Method Article
כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.
שינוי גורם גדילה β (TGFβ)/חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מוסדר ומאוזן היטב במהלך הפיתוח וההומאוסטזיס של מערכת כלי הדם ולכן, הסרת הפיקוח במסלול איתות זה גורמת לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית וטרשת עורקים. תאי אנדותל (ECs), כמו השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם, חשופים כל הזמן ללחץ גיסת נוזלים (SS). דפוסים חריגים של SS נוזל הוכחו כדי לשפר את זהות TGFβ/BMP, אשר, יחד עם גירויים אחרים, לגרום טרוגנזה. ביחס לכך, atheroprone, למינאר נמוך SS נמצא כדי לשפר את זהות TGFβ / BMP בעוד SS atheroprotective, למינר גבוה, מפחית איתות זה. כדי לנתח ביעילות את ההפעלה של מסלולים אלה, עיצבנו זרימת עבודה כדי לחקור את היווצרות מתחמי גורם התמלול תחת SS למינאר נמוך ותנאי SS למינאר גבוהים באמצעות מערכת משאבה פנאומטית זמינה מסחרית ובוח קשירת קרבה (PLA).
איתות TGFβ/BMP פעיל דורש היווצרות מתחמי SMAD טרימרים המורכבים משני SMAD רגולטוריים (R-SMAD); SMAD2/3 ו- SMAD1/5/8 עבור איתות TGFβ ו- BMP, בהתאמה) עם מתווך נפוץ SMAD (SMAD משותף; SMAD4). באמצעות PLA מיקוד subunits שונים של קומפלקס SMAD טרימר, כלומר, או R-SMAD / co-SMAD או R-SMAD / R-SMAD / R-SMAD, היווצרות של מתחמי גורם שעתוק SMAD פעיל ניתן למדוד כמותית מרחבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
השימוש בשקופיות זרימה עם 6 ערוצים מקבילים קטנים, שניתן לחבר בסדרה, מאפשר לחקור את גורם התמלול היווצרות מורכבת והכלה של פקדים נחוצים.
זרימת העבודה המוסברת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות למחקרים המתמקדים בקרבה של SMADs לגורמי שעתוק אחרים או למתחמי גורם תמלול שאינם SMADs, בתנאי SS זורמים שונים. זרימת העבודה המוצגת כאן מציגה דרך מהירה ויעילה ללמוד את האיתות TGFβ/BMP המושרה ב- SS הנוזלי ב- ECs, הן כמותית והן מרחבית.
חלבונים של גורמי גדילה משתנים בטא (TGFβ) superfamily הם ציטוקינים pleiotropic עם מגוון רחב של חברים, כולל TGFβs, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), ו Activins1,2. כריכת ליגנד גורמת להיווצרות של אוליגומרים קולטנים המובילים לזרחן, ובכך, הפעלה של SMAD רגולטורי ציטוטולי (R-SMAD). בהתאם למשפחת המשנה של ליגנדים, R-SMADs שונים מופעלים1,2. בעוד TGFβs ו Activins בעיקר לגרום זרחן של SMAD2/3, BMPs לגרום SMAD1/5/8 זרחן. עם זאת, ישנן עדויות מצטברות כי BMPs ו- TGFβs/Activins מפעילים גם R-SMADs של תת-המשפחה האחרת בהתאמה, בתהליך המכונה 'איתות לרוחב'3,4,5,6,7,8 וכי ישנם מתחמי SMAD מעורבים המורכבים משניהם, SMAD1/5 ו- SMAD2/3, חברים3,9 . שני R-SMADs מופעלים לאחר מכן יוצרים מתחמים טרימרים עם המתווך המשותף SMAD4. מתחמי גורמי שעתוק אלה מסוגלים לאחר מכן להעביר את ההקצאה לגרעין ולווסת את שעתוק הגנים היעד. SMADs יכול לקיים אינטראקציה עם מגוון של מפעילי שיתוף תעתיק שונים ומדכאים משותפים, מה שמוביל לגיוון האפשרויות לווסת את הגנים היעד10. הסרת הפיקוח על איתות SMAD יש השלכות חמורות במגוון מחלות. בהתאם לכך, איתות TGFβ/BMP לא מאוזן עלול להוביל לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית, או טרשת עורקים3,11,12,13,14.
תאי אנדותל (ECs) יוצרים את השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם ולכן הם חשופים ללחץ גזוז (SS), כוח חיכוך המופעל על ידי הזרימה הצמיגית של הדם. מעניין, ECs המתגוררים בחלקים של vasculature, אשר חשופים לרמות גבוהות של מדים, למינאר SS, נשמרים במצב הומיאוסטטי ורגיע. לעומת זאת, ECs שחווים SS נמוך, לא אחיד, למשל, ב bifurcations או עקמומיות פחותה של קשת אב העורקים, הם שגשוג ולהפעיל מסלולים דלקתיים15. בתורו, אתרים של ECs מתפקד נוטים לפתח טרשת עורקים. באופן מעניין, מחשבים אלקטרוניים באזורים אלה של אתראופרון מציגים רמות גבוהות באופן חריג של SMAD2/3 ו- SMAD1/516,17,18. בהקשר זה, איתות TGFβ/BMP משופר נמצא כאירוע מוקדם בהתפתחות נגעים טרשת עורקים19 והפרעה לאיתות BMP נמצאה כמפחיתה באופן משמעותי דלקת כלי דם, היווצרות אתראומה והסתיידות נלווית20.
קרבה קשירת Assay (PLA) היא טכניקה ביוכימית לחקר אינטראקציות חלבון חלבון במקום 21,22. הוא מסתמך על הספציפיות של נוגדנים של מינים שונים שיכולים לקשור חלבונים ממוקדים של עניין, ומאפשר זיהוי ספציפי מאוד של אינטראקציות חלבון אנדוגני ברמה של תא אחד. כאן, נוגדנים ראשוניים צריכים להיקשר לאפיטופ היעד שלהם במרחק של פחות מ -40 ננומטר כדי לאפשר את הגילוי23. לכן, PLA מועיל מאוד על גישות אימונו-immunoprecipitation מסורתיות, שבו כמה מיליוני תאים נדרשים כדי לזהות אינטראקציות חלבון אנדוגני. ב- PLA, נוגדנים משניים ספציפיים למינים, המקושרים באופן קוולנטי לרסיסי DNA (המכונים בדיקות פלוס ומינוס), קושרים את הנוגדנים העיקריים ואם חלבוני העניין מתקשרים, בדיקות פלוס ומינוס מגיעות בסמיכות. הדנ"א נקשר בשלב הבא והגברת המעגל המתגלגל של הדנ"א המעגלי מתאפשרת. במהלך ההגברה, oligonucleotides משלימים שכותרתו פלואורסצנטרית נקשרים לדנ"א המסונתז, ומאפשרים לאינטראקציות חלבון אלה להיות חזותיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי שעתוק SMAD הפעילים בתנאי Atheroprotective ו atheroprone SS במבחנה באמצעות PLA. SS נוצר באמצעות מערכת משאבה פנאומטית ניתנת לתכנות המסוגלת ליצור זרימה חד-כיוונית למינארית של רמות מוגדרות ומאפשרת עלייה צעדים של קצבי הזרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין SMAD1/5 או SMAD2/3 עם SMAD4, כמו גם מתחמי R-SMAD מעורבים. ניתן להרחיב אותו בקלות כדי לנתח אינטראקציות של SMADs עם רגולטורים משותפים תמלול או כדי לתמלול גורמים מתחמים אחרים מלבד SMADs. איור 1 מציג את השלבים העיקריים של הפרוטוקול המוצג להלן.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המתואר. (A) תאים הנזרעים בשקופיות של 6 ערוצים חשופים ללחץ גניסיה עם מערכת משאבה פנאומטית. (B) תאים קבועים משמשים לניסוי PLA או לתנאי בקרה. (C) תמונות של ניסויי PLA נרכשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנותחות באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
1. תרבית התא וחשיפה ללחץ גזל
הערה: ECs וריד טבור אנושי (HUVECs) שימשו כדוגמה לחקר אינטראקציה המושרה SS של SMADs. ניתן להחיל את הפרוטוקול המתואר להלן על כל סוג תא רספונסיבי של SS.
2. קיבעון
3. חסימה ודגרת נוגדנים ראשונית
4. דגירה של גשושית PLA
הערה: עבור כל השלבים בסעיף 4.1-7.3, מאגרי הכביסה A ו- B מאוחסנים ב 4 °C (7 °F) ויש לחמם אותם ל- RT לפני השימוש.
5. קשירה
6. הגברה
7. הרכבה
8. רכישת תמונות
9. ניתוח וכימות תמונה באמצעות ImageJ/FIJI
השתמשנו בעבר PLA כדי לזהות אינטראקציות של חלבוני SMAD שונים3 וניתחנו שינויים המושרה מתח גיזה בזרחן SMAD28.
כאן, שתי השיטות שולבו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. HUVECs היו נתונים ללחץ גיסת של 1 גוון / cm2 ו 30 גוון / cm2 ונותחו עבור אינטראקציות של גורמי שעתוק SMAD. אנו מראים כי בהשוואה ללחץ הגיסה הגבוה (30 גוון/cm2), מתח הגיסה הנמוך (1 גוון/cm2) מוביל לעלייה משמעותית באינטראקציות SMAD1-SMAD2/3, מה שנקרא מתחמי SMAD מעורבים בשניהם, הציטוסול והגרעין של תאים מנותחים (איור 2A, פאנל תחתון). אירועי PLA נראים כנקודות נפרדות בשתי הדגימות, ואפשר להבחין בין אירועים ציטוטוסוליים לגרעין בהתייחס להכתמת DAPI (איור 2A, פאנל עליון). לעומת זאת, בקרות נוגדנים, שבהן רק אחד משני הנוגדנים העיקריים אך עדיין שתי בדיקות PLA דוגרו, הראו מספרים זניחים של אותות PLA (איור 2B). לכן, ניתן להסיק כי הניסוי היה מוצלח.
איור 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA המשווה ריכוזי נוגדנים שונים. (A) תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות וכימות של SMAD2/3-SMAD1-PLA ב- HUVECs חשופים ל- 24 שעות של רמות האס.אס המצוינות. יחס דילול נוגדנים: 1:100. (B) תמונות קונפוצליות של פקדי נוגדנים בודדים עבור PLA בתמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות A. (C) וכימות של SMAD2/3-SMAD1-PLA ב- HUVECs חשופים ל- 24 שעות של רמות SS שצוינו. יחס דילול נוגדנים: 1: 50. סרגלי קנה מידה עבור A-C: 20 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר בזום. דיין שווה צביעה/cm2. נוגדנים בשימוש היו ארנב נגד SMAD2/3 ועכבר אנטי SMAD1 (ראה טבלת חומרים). עבור כל תנאי 5 אזורים אקראיים לאורך מרכז ערוץ הזרימה שימשו לרכישת תמונה. N = 1 שכפול ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כדי להראות כיצד ריכוזים שונים של נוגדנים משנים את תוצאות PLA, אותו ניסוי בוצע עם 1:50 במקום דילול של 1:100 של נוגדנים. בתנאים אלה, כמות כפולה של נוגדנים גורמת לאותות PLA גבוהים פי ארבעה לתא (השווה איור 2A ואיור 2C). ההבדל באותות בין 1 גוון/cm2 ל-30 גוון/cm2 פוחת כאשר משתמשים בריכוז נוגדנים גבוה יותר ומשמעות סטטיסטית הולכת לאיבוד עבור האירועים הכוללים והציטוזוליים PLA (איור 2A, פאנל תחתון; איור 2C, חלונית תחתונה). ייתכן שהסיבה לכך היא התמזגות האות ובעיות של הבחנה בין אירועי PLA. אם הצטברות כזו של אותות מתרחשת, ריכוזי נוגדנים יש להקטין.
יתר על כן, הראינו כי מאגרים מתוצרת עצמית לחסימה ודילול נוגדנים יכולים לשמש כחלופה למאגרים מסחריים הכלולים בערכות פלטה. אירועי PLA לתא הושוו עבור SMAD1-SMAD2/3 (איור 3A לעומת איור 3D), SMAD2/3-SMAD4 (איור 3B לעומת איור 3E) ו-pSMAD1/5-SMAD4 (איור 3C לעומת איור 3F) מתחמים מתחת ל-1 גוון/cm2 ו-30 גוון/cm2 באמצעות פתרונות מסחריים (איור 3A-C) או פתרונות מבוססי BSA/PBS מתוצרת עצמית (איור 3D-F ). כימותים לפתרונות דילול/ חסימה מתוצרת עצמית מראים את אותה מגמה של אותות PLA באזורים ציטוטוסוליים וגרעיניים. עם זאת, המספר הכולל של אירועי PLA לכל תא גבוה יותר בעת שימוש בפתרונות מסחריים (איור 3A-C, חלוניות נמוכות יותר לעומת איור 3D-F, חלוניות נמוכות יותר).
איור 3: ניסוי PLA המשווה מאגרי נוגדנים מסחריים מתוצרת עצמית. תמונות קונפוקליות (החלק העליון של כל פאנל) וכימות (חלק תחתון של כל פאנל) של PLAs SMAD-SMAD שונים ב- HUVECs חשופים ל-24 שעות של רמות לחץ הטיה שצוינו. (א-ג) מאגרים מסחריים (ראה טבלת חומרים). (D-F) מאגרים מתוצרת עצמית (3% BSA ב- PBS לחסימה, 1 % BSA ב- PBS לדילול נוגדנים). כל הנוגדנים העיקריים היו מדוללים 1: 100. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר (10 מיקרומטר להגדלה). המשמעות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן T דו-צדדי. ns - לא משמעותי, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. ערכים מתוארים כממוצע + SEM. Dyne שווה צביעה / cm2. נוגדנים בשימוש היו ארנב נגד SMAD2/3, עכבר אנטי SMAD1, ארנב אנטי phospho SMAD1/5 ועכבר אנטי SMAD4 (ראה טבלת חומרים). עבור כל תנאי 5 אזורים אקראיים לאורך מרכז ערוץ הזרימה שימשו לרכישת תמונה. N = 1 שכפול ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כללנו גם דוגמה לניסוי PLA כושל. כאן, שילוב של נוגדני SMAD2/3-SMAD4 שימש שבו נוגדן SMAD4 לא היה מתאים לביצוע ניסויים אימונופלואורסצנטיים. בהשוואה לבקרות נוגדנים בודדות, לא נצפתה עלייה בנקודות בדגימות 1 דיין/cm2 או 30 צביעה/cm2 (איור 4A לעומת איור 4B). כמו היווצרות של מתחמי SMAD2/3-SMAD4 נגרמת על ידי מתח גיזה (ראה איור 3B,E), ניתן להסיק כי ניסוי PLA זה לא הצליח. זה מדגיש את החשיבות של בחירת שילובי נוגדנים נכונים כדי לזהות אירועי PLA, כמו אוריינטציה ומרחק של נוגדנים מאוגדים עשוי להיות חיוני עבור חישול מוצלח של בדיקות אוליגונוקלאוטיד.
איור 4: דוגמה לניסוי PLA שנכשל. תמונות קונפוקליות, סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר בהגדלה. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) פקדי נוגדנים בודדים. נוגדנים בשימוש היו עכבר נגד SMAD2/3 וארנב אנטי SMAD4 (ראה טבלה של חומרים). דיין שווה צביעה/cm2. עבור כל תנאי 5 אזורים אקראיים לאורך מרכז ערוץ הזרימה שימשו לרכישת תמונה. N = 1 שכפול ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הפרוטוקול מבוסס PLA המתואר כאן מציע דרך יעילה לקבוע קרבה של שני חלבונים (למשל, האינטראקציה הישירה שלהם) ב- ECs החשופים ללחץ גיסת עם רזולוציה כמותית ומרחבית. באמצעות שקופיות זרימה עם ערוצים מקבילים מרובים, ניתן לבחון מספר אינטראקציות חלבון שונות בו זמנית בתאים בתנאים מכניים זהים. לעומת זאת, מערכות תא זרימה בהתאמה אישית עושות לעתים קרובות שימוש בערוץ יחיד הבנוי סביב כיסוי זכוכית, מה שיאפשר ניסוי PLA יחיד בלבד ללא הפקדים הדרושים לכל שקופית ומשאבה. למרות פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של אינטראקציות SMAD, זה יכול להיות מותאם כדי לזהות כל אינטראקציות חלבון אחרות. עם זאת, ניתוח התוצאות חייב להיעשות בזהירות כמו שני חלבונים עשויים גם להתגורר בסמיכות מבלי ליצור קומפלקסים. אם יש להצהרות ברורות על אינטראקציות של חלבונים, ניסויי PLA צריכים להיות משלימים עם שיטות נוספות כגון אימונופרנציות משותפות. בנוסף, PLA לא יכול לשמש כדי לזהות את האינטראקציה חלבון חלבון בתאים חיים מאז דגימות צריך להיות קבוע עבור איגוד נוגדנים הבאים צעדי הגברה DNA.
לגילוי מוצלח של אינטראקציות חלבון על ידי PLA, הצעד הקריטי ביותר הוא לבחור שילוב של נוגדנים ראשוניים הממלאים מספר קריטריונים: (1) הנוגדנים המזהים את שותפי החלבון הבודדים חייבים להיווצר במינים שונים (למשל, עכבר או ארנב) מכיוון שהנוגדנים המשניים הם ספציפיים למינים; באופן אידיאלי, נוגדנים כבר נבדקו בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית; (2) המרחק בין נוגדנים הקשורים לאפיטופ צריך להיות <40 nm23; (3) מכיוון שהזיקה לכריכת נוגדנים-אפיטופ עשויה להיות שונה, יש להתאים את הריכוז הסופי של נוגדנים משומשים לכל הגדרה ניסיונית, כפי שמוצג כאן (איור 2A, פאנל תחתון לעומת איור 2C, פאנל תחתון). לכן, אם מעט מאוד אירועי PLA אבל ספציפי מזוהים, זה עשוי להיות שווה להגדיל את כמות הנוגדן בשימוש. עם זאת, יש לצייץ זאת בקפידה כדי למנוע רוויית יתר ואירועים מחייבים לא מוגדרים. כמו כן, ריכוז הנוגדנים המשמש בדגימות בקרה חייב להתאים לריכוז המשמש בדגימות PLA.
באשר לכל מדיקה ביוכימית אחרת, בקרות מתאימות חיוניות ב- PLA. כריכה לא סימויה של הנוגדנים המשומשים עשויה, למשל, להוביל לאותות PLA שמקורם בנוגדן ראשוני אחד בלבד. לכן, בקרות נוגדנים חיוניות לניסויי PLA צריכות לכלול תוספת של רק אחד משני הנוגדנים העיקריים אך הן בדיקות PLA (פלוס ומינוס). יתר על כן, פקדים ללא נוגדנים נוספו ניתן להשתמש כדי לקבוע כריכה לא פתירה של בדיקות PLA לדגימה. באופן כללי, פקדים טכניים אלה צריכים להניב לא מעט מאוד אותות PLA. אם נצפים מספר אותות, ריכוז הנוגדן העיקרי המשמש, ויש לשקול מחדש את הספציפיות שלו. בנוסף, כדאי לכלול שליטה ביולוגית חיובית, במידת האפשר. בפרוטוקול שתואר לעיל, זה יכול להיות גירוי עם ליגנד BMP כי ידוע לגרום זרחן של SMADs, ולכן, היווצרות קומפלקס טרימרי עם SMAD4.
עבור ניסויי PLA, מומלץ בדרך כלל להשתמש בתאים כי הם 50-70% מפגש, שכן זה מפשט את החדירה של ריאגנטים. עם זאת, בעת ביצוע ניסויים עם ECs, היינו טוענים בקפדנות נגד זה, אלא אם מפגש למחצה הוא חלק מההקמה הניסיונית. In vivo מחשבים אלקטרוניים יוצרים מונוניירס עם צמתים הדוקים בין תא לתא, החיוניים להומיוסטזיס של EC ולתמרת mechano-transduction29. לכן, ניסויים על ECs שאינם במפגש יכול להוליד תוצאות כוזבות. יתר על כן, תאים שאינם משוחחים נוטים יותר להתנתק משקופיות ערוץ הזרימה אם משתמשים ברמות גבוהות של לחץ גיסת במהלך הניסוי. אנו ממליצים לזרוע תאים (2-2.5 x 106 תאים / מ"ל, לראות פרוטוקול שלב 1.2) יומיים עד שלושה ימים לפני התחלה ניסיונית כמו monolayers EC צריך זמן כדי ליצור ולפתח צמתים בוגרים. לכן, לא היינו ממליצים לזרוע מספר גבוה יותר של תאים (>2.5 x 106 תאים / מ"ל) בערוצי זרימה רק יום אחד לפני הניסוי כדי להשיג monolayer confluent.
למרות שקיימת מדיית הרכבה נוזלית שונים המכילה DAPI, כדאי לכלול שלב הכתמה נפרד של DAPI ולהרכיב את התאים עם מדיום הרכבה נוזלי ללא DAPI, לפחות אם נעשה שימוש בשקופיות זרימה מבוססות פולימר. פעולה זו מונעת אותות רקע כבדים במהלך רכישת תמונה. תמונות יש לרכוש מעמדות במרכז הערוץ ולא את הקצוות מאז מתח גיסת הוא inhomogeneous בקירות הערוץ. אנו ממליצים לצלם לפחות 5-10 תמונות לכל שכפול ביולוגי ומצב של אזורים אקראיים לאורך אזור המרכז. 3 או יותר שכפולים ביולוגיים משמשים בדרך כלל כדי להשיג רלוונטיות סטטיסטית. לניתוח תמונה אנו ממליצים להשתמש בפונקציית המאקרו ImageJ/FIJI. בפרוטוקול לעיל, הזכרנו מאקרו ImageJ שמתאים לספור אירועי PLA ציטוטוסוליים גרעיים המבוססים על כתמי DAPI. משתמשים צריכים להיות מודעים לכך פרמטרים כמו גודל החלקיקים צריך להיות מותאם בהתאם לגודל גרעיני או נקודות PLA גדולות / קטנות יותר. המאקרו שומר את הסף תמונות ומסיכות PLA שיש להשוות לתמונות גולמיות כדי להעריך את הספציפיות של זיהוי אותות PLA.
לסיכום, השיטה המוצגת כאן מאפשרת ניתוח מרחבי וכמותי מהיר ויעיל של היווצרות מורכבת של גורם שעתוק בתנאי אס.אס אתרופוניים ואתרפיים. זה יאפשר למדענים לפענח עוד יותר את ההשפעה של היווצרות מורכבת SMAD אצל ארוגנזה ומחלות כלי דם בכלל. זה יכול, יתר על כן, להיות מותאם כדי לחקור את ההשלכות של קרבה של חלבונים שונים אלה פתולוגיות כלי דם.
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
אנו מודים לד"ר מריה רייכנבך ולט"ר כריסטיאן הייפן על תמיכתם במערכת הזרימה ואלינור פוקס ויוניון שיאו על שקראו את כתב היד בביקורתיות. P-L.M. מומן על ידי בית הספר הבינלאומי מקס פלאנק מחקר IMPRS-ביולוגיה וחישוב (IMPRS-BAC). PK קיבלה מימון על ידי DFG-SFB1444. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
FIJI | Image Analysis software | ||
Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
HUVECs | |||
ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved