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Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.
La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).
La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.
El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios.
El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.
Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP inducen la fosforilación de SMAD1/5/8. Sin embargo, se acumulan evidencias de que los BMP y TGFβs/Activinas también activan los R-SMAD de la otra subfamilia respectiva, en un proceso denominado como 'señalización lateral'3,4,5,6,7,8 y que existen complejos SMAD mixtos formados por ambos, SMAD1/5 y SMAD2/3, miembros3,9 . Dos R-SMAD activados posteriormente forman complejos triméricos con el mediador común SMAD4. Estos complejos de factores de transcripción son capaces de translocarse al núcleo y regular la transcripción de genes diana. Los SMADs pueden interactuar con una variedad de diferentes co-activadores transcripcionales y co-represores, lo que lleva a la diversificación de las posibilidades de regular los genes diana10. La desregulación de la señalización SMAD tiene graves implicaciones en una variedad de enfermedades. En línea con esto, la señalización desequilibrada de TGFβ/BMP puede conducir a patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria o aterosclerosis3,11,12,13,14.
Las células endoteliales (CE) forman la capa más interna de los vasos sanguíneos y, por lo tanto, están expuestas al estrés cortante (SS), una fuerza de fricción ejercida por el flujo viscoso de la sangre. Curiosamente, las CE que residen en las partes de la vasculatura, que están expuestas a altos niveles de SS laminar uniforme, se mantienen en un estado homeostático y quiescente. Por el contrario, las CE que experimentan SS bajas y no uniformes, por ejemplo, en bifurcaciones o en la menor curvatura del arco aórtico, son proliferativas y activan vías inflamatorias15. A su vez, los sitios de CE disfuncionales son propensos a desarrollar aterosclerosis. Curiosamente, las CE en estas áreas de ateróprona muestran niveles aberrantemente altos de SMAD2/3 y SMAD1/516 activados,17,18. En este contexto, se encontró que la señalización mejorada de TGFβ/BMP era un evento temprano en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas19 y se encontró que la interferencia con la señalización de BMP reduce notablemente la inflamación vascular, la formación de ateroma y la calcificación asociada20.
El Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA) es una técnica bioquímica para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína21,22. Se basa en la especificidad de anticuerpos de diferentes especies que pueden unirse a proteínas diana de interés, lo que permite una detección altamente específica de interacciones de proteínas endógenas a nivel de una sola célula. Aquí, los anticuerpos primarios tienen que unirse a su epítopo objetivo a una distancia de menos de 40 nm para permitir la detección23. Por lo tanto, el PLA es muy beneficioso sobre los enfoques tradicionales de coinmunoprecipitación, donde se necesitan varios millones de células para detectar interacciones endógenas de proteínas. En el PLA, los anticuerpos secundarios específicos de la especie, unidos covalentemente a fragmentos de ADN (denominados sondas Plus y Minus), se unen a los anticuerpos primarios y si las proteínas de interés interactúan, las sondas Plus y Minus se acercan mucho. El ADN se liga en el siguiente paso y la amplificación del círculo rodante del ADN circular es posible. Durante la amplificación, los oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente se unen al ADN sintetizado, lo que permite que estas interacciones proteicas se visualicen mediante microscopía de fluorescencia convencional.
El protocolo descrito aquí permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de transcripción SMAD activos en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas in vitro utilizando PLA. SS se genera a través de un sistema de bomba neumática programable que es capaz de generar flujo unidireccional laminar de niveles definidos y permite aumentos escalonados de los caudales. Este método permite la detección de interacciones entre SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, así como complejos mixtos-R-SMAD. Se puede ampliar fácilmente para analizar las interacciones de los SMAD con los co-reguladores transcripcionales o con complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD. La Figura 1 muestra los principales pasos del protocolo que se presentan a continuación.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo descrito. (A) Las células sembradas en portaobjetos de 6 canales se exponen a la tensión de cizallamiento con un sistema de bomba neumática. (B) Las células fijas se utilizan para experimentos de PLA o para condiciones de control. (C) Las imágenes de los experimentos de PLA se adquieren con un microscopio de fluorescencia y se analizan utilizando el software de análisis ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos
NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS.
2. Fijación
3. Bloqueo e incubación primaria de anticuerpos
4. Incubación de la sonda PLA
NOTA: Para todos los pasos de la sección 4.1-7.3, los tampones de lavado A y B se almacenan a 4 °C y deben calentarse a RT antes del uso.
5. Ligadura
6. Amplificación
7. Montaje
8. Adquisición de imágenes
9. Análisis y cuantificación de imágenes utilizando ImageJ/FIJI
Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de SMAD28.
Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en comparación con el alto esfuerzo cortante (30 dyn/cm2), el bajo esfuerzo cortante (1 dyn/cm2) conduce a un aumento significativo de las interacciones SMAD1-SMAD2/3, los llamados complejos mixto-SMAD tanto en el citosol como en los núcleos de las células analizadas (Figura 2A, panel inferior). Los eventos plas son visibles como puntos distintos en ambas muestras, y se puede distinguir entre eventos citosólicos y nucleares con referencia a la tinción DAPI (Figura 2A, panel superior). En contraste, los controles de anticuerpos, donde solo se incubó uno de los dos anticuerpos primarios pero aún así ambas sondas de PLA, mostraron un número insignificante de señales de PLA (Figura 2B). Por lo tanto, se puede concluir que el experimento fue exitoso.
Figura 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA comparando diferentes concentraciones de anticuerpos. (A) Imágenes de fluorescencia confocal y cuantificación de SMAD2/3-SMAD1-PLA en HUVECs expuestos a 24 h de los niveles de SS indicados. Relación de dilución de anticuerpos: 1:100. (B) Imágenes confocales de controles de anticuerpos únicos para PLA en A. (C) Imágenes de fluorescencia confocal y cuantificación de SMAD2/3-SMAD1-PLA en HUVEC expuestos a 24 h de los niveles de SS indicados. Relación de dilución de anticuerpos: 1:50. Barras de escala para A-C: 20 μm y 10 μm en zoom in. Dyne es igual a dyn/cm2. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de conejo y anti-SMAD1 de ratón (ver Tabla de Materiales). Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para mostrar cómo las diferentes concentraciones de anticuerpos cambian los resultados del PLA, se realizó el mismo experimento con una dilución de anticuerpos de 1:50 en lugar de 1:100. En estas condiciones, el doble de la cantidad de anticuerpos da como resultado señales de PLA más de cuatro veces más altas por célula (compare la Figura 2A y la Figura 2C). La diferencia de señales entre 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 disminuye cuando se utiliza una mayor concentración de anticuerpos y se pierde significación estadística para los eventos plasmáticos totales y citosólicos (Figura 2A, panel inferior; Figura 2C, panel inferior). Esto podría deberse a la coalescencia de la señal y a los problemas de distinguir los eventos de PLA. Si se produce tal acumulación de señales, las concentraciones de anticuerpos deben disminuir.
Además, demostramos que los tampones de fabricación propia para el bloqueo y la dilución de anticuerpos se pueden utilizar como alternativa para los tampones comerciales incluidos en los kits de PLA in situ. Los eventos de PLA por célula se compararon para los complejos SMAD1-SMAD2/3 (Figura 3A versus Figura 3D), SMAD2/3-SMAD4 (Figura 3B versus Figura 3E) y pSMAD1/5-SMAD4 (Figura 3C versus Figura 3F) bajo 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 utilizando soluciones comerciales (Figura 3A-C) o soluciones basadas en BSA/PBS de fabricación propia (Figura 3D-F ). Las cuantificaciones para soluciones de diluyente/bloqueo comerciales y de fabricación propia muestran la misma tendencia de las señales de PLA en áreas citosólicas y nucleares. Sin embargo, el número total de eventos plas por celda es mayor cuando se utilizan soluciones comerciales (Figura 3A-C, paneles inferiores frente a la Figura 3D-F, paneles inferiores).
Figura 3: Experimento de PLA que compara tampones de anticuerpos comerciales y de fabricación propia. Imágenes confocales (parte superior de cada panel) y cuantificación (parte inferior de cada panel) de diferentes PLAs SMAD-SMAD en HUVEC expuestos a 24 horas de niveles de esfuerzo cortante indicados. (A-C) Tampones comerciales (ver Tabla de Materiales). (D-F) Tampones de fabricación propia (3% de BSA en PBS para bloqueo, 1% de BSA en PBS para dilución de anticuerpos). Todos los anticuerpos primarios se diluyeron 1:100. Barra de escala, 20 μM (10 μM para acercar). La significación estadística se calculó con la prueba t de dos caras. ns - no significativo, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Los valores se representan como media + SEM. Dyne es igual a dyn/cm2. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de conejo, anti-SMAD1 de ratón, antifosfolO de conejo SMAD1/5 y anti-SMAD4 de ratón (ver Tabla de Materiales). Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
También incluimos un ejemplo para un experimento fallido de PLA. Aquí, se utilizó una combinación de anticuerpos SMAD2/3-SMAD4 donde el anticuerpo SMAD4 no era adecuado para realizar experimentos de inmunofluorescencia. En comparación con los controles de anticuerpos únicos, no se observó un aumento de las manchas en las muestras de 1 dina/cm2 o 30 dinas/cm2 (Figura 4A versus Figura 4B). Como la formación de complejos SMAD2/3-SMAD4 es inducida por tensión cortante (ver Figura 3B,E), se puede concluir que este experimento de PLA no tuvo éxito. Esto resalta la importancia de elegir las combinaciones correctas de anticuerpos para detectar eventos de PLA, ya que la orientación y la distancia de los anticuerpos unidos podrían ser cruciales para el recocido exitoso de las sondas de oligonucleótidos.
Figura 4: Ejemplo de experimento pla fallido. Imágenes confocales, barra de escala: 20 μm y 10 μm en zoom. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Controles de anticuerpos únicos. Los anticuerpos utilizados fueron anti-SMAD2/3 de ratón y anti-SMAD4 de conejo (ver Tabla de Materiales). Dyne es igual a dyn/cm2. Para cada condición se utilizaron 5 áreas aleatorias a lo largo del centro del canal de flujo para la adquisición de imágenes. N=1 réplica biológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de un solo canal que se construye alrededor de una cubierta de vidrio, lo que permitiría un solo experimento de PLA sin los controles necesarios por deslizamiento y bomba. Aunque este protocolo se centra en la detección de interacciones SMAD, se puede adaptar para detectar cualquier otra interacción proteica. Sin embargo, el análisis de los resultados debe hacerse con cuidado, ya que dos proteínas también pueden residir en estrecha proximidad sin formar complejos. Si se desean declaraciones definitivas sobre las interacciones de las proteínas, los experimentos con PLA deben complementarse con métodos adicionales como las coinmunoprecipitaciones. Además, el PLA no se puede utilizar para detectar la interacción proteína-proteína en las células vivas, ya que las muestras deben fijarse para los pasos posteriores de unión de anticuerpos y amplificación del ADN.
Para la detección exitosa de interacciones proteicas por PLA, el paso más crítico es elegir una combinación de anticuerpos primarios que cumplan varios criterios: (1) Los anticuerpos que detectan a los socios proteicos individuales deben generarse en diferentes especies (por ejemplo, ratón o conejo) ya que los anticuerpos secundarios son específicos de la especie; idealmente, los anticuerpos ya fueron probados con éxito por microscopía de inmunofluorescencia convencional; (2) la distancia entre los anticuerpos unidos al epítopo debe ser de <40 nm23; (3) como las afinidades para la unión anticuerpo-epítopo pueden diferir, la concentración final de anticuerpos utilizados debe ajustarse para cada entorno experimental, como se muestra aquí (Figura 2A, panel inferior versus Figura 2C, panel inferior). Por lo tanto, si se detectan muy pocos pero específicos eventos de PLA, puede valer la pena aumentar la cantidad de anticuerpos utilizados. Sin embargo, esto debe ser cuidadosamente titulado para evitar la sobresaturación y eventos vinculantes inespecíficos. Además, la concentración de anticuerpos utilizada en las muestras de control debe coincidir con la concentración utilizada en las muestras de PLA.
Como para cualquier otro ensayo bioquímico, los controles adecuados son indispensables en el PLA. La unión inespecífica de los anticuerpos utilizados podría, por ejemplo, conducir a señales de PLA que se originan en un solo anticuerpo primario. Por lo tanto, los controles de anticuerpos esenciales para los experimentos con PLA deben incluir la adición de solo uno de los dos anticuerpos primarios, pero ambas sondas de PLA (más y menos). Además, los controles sin anticuerpos añadidos se pueden utilizar para determinar la unión inespecífica de las sondas pla a la muestra. En general, esos controles técnicos deberían dar lugar a muy pocas señales de EPL. Si se observan varias señales, se debe reconsiderar la concentración del anticuerpo primario utilizado y su especificidad. Además, es útil incluir un control biológico positivo, si es posible. En el protocolo descrito anteriormente, esto podría ser la estimulación con un ligando BMP que se sabe que induce la fosforilación de los SMAD y, por lo tanto, la formación de complejos triméricos con SMAD4.
Para los experimentos con PLA, normalmente se recomienda utilizar células que sean 50-70% confluentes, ya que esto simplifica la penetración de los reactivos. Sin embargo, al realizar experimentos con CE, argumentaríamos estrictamente en contra de esto, excepto si la semiconfluencia es parte de la configuración experimental. In vivo Las CE forman monocapas con uniones estrechas de célula a célula, que son esenciales para la homeostasis y la mecanotransducción de la CE29. Por lo tanto, los experimentos con CE no confluentes podrían dar lugar a resultados falsos. Además, las células no confluentes son más propensas a desprenderse de las diapositivas del canal de flujo si se utilizan altos niveles de tensión cortante durante el experimento. Aconsejamos sembrar células (2-2.5 x 106 células / ml, consulte el paso de protocolo 1.2) dos o tres días antes del inicio experimental, ya que las monocapas ecgénicas necesitan tiempo para formar y desarrollar uniones maduras. Por lo tanto, no recomendaríamos sembrar un mayor número de células (>2,5 x 106 células/ml) en canales de flujo solo un día antes del experimento para lograr una monocapa confluente.
Aunque existen varios medios de montaje líquidos que contienen DAPI, vale la pena incluir un paso de tinción DAPI separado y montar las celdas con un medio de montaje líquido sin DAPI, al menos si se utilizan guías de flujo basadas en polímeros. Esto evita señales de fondo pesadas durante la adquisición de imágenes. Las imágenes deben adquirirse desde posiciones en el centro del canal en lugar de los bordes, ya que la tensión de corte no es homogénea en las paredes del canal. Recomendamos tomar al menos 5-10 imágenes por réplica biológica y condición de áreas aleatorias a lo largo de la región central. Normalmente se utilizan 3 o más réplicas biológicas para obtener relevancia estadística. Para el análisis de imágenes, aconsejamos utilizar la función de macro ImageJ/FIJI. En el protocolo anterior, mencionamos una macro ImageJ que es adecuada para contar eventos de PLA citosólicos y nucleares basados en la tinción DAPI. Los usuarios deben ser conscientes de que parámetros como el tamaño de partícula deben ajustarse en función del tamaño nuclear o de los puntos PLA más grandes / más pequeños. La macro guarda las imágenes PLA de umbral y las máscaras que deben compararse con las imágenes sin procesar para evaluar la especificidad de la detección de señales PLA.
En conclusión, el método presentado aquí permite un análisis espacial y cuantitativo rápido y eficiente de la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas. Permitirá a los científicos descifrar aún más el impacto de la formación de complejos SMAD en la aterogénesis y la enfermedad vascular en general. Además, se puede adaptar para investigar las consecuencias de la proximidad de diferentes proteínas en esas patologías vasculares.
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
FIJI | Image Analysis software | ||
Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
HUVECs | |||
ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
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