist Teil des experimentellen Aufbaus. Im lebenden Organismus ECs bilden Monoschichten mit engen Zell-zu-Zell-Verbindungen, die für die EC-Homöostase und Mechanotransduktion unerlässlich sind29. Daher könnten Experimente an nicht konfluenten ECs zu falschen Ergebnissen führen. Darüber hinaus neigen nicht konfluente Zellen eher dazu, sich von Strömungskanalobjektträgern zu lösen, wenn während des Experiments eine hohe Scherspannung verwendet wird. Wir empfehlen, Zellen (2-2,5 x 106 Zellen/ ml, siehe Protokollschritt 1.2) zwei bis drei Tage vor dem experimentellen Start zu säen, da EC-Monoschichten Zeit benötigen, um reife Verbindungen zu bilden und zu entwickeln. Daher würden wir nicht empfehlen, eine höhere Anzahl von Zellen (>2,5 x 106 Zellen / ml) in Strömungskanälen nur einen Tag vor dem Experiment zu säen, um eine konfluente Monoschicht zu erreichen.
Obwohl verschiedene flüssige Montagemedien, die DAPI enthalten, existieren, lohnt es sich, einen separaten DAPI-Färbeschritt einzuschließen und die Zellen mit flüssigem Montagemedium ohne DAPI zu montieren, zumindest wenn polymerbasierte Durchflussschieber verwendet werden. Dies verhindert starke Hintergrundsignale während der Bildaufnahme. Bilder sollten von Positionen in der Kanalmitte und nicht von den Kanten aufgenommen werden, da die Schubspannung an den Kanalwänden inhomogen ist. Wir empfehlen, mindestens 5-10 Bilder pro biologischer Replikation und Zustand zufälliger Bereiche entlang der Mittleren Region aufzunehmen. Normalerweise werden 3 oder mehr biologische Replikate verwendet, um statistische Relevanz zu erlangen. Für die Bildanalyse empfehlen wir die Verwendung der Makrofunktion ImageJ/FIJI. Im obigen Protokoll haben wir ein ImageJ-Makro erwähnt, das geeignet ist, zytosolische und nukleäre PLA-Ereignisse basierend auf der DAPI-Färbung zu zählen. Benutzer sollten sich darüber im Klaren sein, dass Parameter wie die Partikelgröße in Abhängigkeit von der Kerngröße oder größeren / kleineren PLA-Punkten angepasst werden müssen. Das Makro speichert die Pla-Schwellenbilder und -masken, die mit Rohbildern verglichen werden sollten, um die Spezifität der PLA-Signalerkennung zu bewerten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode eine schnelle und effiziente räumliche und quantitative Analyse der Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen ermöglicht. Es wird den Wissenschaftlern ermöglichen, die Auswirkungen der SMAD-Komplexbildung auf die Atherogenese und Gefäßerkrankungen im Allgemeinen weiter zu entschlüsseln. Es kann außerdem angepasst werden, um die Folgen der Nähe verschiedener Proteine in diesen vaskulären Pathologien zu untersuchen.
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Wir danken Dr. Maria Reichenbach und Dr. Christian Hiepen für ihre Unterstützung beim Flow-Setup-System und Eleanor Fox und Yunyun Xiao für die kritische Lektüre des Manuskripts. P-L.M. wurde von der internationalen Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) gefördert. PK wurde vom DFG-SFB1444 gefördert. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
FIJI | Image Analysis software | ||
Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
HUVECs | |||
ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
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