Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).

La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.

El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios.

El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.

Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y ^activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP inducen la fosforilación de SMAD1/5/8. Sin embargo, se acumulan evidencias de que los BMP y TGFβs/Activinas también activan los R-SMAD de la otra subfamilia respectiva, en un proceso denominado como 'señalización lateral'3,4,5,6,7,8 y que existen complejos SMAD mixtos formados por ambos, SMAD1/5 y SMAD2/3, ^miembros3,9 . Dos R-SMAD activados posteriormente forman complejos triméricos con el mediador común SMAD4. Estos complejos de factores de transcripción son capaces de translocarse al núcleo y regular la transcripción de genes diana. Los SMADs pueden interactuar con una variedad de diferentes co-activadores transcripcionales y co-represores, lo que lleva a la diversificación de las posibilidades de regular los genes ^diana10. La desregulación de la señalización SMAD tiene graves implicaciones en una variedad de enfermedades. En línea con esto, la señalización desequilibrada de TGFβ/BMP puede conducir a patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria o aterosclerosis3,11,12,13,14.

Las células endoteliales (CE) forman la capa más interna de los vasos sanguíneos y, por lo tanto, están expuestas al estrés cortante (SS), una fuerza de fricción ejercida por el flujo viscoso de la sangre. Curiosamente, las CE que residen en las partes de la vasculatura, que están expuestas a altos niveles de SS laminar uniforme, se mantienen en un estado homeostático y quiescente. Por el contrario, las CE que experimentan SS bajas y no uniformes, por ejemplo, en bifurcaciones o en la menor curvatura del arco aórtico, son proliferativas y activan vías ^{inflamatorias15}. A su vez, los sitios de CE disfuncionales son propensos a desarrollar aterosclerosis. Curiosamente, las CE en estas áreas de ateróprona muestran niveles aberrantemente altos de SMAD2/3 y SMAD1/^{516 activados,17,18}. En este contexto, se encontró que la señalización mejorada de TGFβ/BMP era un evento temprano en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas19 y se encontró que la interferencia con la señalización de BMP reduce notablemente la inflamación vascular, la formación de ateroma y la calcificación ^asociada20.

El Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA) es una técnica bioquímica para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína21,22. Se basa en la especificidad de anticuerpos de diferentes especies que pueden unirse a proteínas diana de interés, lo que permite una detección altamente específica de interacciones de proteínas endógenas a nivel de una sola célula. Aquí, los anticuerpos primarios tienen que unirse a su epítopo objetivo a una distancia de menos de 40 nm para permitir la ^detección23. Por lo tanto, el PLA es muy beneficioso sobre los enfoques tradicionales de coinmunoprecipitación, donde se necesitan varios millones de células para detectar interacciones endógenas de proteínas. En el PLA, los anticuerpos secundarios específicos de la especie, unidos covalentemente a fragmentos de ADN (denominados sondas Plus y Minus), se unen a los anticuerpos primarios y si las proteínas de interés interactúan, las sondas Plus y Minus se acercan mucho. El ADN se liga en el siguiente paso y la amplificación del círculo rodante del ADN circular es posible. Durante la amplificación, los oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente se unen al ADN sintetizado, lo que permite que estas interacciones proteicas se visualicen mediante microscopía de fluorescencia convencional.

El protocolo descrito aquí permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de transcripción SMAD activos en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas in vitro utilizando PLA. SS se genera a través de un sistema de bomba neumática programable que es capaz de generar flujo unidireccional laminar de niveles definidos y permite aumentos escalonados de los caudales. Este método permite la detección de interacciones entre SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, así como complejos mixtos-R-SMAD. Se puede ampliar fácilmente para analizar las interacciones de los SMAD con los co-reguladores transcripcionales o con complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD. La Figura 1 muestra los principales pasos del protocolo que se presentan a continuación.

Figura 1: Representación esquemática del protocolo descrito. (A) Las células sembradas en portaobjetos de 6 canales se exponen a la tensión de cizallamiento con un sistema de bomba neumática. (B) Las células fijas se utilizan para experimentos de PLA o para condiciones de control. (C) Las imágenes de los experimentos de PLA se adquieren con un microscopio de fluorescencia y se analizan utilizando el software de análisis ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos

NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS.

1. Cubra el portaobjetos de 6 canales con gelatina de piel porcina al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 °C.
2. HUVEC de semillas en portaobjetos pre-recubiertos de 6 canales a una densidad de 2,5 x ¹⁰⁶ células por ml en 30 μL de medio completo M199.
   NOTA: Para obtener más información sobre cómo sembrar celdas en la diapositiva de flujo, consulte la ^referencia24.
3. Deje que las células se adhieran durante 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada.
4. Añadir 60 μL de medio completo M199 precalentado a cada uno de los reservorios.
5. Cultivo durante 2 días, con un intercambio medio suave una vez al día, a 37 °C en una incubadora humidificada.
   1. Aspire los reservorios completamente, agregue 120 μL de medio completo M199 precalentado en uno de los reservorios y aspire desde el otro lado.
   2. Añadir 60 μL de medio completo M199 precalentado a ambos reservorios.
6. Ensamble e inicie la configuración de flujo como se detalla en la ^referencia25.
   1. Montar tubos en unidades fluídicas. Aquí, se utilizan tubos de silicona con un diámetro de 0,8 mm y 1,6 mm para aplicar esfuerzos de corte de 1 dina/^cm2 y 30 dinas/^cm2, respectivamente.
      NOTA: El material y la longitud del tubo deben permanecer constantes, ya que los cambios podrían influir en la tensión de corte resultante. En general, se pueden utilizar otras combinaciones de sistemas de bomba y tuberías, siempre que se conozca la tensión de cizallamiento resultante y la bomba cree un flujo laminar constante.
   2. Llene los depósitos con una cantidad adecuada de medio completo M199 precalentado (mínimo 10 ml).
   3. Conecte las unidades fluídicas con el tubo al sistema de bombeo y realice un pre-funcionamiento sin celdas para equilibrar el medio y eliminar el aire ^restante25.
   4. Conecte en serie los canales individuales de la diapositiva de 6 canales entre sí mediante tubos de conexión serie. El primer y el último canal de la corredera se conectarán a la tubería ensamblada en 1.6.1 (consulte la Figura 1A para un esquema). Tenga cuidado de no introducir aire en el sistema, ya que esto podría dañar gravemente las células. Puede encontrarse más información sobre la conexión serie en la ^referencia26.
   5. Para la exposición de las células a altos niveles de esfuerzo cortante (>20 dyn/^cm2), utilice una fase de rampa, es decir, aumente la tensión de cizallamiento por pasos con las fases de adaptación. Los pasos se pueden establecer en incrementos de 5 dinas/^cm2 por 30 min.

2. Fijación

1. Separe las correderas de las bombas después de la exposición al fluido SS. Use abrazaderas en el tubo al separarse, para evitar el derrame medio en la incubadora.
2. El flujo de transferencia inmediata se desliza sobre hielo, mientras que el tubo restante se separa secuencialmente. Al retirar el tubo de los depósitos, el depósito del otro lado debe mantenerse cerrado con un dedo para evitar atrapar burbujas de aire en el canal. Esto podría interferir con los pasos de fijación.
3. Manteniendo las células en hielo, aspire el medio cuidadosamente desde los reservorios, pero no desde el canal donde residen las células. Posteriormente, lavar las muestras con PBS estéril en frío (4 °C) con tres veces el volumen del canal (90 μL). Agregue PBS en un reservorio y aspire cuidadosamente desde el otro reservorio. Repita este paso en cada uno de los 6 canales por diapositiva.
   NOTA: Para todas las etapas de lavado e incubación, la solución respectiva se agrega en uno de los reservorios, lo que conduce a un intercambio de soluciones en el canal. Para permitir la sustitución completa de soluciones en el canal, el exceso de solución se aspira desde el otro reservorio. La solución en la parte superior de las células en el canal no se elimina. Las células no deben secarse en ningún momento. Por lo tanto, es importante lavar con cuidado sin ninguna inserción de burbujas de aire en los portaobjetos.
4. Fije las células agregando 90 μL de solución tamponada de PFA al 4% en el mismo reservorio donde se agregó el PBS de antemano y aspire de manera similar el líquido del otro reservorio. Repita este paso en cada canal de cada diapositiva. Después de la adición de la solución de PFA, transfiera las muestras del hielo a temperatura ambiente (RT) e incube durante 20 minutos.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y debe manipularse con cuidado. Use guantes y trabaje bajo una campana de humos.
5. Lave las celdas 3x con PBS (RT) agregándolas en un depósito y aspirando cuidadosamente desde el otro depósito. Vacíe solo los depósitos, asegurándose de no secar el canal. Repita este paso para cada uno de los 6 canales por diapositiva.
6. Apague la fijación de PFA agregando 90 μL de cloruro de amonio ambiental de 50 mM en PBS en uno de los reservorios. Aspirar el exceso de solución del otro reservorio. Repita el proceso para cada canal de la diapositiva. Incubar las muestras durante 10 min en RT.
7. Lavar como se describe en el paso 2.5.
   NOTA: En este punto, las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche, o el protocolo puede continuarse inmediatamente con el bloqueo y la incubación primaria de anticuerpos (consulte el paso 3).

3. Bloqueo e incubación primaria de anticuerpos

1. Para permeabilizar las células, agregue 90 μL de Triton-X-100 al 0,3% en PBS en un reservorio vacío y aspire desde el otro reservorio para cada canal. Incubar durante 10 min en RT.
2. Lavar como se describe en el paso 2.5.
3. Añadir 90 μL de solución estéril de bloqueo de PLA en un reservorio de un canal y aspirar desde el otro lado. Repita este paso para cada canal. Bloque durante 1 h a 37 °C en una cámara humidificada.
   1. Para hacer una cámara humidificada, use un plato de 10 cm con tejido húmedo sellado con película de cera y coloque el plato en la incubadora. Alternativamente, se pueden utilizar otros formatos de cámara de humedad que proporcionan una atmósfera húmeda.
      NOTA: Alternativamente, se puede usar una solución de bloqueo de fabricación propia (por ejemplo, 3% (p/v) de BSA en PBS, filtrada estéril).
4. Preparar anticuerpos primarios (1:100) en el diluyente de anticuerpos PLA. Preparar 30 μL de la solución por canal. Agregue ambos anticuerpos primarios simultáneamente y vórtice.
   NOTA: Alternativamente, se puede usar un diluyente de anticuerpos de fabricación propia (por ejemplo, 1% (p/v) de BSA en PBS). Los anticuerpos utilizados aquí son combinaciones de SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 y fosfo-SMAD1/5-SMAD4. La información detallada se puede encontrar en la Tabla de Materiales.
5. Antes de la aplicación de anticuerpos primarios, aspire la solución bloqueadora de los reservorios y, también, con cuidado desde el canal. Pipetear 30 μL de la solución de anticuerpos primario inmediatamente en el canal vacío inclinando el canal mientras se agrega la solución.
   NOTA: Realice la eliminación de la solución de bloqueo y la adición de la solución de anticuerpos canal por canal para garantizar que las células no se sequen en el medio.
6. Incubar muestras con los anticuerpos primarios durante la noche en cámaras humidificadas a 4 °C.
   NOTA: La incubación también se puede realizar durante 1 h a temperatura ambiente, si se desea continuar con los siguientes pasos en el mismo día.

4. Incubación de la sonda PLA

NOTA: Para todos los pasos de la sección 4.1-7.3, los tampones de lavado A y B se almacenan a 4 °C y deben calentarse a RT antes del uso.

1. Diluya las sondas pla (+)-ratón y (-)-conejo a 1:5 en solución de diluyente de anticuerpos PLA (o BSA al 1%). Preparar 30 μL por canal.
2. Lave las muestras 2x durante 5 min utilizando 90 μL del tampón de lavado A en RT agregándolo en uno de los depósitos y aspirando cuidadosamente desde el otro depósito. Repita este paso para cada uno de los 6 canales por diapositiva.
3. Aspire el tampón de lavado A con cuidado y agregue 30 μL de solución de sonda de PLA (preparada en la etapa 4.1), similar a la adición de anticuerpos primarios en la etapa 3.5.
4. Incubar muestras durante 1 h a 37 °C en una cámara humidificada.

5. Ligadura

1. Lave las muestras 2x durante 5 min utilizando 90 μL del tampón de lavado A en RT, como se describe en 4.2.
2. Prepare una dilución 1:5 del tampón de ligadura en agua desionizada. Use este tampón para diluir la enzima ligasa a 1:40 (en hielo). Utilice 30 μL por canal.
3. Aspire completamente el tampón de lavado A y agregue la solución de ligadura como se describe en 3.5.
4. Incubar muestras durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada.

6. Amplificación

1. Lavar las muestras 2x durante 2 min utilizando 90 μL de tampón de lavado A en RT, como se describe en 4.2.
2. Prepare el tampón de amplificación diluyéndolo 1:5 en agua desionizada y úselo para diluir la enzima polimerasa a 1:80 (en hielo). Proteger de la luz. Preparar 30 μL por canal.
3. Aspire completamente el tampón de lavado A e inmediatamente agregue la solución de amplificación preparada en el canal vacío, como se describe en 3.5. Incubar muestras durante 100 min a 37 °C en una cámara humidificada.

7. Montaje

1. Lave las muestras 2x durante 10 min utilizando 90 μL de Wash Buffer B en RT como se describe en 4.2. Añadir DAPI (1:500) a partir de 1 mg/ml de solución madre (en agua desionizada) en el primer lavado para teñir los núcleos. No seque el canal.
2. Diluya el tampón de lavado B en agua desionizada (1:10) y lave 1x con 90 μL de solución B tampón 0.1x como se describe en 4.2.
3. Aspire completamente el tampón de lavado B e inmediatamente agregue 2-3 gotas del medio de montaje líquido en un depósito. Distribúyalo en el canal inclinando la diapositiva. Guarde las muestras a 4 °C en un ambiente humidificado hasta la obtención de imágenes.

8. Adquisición de imágenes

1. Adquirir imágenes usando un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que los filtros respectivos que se ajustan a las sondas pla fluorescentes estén disponibles.
   NOTA: Es beneficioso hacer uso de un microscopio confocal, si es posible, ya que las manchas plasmáticas obtenidas están más definidas. Esto también admite un mayor procesamiento de imágenes y análisis de datos.

9. Análisis y cuantificación de imágenes utilizando ImageJ/FIJI

1. Procese las imágenes exportadas (.tiff) con un programa de procesamiento de imágenes, como ^ImageJ27.
   NOTA: Todos los scripts utilizados dentro de este estudio y que son necesarios para el conteo automático de eventos celulares, nucleares y todos los eventos PLA (por celda) se pueden encontrar en un repositorio de GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Realizar análisis estadísticos utilizando cualquier programa o herramienta adecuada.

Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas ^SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de ^SMAD28.

Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/^cm2 y 30 dinas/^cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en comparación con el alto esfuerzo cortante (30 dyn/^cm2), el bajo esfuerzo cortante (1 dyn/^cm2) conduce a un aumento significativo de las interacciones SMAD1-SMAD2/3, los llamados complejos mixto-SMAD tanto en el citosol como en los núcleos de las células analizadas (Figura 2A, panel inferior). Los eventos plas son visibles como puntos distintos en ambas muestras, y se puede distinguir entre eventos citosólicos y nucleares con referencia a la tinción DAPI (Figura 2A, panel superior). En contraste, los controles de anticuerpos, donde solo se incubó uno de los dos anticuerpos primarios pero aún así ambas sondas de PLA, mostraron un número insignificante de señales de PLA (Figura 2B). Por lo tanto, se puede concluir que el experimento fue exitoso.

Figura 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA comparando diferentes concentraciones de anticuerpos. (A) Imágenes de fluorescencia confocal y cuantificación de SMAD2/3-SMAD1-PLA en HUVECs expuestos a 24 h de los niveles de SS indicados. Relación de dilución de anticuerpos: 1:100. (B) Imágenes confocales de controles de anticuerpos únicos para PLA en A. (C) Imágenes de fluorescencia confocal y cuantificación de SMAD2/3-SMAD1-PLA en HUVEC expuestos a 24 h de los niveles de SS indicados. Relación de dilución de anticuerpos: 1:50. Barras de escala para A-C: 20 μm y 10 μm en zoom in. Dyne es igual a dyn/^cm2. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de conejo y anti-SMAD1 de ratón (ver Tabla de Materiales). Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para mostrar cómo las diferentes concentraciones de anticuerpos cambian los resultados del PLA, se realizó el mismo experimento con una dilución de anticuerpos de 1:50 en lugar de 1:100. En estas condiciones, el doble de la cantidad de anticuerpos da como resultado señales de PLA más de cuatro veces más altas por célula (compare la Figura 2A y la Figura 2C). La diferencia de señales entre 1 dina/^cm2 y 30 dinas/^cm2 disminuye cuando se utiliza una mayor concentración de anticuerpos y se pierde significación estadística para los eventos plasmáticos totales y citosólicos (Figura 2A, panel inferior; Figura 2C, panel inferior). Esto podría deberse a la coalescencia de la señal y a los problemas de distinguir los eventos de PLA. Si se produce tal acumulación de señales, las concentraciones de anticuerpos deben disminuir.

Además, demostramos que los tampones de fabricación propia para el bloqueo y la dilución de anticuerpos se pueden utilizar como alternativa para los tampones comerciales incluidos en los kits de PLA in situ. Los eventos de PLA por célula se compararon para los complejos SMAD1-SMAD2/3 (Figura 3A versus Figura 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Figura 3B versus Figura 3E) y pSMAD1/5-SMAD4 (Figura 3C versus Figura 3F) bajo 1 dina/^cm2 y 30 dinas/^cm2 utilizando soluciones comerciales (Figura 3A-C) o soluciones basadas en BSA/PBS de fabricación propia (Figura 3D-F ). Las cuantificaciones para soluciones de diluyente/bloqueo comerciales y de fabricación propia muestran la misma tendencia de las señales de PLA en áreas citosólicas y nucleares. Sin embargo, el número total de eventos plas por celda es mayor cuando se utilizan soluciones comerciales (Figura 3A-C, paneles inferiores frente a la Figura 3D-F, paneles inferiores).

Figura 3: Experimento de PLA que compara tampones de anticuerpos comerciales y de fabricación propia. Imágenes confocales (parte superior de cada panel) y cuantificación (parte inferior de cada panel) de diferentes PLAs SMAD-SMAD en HUVEC expuestos a 24 horas de niveles de esfuerzo cortante indicados. (A-C) Tampones comerciales (ver Tabla de Materiales). (D-F) Tampones de fabricación propia (3% de BSA en PBS para bloqueo, 1% de BSA en PBS para dilución de anticuerpos). Todos los anticuerpos primarios se diluyeron 1:100. Barra de escala, 20 μM (10 μM para acercar). La significación estadística se calculó con la prueba t de dos caras. ns - no significativo, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores se representan como media + SEM. Dyne es igual a dyn/^cm2. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de conejo, anti-SMAD1 de ratón, antifosfolO de conejo SMAD1/5 y anti-SMAD4 de ratón (ver Tabla de Materiales). Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

También incluimos un ejemplo para un experimento fallido de PLA. Aquí, se utilizó una combinación de anticuerpos SMAD2/3-SMAD4 donde el anticuerpo SMAD4 no era adecuado para realizar experimentos de inmunofluorescencia. En comparación con los controles de anticuerpos únicos, no se observó un aumento de las manchas en las muestras de 1 dina/^cm2 o 30 dinas/^cm2 (Figura 4A versus Figura 4B). Como la formación de complejos SMAD2/3-SMAD4 es inducida por tensión cortante (ver Figura 3B,E), se puede concluir que este experimento de PLA no tuvo éxito. Esto resalta la importancia de elegir las combinaciones correctas de anticuerpos para detectar eventos de PLA, ya que la orientación y la distancia de los anticuerpos unidos podrían ser cruciales para el recocido exitoso de las sondas de oligonucleótidos.

Figura 4: Ejemplo de experimento pla fallido. Imágenes confocales, barra de escala: 20 μm y 10 μm en zoom. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Controles de anticuerpos únicos. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de ratón y anti-SMAD4 de conejo (ver Tabla de Materiales). Dyne es igual a dyn/^cm2. Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de un solo canal que se construye alrededor de una cubierta de vidrio, lo que permitiría un solo experimento de PLA sin los controles necesarios por deslizamiento y bomba. Aunque este protocolo se centra en la detección de interacciones SMAD, se puede adaptar para detectar cualquier otra interacción proteica. Sin embargo, el análisis de los resultados debe hacerse con cuidado, ya que dos proteínas también pueden residir en estrecha proximidad sin formar complejos. Si se desean declaraciones definitivas sobre las interacciones de las proteínas, los experimentos con PLA deben complementarse con métodos adicionales como las coinmunoprecipitaciones. Además, el PLA no se puede utilizar para detectar la interacción proteína-proteína en las células vivas, ya que las muestras deben fijarse para los pasos posteriores de unión de anticuerpos y amplificación del ADN.

Para la detección exitosa de interacciones proteicas por PLA, el paso más crítico es elegir una combinación de anticuerpos primarios que cumplan varios criterios: (1) Los anticuerpos que detectan a los socios proteicos individuales deben generarse en diferentes especies (por ejemplo, ratón o conejo) ya que los anticuerpos secundarios son específicos de la especie; idealmente, los anticuerpos ya fueron probados con éxito por microscopía de inmunofluorescencia convencional; (2) la distancia entre los anticuerpos unidos al epítopo debe ser de <40 ^nm23; (3) como las afinidades para la unión anticuerpo-epítopo pueden diferir, la concentración final de anticuerpos utilizados debe ajustarse para cada entorno experimental, como se muestra aquí (Figura 2A, panel inferior versus Figura 2C, panel inferior). Por lo tanto, si se detectan muy pocos pero específicos eventos de PLA, puede valer la pena aumentar la cantidad de anticuerpos utilizados. Sin embargo, esto debe ser cuidadosamente titulado para evitar la sobresaturación y eventos vinculantes inespecíficos. Además, la concentración de anticuerpos utilizada en las muestras de control debe coincidir con la concentración utilizada en las muestras de PLA.

Como para cualquier otro ensayo bioquímico, los controles adecuados son indispensables en el PLA. La unión inespecífica de los anticuerpos utilizados podría, por ejemplo, conducir a señales de PLA que se originan en un solo anticuerpo primario. Por lo tanto, los controles de anticuerpos esenciales para los experimentos con PLA deben incluir la adición de solo uno de los dos anticuerpos primarios, pero ambas sondas de PLA (más y menos). Además, los controles sin anticuerpos añadidos se pueden utilizar para determinar la unión inespecífica de las sondas pla a la muestra. En general, esos controles técnicos deberían dar lugar a muy pocas señales de EPL. Si se observan varias señales, se debe reconsiderar la concentración del anticuerpo primario utilizado y su especificidad. Además, es útil incluir un control biológico positivo, si es posible. En el protocolo descrito anteriormente, esto podría ser la estimulación con un ligando BMP que se sabe que induce la fosforilación de los SMAD y, por lo tanto, la formación de complejos triméricos con SMAD4.

Para los experimentos con PLA, normalmente se recomienda utilizar células que sean 50-70% confluentes, ya que esto simplifica la penetración de los reactivos. Sin embargo, al realizar experimentos con CE, argumentaríamos estrictamente en contra de esto, excepto si la semiconfluencia es parte de la configuración experimental. In vivo Las CE forman monocapas con uniones estrechas de célula a célula, que son esenciales para la homeostasis y la mecanotransducción de la ^CE29. Por lo tanto, los experimentos con CE no confluentes podrían dar lugar a resultados falsos. Además, las células no confluentes son más propensas a desprenderse de las diapositivas del canal de flujo si se utilizan altos niveles de tensión cortante durante el experimento. Aconsejamos sembrar células (2-2.5 x ¹⁰⁶ células / ml, consulte el paso de protocolo 1.2) dos o tres días antes del inicio experimental, ya que las monocapas ecgénicas necesitan tiempo para formar y desarrollar uniones maduras. Por lo tanto, no recomendaríamos sembrar un mayor número de células (>2,5 x ¹⁰⁶ células/ml) en canales de flujo solo un día antes del experimento para lograr una monocapa confluente.

Aunque existen varios medios de montaje líquidos que contienen DAPI, vale la pena incluir un paso de tinción DAPI separado y montar las celdas con un medio de montaje líquido sin DAPI, al menos si se utilizan guías de flujo basadas en polímeros. Esto evita señales de fondo pesadas durante la adquisición de imágenes. Las imágenes deben adquirirse desde posiciones en el centro del canal en lugar de los bordes, ya que la tensión de corte no es homogénea en las paredes del canal. Recomendamos tomar al menos 5-10 imágenes por réplica biológica y condición de áreas aleatorias a lo largo de la región central. Normalmente se utilizan 3 o más réplicas biológicas para obtener relevancia estadística. Para el análisis de imágenes, aconsejamos utilizar la función de macro ImageJ/FIJI. En el protocolo anterior, mencionamos una macro ImageJ que es adecuada para contar eventos de PLA citosólicos y nucleares basados en la tinción DAPI. Los usuarios deben ser conscientes de que parámetros como el tamaño de partícula deben ajustarse en función del tamaño nuclear o de los puntos PLA más grandes / más pequeños. La macro guarda las imágenes PLA de umbral y las máscaras que deben compararse con las imágenes sin procesar para evaluar la especificidad de la detección de señales PLA.

En conclusión, el método presentado aquí permite un análisis espacial y cuantitativo rápido y eficiente de la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas. Permitirá a los científicos descifrar aún más el impacto de la formación de complejos SMAD en la aterogénesis y la enfermedad vascular en general. Además, se puede adaptar para investigar las consecuencias de la proximidad de diferentes proteínas en esas patologías vasculares.

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.